中藥材中有機氯類農藥殘留量的測定方法
【專利摘要】本發明提供了一種中藥材中有機氯類農藥殘留量的測定方法，建立GPC-SPE-GC法同時檢測中藥材中17種有機氯農藥殘留量，本發明包括如下步驟：提取、GPC初步凈化、固相萃取二元凈化：采用氨丙基柱NH2SPE：200mg/3mL和石墨化碳黑柱GCB?SPE：250mg/3mL聯用，依次凈化；用體積比為8∶2的正己烷∶丙酮溶液洗脫。本發明方法相對于傳統的濃硫酸凈化法具有較高的靈敏度，安全性，為我國中藥材安全生產，出口及食品藥品的安全監督提供可靠的檢測手段，值得推廣應用。
【專利說明】中藥材中有機氯類農藥殘留量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于中藥材測定【技術領域】，涉及中藥材中有機氯類農藥殘留量的測定方法，更具體的說，是涉及利用GPC-SPE-GC方法測定中藥材中17種有機氯類農藥的殘留量。
【背景技術】
[0002]有機氯類農藥是一種組成成分含有有機氯元素的有機化合物，對防治植物病蟲害起到重要作用，是農業上迄今為止生產量最大、使用面積最廣的一類有機合成農藥。其具有蒸氣壓低、揮發性小、脂溶性強以及結構穩定，不易被生物體內酶降解等系列特性，長期使用會造成環境污染、人和動物的蓄積毒性。有機氯農藥干擾人體內分泌系統，直接通過細胞介導而發揮其致癌性。2001年5月127個國家(包括中國)和地區的代表在瑞典斯德哥爾摩簽署了 “控制持久性有機污染物”的國際公約，嚴格禁止或限制使用12種持久性有機污染物，其中有機氯農藥就占了 9種:DDT、艾氏劑、氯丹、狄氏劑、異狄氏劑、七氯、滅蟻靈、毒殺芬、六氯苯。
[0003]中藥是我國寶貴的文化遺產，但由于我國中藥材種植長期處于小農經濟狀態，中藥材生產基地建設零星分散，在中藥材的種植過程中農藥的濫用情況時有發生，導致中藥材農藥殘留狀況頗為嚴重。上海中醫學院陳君等對全國300多種中藥材的農藥殘留量進行調查，發現全部樣品存在有機氯類農藥的殘留情況。2009至2011年，世界綠色和平組織對中國各大超市抽查，發現含有不同程度的農藥殘留，其中就包括有機氯農藥。特別是2013年，世界綠色和平組織對我國的中藥產品進行抽樣檢測，發現菊花、枸杞、金銀花等七種中藥產品的36個樣品，35個測出農藥殘留，32個檢測出3種以上農藥殘留。目前，世界上許多國家都制定了有機氯農藥的最大允許殘留限量，一般其限量范圍都在0.05?0.3mg/kg之間，個別的為lmg/kg或3mg/kg。
[0004]近年來，中藥材中有機氯類農藥殘留的檢測方法也在不斷發展。文獻報道有用正己烷進行提取，濃硫酸磺化對中藥材(浙貝、白芍、白術、元胡、玄參)中的有機氯類農藥進行多殘留分析；也有用GC-NIC-MS進行分析的方法，前處理同樣是用濃硫酸磺化法；這些方法不適合種類多樣的中藥材進行批處理,成本相對較高。我國現有中藥材檢測有機氯類殘留量檢測方法標準SN 0181-1992《出口中藥材中六六六，滴滴涕殘留量檢驗方法》和DB12/183-2003《人參中六六六、滴滴涕、五氯硝基苯最高殘留限量和測定方法》，及2010年版中國藥典方法。目前，這些文獻或標準方法前處理均是以濃硫酸磺化為主，且一次同時檢測有機氯類農藥殘留種類少，主要是檢測六六六、滴滴涕和五氯硝基苯，對殘留檢測操作人員存在一定的安全風險，效率低；此外，以環戊二烯為原料農藥，如氯丹、七氯、硫丹等，一般不能用三氧化硫或其水合物進行磺化，會產生一定的損失；脂肪族化合物或是不起作用，或是使脂肪族化合物發生氧化分解，從而生成復雜的混合物。因此，建立高效、安全、快速的中藥材中有機氯類農藥多殘留分析方法是非常重要的。本方法可以一次同時檢測17種有機氯類農藥，前處理方法安全、環保、快速、高效，可為我國中藥材安全生產、出口創匯及食品藥品的安全監督提供可靠的檢測手段。
【發明內容】
[0005]為克服上述技術缺陷，本發明提供了一種中藥材中有機氯類農藥殘留量的測定方法，建立GPC-SPE-GC法同時檢測中藥材中17種有機氯農藥殘留量，該方法相對于傳統的硫酸凈化法具有較高的靈敏度和安全性。
