一種改進的測定氨基酸含量的方法
【專利摘要】本發明提出了一種改進的測定氨基酸含量的方法，首先對試樣進行處理，試樣與鹽酸在安瓿瓶中混合后消化，消化冷卻后加入乙醇消泡，加水稀釋后過濾待用；用檸檬樹鈉將標樣稀釋25倍后待用，配置流動相A、流動相B和流動相C，然后配置反應液A和反應液B，再在高效液相色譜儀上對試樣和標樣分別測試分析，根據出峰時間可以鑒定樣品中氨基酸的種類，將樣品峰面積與標樣對比，計算樣品中各種氨基酸含量。本發明方法加入乙醇既可消泡，因此不會影響定容刻度的判斷，又不會結果對結果產生影響，本發明方法步驟簡單，易于操作。
【專利說明】一種改進的測定氨基酸含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種氨基酸含量測定方法，特別是指一種改進的測定氨基酸含量的方法。
【背景技術】
[0002]氨基酸在醫學上具有防病治病的作用，也可作為營養型化妝品的有效成分合成藥物、表面活性劑及其他工業產品等原料。因此，氨基酸分析是工業、農業生產及生命科學研究中最重要的技術之一。
[0003]用鹽酸水解飼料中的蛋白質使其成為游離氨基酸進而采用高效液相色譜柱后衍生測定氨基酸的方法分析其組成。傳統方法在樣品前處理時加鹽酸溶解，容易產生泡沫，定容時會影響判定終點。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明提出一種改進的測定氨基酸含量的方法，該方法可以消除泡沫，不會對結果產生影響，定容時不會影響判定終點。
[0005]為解決上述技術問題，本發明的技術采用以下技術方案:
一種改進的測定氨基酸含量的方法，包括以下步驟:
(1)準確稱取試樣0.1OOOg于1ml安瓿瓶中，然后向瓿瓶中準確加1+1的鹽酸5ml，將安瓶瓶封口，冷卻后，用膠布包好安瓶瓶，防止在恒溫消化時安瓶瓶破裂，置于恒溫干燥箱中消化；
(2)消化完成后取出安瓿瓶冷卻至室溫，切開安瓿瓶，過濾消化液，立即準確移取ImL濾液于50mL容量瓶中，此時容量瓶內很多泡沫，加2-3滴乙醇消泡，然后加水稀釋至刻度；
(3)稀釋液通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾，得到的濾液待用；濾液可在4°C條件下存放4小時；
(4)標樣的稀釋處理
用ρΗ2.20的0.07mol/L檸檬酸鈉稀釋2.5 μ mol/mL的標樣25倍，得濃度為0.1 μ mol/mL的標樣待用，所述稀釋標樣可在4°C條件下保存I個月；
(5)配制流動相
流動相A液:稱取58.8g檸檬酸鈉，溶解于2.5L水中，加乙醇210mL，加高氯酸50mL，加水稀釋至3L，將該稀釋液用60%高氯酸或4mol/L氫氧化鈉，準確調節pH值至3.20,并通過0.45mm孔徑的濾膜過濾；
流動相B液:稱取檸檬酸鈉58.8g和硼酸12.4g溶解于800mL水中，加4mol/L氫氧化鈉溶液30mL，加水稀釋至1L，將該稀釋液用60%高氯酸或4mol/L氫氧化鈉溶液調節其pH值為10.00并通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；
流動相C液:稱取氫氧化鈉4g，加水稀釋至500mL，并通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；以上三種流動相不用時均應在4°C環境中存放； (6)反應液的配制
硼酸-碳酸鈉緩沖溶液:稱取122.1g無水碳酸鈉、56.4g硫酸鉀和40.7g硼酸加水至
3L ；
A反應液:用量筒量取500mL硼酸-碳酸鈉緩沖溶液倒入試劑瓶中,加0.2mL氯酸鈉溶液，混合均勻；
B反應液:稱取鄰苯二甲醛400mg，加乙醇7mL、2-巰基乙醇lmL、10%的十二烷基聚乙二醇醚2mL，用硼酸-碳酸鈉緩沖溶液定容至500ml ;以上A、B反應液可在4°C條件下保存7天；
(7)上機分析
用微量注射器注入10 μ L試樣及標樣于高效液相色譜儀上進入分析，得色譜圖；根據出峰時間鑒定樣品中氨基酸的種類，將樣品峰面積與標樣對比，計算樣品中各種氨基酸含量。
[0006]進一步地，所述步驟(I)中于消化條件為110°C恒溫干燥箱中消化12小時。
[0007]進一步地，所述步驟(4)中標樣為17種氨基酸2.5Mmol/L混標溶液。
[0008]進一步地，所述17種氨基酸分別為:天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸
1+1的鹽酸溶液，即I體積的鹽酸+1體積的水混合得到的溶液。
[