[0006]本發明的方法采用如下技術方案，包括如下步驟:
[0007](I)提取:對中藥材前處理后，用體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮提取，得到提取液；
[0008](2)初步凈化:對所述步驟(I)中得到的提取液采用凝膠滲透色譜GPC凈化，得到濃縮液；
[0009](3)固相萃取二元凈化:采用氨丙基柱NH2SPE:200mg/3mL和石墨化碳黑柱GCBSPE:250mg/3mL聯用，依次凈化；用體積比為8:2的正己烷:丙酮溶液洗脫；
[0010]所述步驟(I)中對中藥材前處理為:取中藥材粉末加入去離子水浸泡。
[0011]所述步驟(I)中用體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮提取的操作如下:將處理過的中藥材加入體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮15mL、8g氯化鈉，經渦旋器震蕩均勻后置于水平往復式搖床提取1min,再于臺式高速冷凍離心機4500r/min離心5min,吸取上清液于另一 50mL離心管中，再加入1mL體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮重復提取，合并上清液。
[0012]所述步驟(2)中凝膠滲透色譜GPC凈化操作如下:取步驟(I)中得到的1mL所述提取液用氮吹儀濃縮至約0.5mL，用體積比為1:1的環己烷:乙酸乙酯溶液定容至10mL，上GPC進行凈化，收集680-1080S的流出液，濃縮，用體積比為8:2的正己烷:丙酮溶液定容至2mL。
[0013]所述步驟(3)中采用氨丙基柱NH2SPE:200mg/3mL凈化的操作如下:所述氨丙基柱中加入Ig無水硫酸鈉，用體積比為8:2的正己烷:丙酮4mL分兩次活化，倒去活化液，將步驟⑵中得到的所述濃縮液過柱，再用體積比為8:2的正己烷:丙酮6mL分3次洗脫，合并洗脫液，吹氮濃縮至少于lmL，得到濃縮液。
[0014]所述步驟(3)中采用GCB SPE:250mg/3mL柱凈化的操作如下:所述石墨化碳黑柱用體積比為8:2的正己烷:丙酮4mL分兩次活化，倒去活化液，將所述氨丙基柱凈化得到的濃縮液過柱，并用體積比為8:2的正己烷:丙酮6mL分3次洗脫，合并洗脫液，吹氮濃縮至少
0.5mL時，加入ImL正己烷進行溶劑交換，繼續吹氮濃縮至少于0.5mL。
[0015]所述步驟(3)中正己烷:丙酮溶液的洗脫體積為6mL。
[0016]所述有機氯類農藥包括α -666> Y-666,七氯、艾氏劑、β -666、δ -666、α -硫丹、反-氯丹、順-氯丹、P，Ρ-DDE、狄氏劑、異狄氏劑、O，P-DDT、P，ρ-DDT、β -硫丹、p，p-DDD
和硫丹硫酸酯中的至少一種。
[0017]本發明方法相對于傳統的濃硫酸凈化法具有較高的靈敏度，安全性，為我國中藥材安全生產，出口及食品藥品的安全監督提供可靠的檢測手段，值得推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為17種有機氯農藥化合物用GPC分段收集累積回收率曲線圖，其中圖1A是α-666、Y-666、七氯標準品用GPC分段收集累積回收率曲線圖；圖1B是艾氏劑、β-666、δ-666、α-硫丹標準品用GPC分段收集累積回收率曲線圖；圖1C是反式氯丹、順式氯丹、P’ p-DDE、狄氏劑、異狄氏劑標準品用GPC分段收集累積回收率曲線圖；圖1D是o’ p_DDT、P’ p-DDT, β-硫丹、p’ p-DDD和硫丹硫酸酯標準品用GPC分段收集累積回收率曲線圖；
[0019]圖2為七氯和硫丹標準品洗脫實驗結果圖，其中，圖2Α為七氯在GCB、NH2,Florisil、Al203SPE上的洗脫曲線，圖2B為硫丹在GCB、NH2、Florisil、Al203SPE上的洗脫曲線.
[0020]圖3為黃芪空白樣品通過3種SPE小柱(NH2SPE、GCB SPE,Florisil SPE)兩兩組合凈化后的色譜圖，其中圖3A為GCB SPE和Florisil SPE聯用凈化后的色譜圖；圖3B為NH2SPE和Florisil SPE聯用凈化后的色譜圖；圖3(:為GCB SPE和NH2SPE凈化后的色譜圖；
[0021]圖4為17種有機氯農藥標準品在NH2SPE和GCB SPE聯用后的淋洗曲線；圖4A為α-666、Y-666、七氯、艾氏劑的淋洗曲線，圖4Β為β-666、δ-666、α-硫丹、反-氯丹的淋洗曲線，圖4C為順-氯丹、p，p-DDE、狄氏劑、異狄氏劑的淋洗曲線，圖4D為0，p-DDT、ρ,ρ-DDT、β-硫丹、p, p-DDD、硫丹硫酸酯的淋洗曲線；
[0022]圖5為黃芪空白、17種有機氯農藥的標準(10 μ g/L，B)和黃芪添加標準(10 μ g/L，C)色譜圖；其中，圖5A為黃芪空白樣品的色譜圖，圖5B為17種有機氯農藥的標準(10 μ g/L)的色譜圖，圖5C為黃芪空白樣品添加標準(10 μ g/L)的色譜圖(圖中編號對應表5化合物)。
【具體實施方式】
[0023]為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0024]儀器和試劑:
[0025]HP6890氣相色譜儀:美國Agilent公司；
[0026]凝膠滲透色譜儀:美國J2Scientific公司；
[0027]電子分析天平:BT124，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；
[0028]速冷凍離心機:3_16PK,美國Sigma公司；
[0029]吹氮濃縮儀:Turbovap LV,美國Zymark公司；
[0030]氨丙基柱:NH2SPE，200mg/3mL,北京振翔工貿有限公司；
[0031]石墨化碳黑柱:GCB SPE,250mg/3mL,上海安譜科學儀器有限公司；
[0032]超純水儀:Mill1-Q，美國Millipore 公司。
[0033]標準品:
[0034]α -666 (98.0 % ), β -666 (98.5 % ), Y -666 (98.6 % ), α -硫丹(97.0 % ),β_硫丹(99.5 % )、硫丹硫酸酯(99.5 % )、順-氯丹(99.6 % )、反-氯丹(98.0 % )、七氯(99.0 % )、艾氏劑(98.0 % )、狄氏劑(99.0 % )、異狄氏劑(99.0 % )均購自德國Dr.Ehrenstorger 公司；
[0035]δ -666 (100 μ g/mL) > p_DDE(100yg/mL)、o，p-DDT (100 μ g/mL) >p’ p-DDD (100 μ g/mL)、p’ p-DDT (100 μ g/mL)均購自農業部環境保護科研檢測所；
[0036]丙酮、正己烷、乙酸乙酯、環己烷、氯化鈉、無水硫酸鈉:AR，廣州化學試劑廠；
[0037]正己烷:HPLC，美國Fisher Scientific 公司；
[0038]實驗用水為超純水。
[0039]樣品來源:以下實施例所用藥材樣品均購自本地藥房。
[0040]標準工作液的配制:
[0041]分別準確稱取0.0lg的α -666、β -666、Y -666、α -硫丹、β -硫丹、硫丹硫酸酯、順-氯丹、反-氯丹、七氯、艾氏劑、狄氏劑及異狄氏劑于1mL棕色容量瓶，用HPLC正己烷配成lmg/mL標準貯備液。根據標準曲線和實驗要求用HPLC正己烷稀釋成相應質量濃度的標準工作液于棕色容量瓶中，4°C保存，有效期2個月。
[0042]標準曲線制作:
[0043]移取適合濃度的混合標準一級貯備液，用正己烷稀釋成六個濃度水平的有機氯(α-666、β -666、y-666, δ -666、p’ p_DDE、o’ p_DDT、p’ p_DDD、p’ p-DDT、a -硫丹、β -硫丹、硫丹硫酸酯、順-氯丹、反-氯丹、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、七氯)混合標準工作溶液，質量濃度分別為 10 μ g/mL>20 μ g/mL>30 μ g/mL>40 μ g/mL>50 μ g/mL、100 μ g/mL。
[0044]氣相色譜(GC)條件
[0045]毛細管色譜柱:AgilentHP_170130mX0.32mmX0.25 μ m ;
[0046]載氣:5.0mL/min 持續 7min,再以 2°C /min 的速度降至 3.0mL/min,保持 5min ；
[0047]柱溫:80°C保持lmin,以 40°C /min 的速度升至 180°C,保持 3.0min,以 30°C /min的速度升至250°C，保持10.0min ；
[0048]進樣口溫度:250°C;
[0049]檢測器溫度:25(TC ；
[0050]載氣=N2(純度 >99.99% )；
[0051]進樣量:1.0μ L。
[0052]凝膠滲透色譜(GPC)條件
[0053]凝膠色譜凈化柱:300mmX25mm(i.d)；
[0054]填料:B1_Beads,S-X3, 38 μ m ~ 75 μ m ；
[0055]濃縮溫度:45°C ;
[0056]流動相:環己烷-乙酸乙酯(50+50，體積比)；
[0057]定容試劑:8:2的正己烷:丙酮溶液；
[0058]流速:5mL/min；
[0059]進樣量:5.0mL。
[0060]實施例1:提取溶劑的選擇
[0061]取中藥材粉末于50mL離心管中，添加一定濃度的標準品溶液，加入去離子水浸泡20min,加入提取液提取。
[0062]本實施例根據有機氯農藥的特性，首先進行了一元溶劑萃取實驗，分別用25mL石油醚、正己烷、乙酸乙酯及丙酮進行提取。實驗結果見表1，表I為一元溶劑萃取17種有機氯類農藥回收率結果。
[0063]表I
[0064]
【權利要求】
1.中藥材中有機氯類農藥殘留量的測定方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提取:對所述中藥材進行前處理后，用體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮提取，得到提取液； (2)初步凈化:對所述步驟⑴中得到的提取液采用凝膠滲透色譜GPC凈化，得到濃縮液； (3)固相萃取二元凈化:采用氨丙基柱NH2SPE:200mg/3mL和石墨化碳黑柱GCB SPE:250mg/3mL聯用，依次凈化；用體積比為8:2的正己烷:丙酮溶液洗脫。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(I)中對中藥材進行前處理為:取所述中藥材粉末加入去離子水浸泡。
3.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(I)中用體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮提取的操作如下: 在所述處理過的中藥材中加入體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮，經渦旋器震蕩均勻后，置于水平往復式搖床提取1min,再于臺式高速冷凍離心機4500r/min離心5min,吸取上清液于另一離心管中，再加入體積比為1:1的乙酸乙酯:丙酮重復提取，合并上清液，混勻。
4.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(2)中凝膠滲透色譜GPC凈化操作如下: 取所述步驟⑴中得到的提取液1mL用氮吹儀濃縮至少于0.5mL，用體積比為1:1的環己烷:乙酸乙酯溶液定容至10mL，上GPC進行凈化，收集600-1080S時流出液，濃縮，用體積比為8:2的正己烷:丙酮溶液定容至2mL。
5.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用氨丙基柱NH2SPE:200mg/3mL凈化的操作如下: 所述氨丙基柱中加入Ig無水硫酸鈉，用體積比為8:2的正己烷:丙酮分兩次活化，倒去活化液，將所述步驟(2)中得到的濃縮液過柱，再用體積比為8:2的正己烷:丙酮分次洗脫，合并洗脫液，吹氮濃縮至少于lmL，得到濃縮液。
6.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用石墨化碳黑柱GCB SPE:250mg/3mL柱凈化的操作如下: 所述石墨化碳黑柱用體積比為8:2的正己烷:丙酮分次活化，倒去活化液，將所述氨丙基柱凈化得到的濃縮液過柱，并用體積比為8:2的正己烷:丙酮分次洗脫，合并洗脫液，吹氮濃縮至少0.5mL時，加入正己烷進行溶劑交換，繼續吹氮濃縮至少于0.5mL。
7.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(3)中正己烷:丙酮溶液的洗脫體積為6mL。
8.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述有機氯類農藥包括α-666、Y-666、七氯、艾氏劑、β-666、δ-666、α -硫丹、反-氯丹、順-氯丹、ρ’ ρ-DDE、狄氏劑、異狄氏劑、o’ p-DDT、p’ p-DDT, β-硫丹、p’ p-DDD和硫丹硫酸酯中的至少一種。
【文檔編號】G01N30/08GK104181244SQ201410409334
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】謝建軍, 何曼莉, 陳捷, 陳文銳 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心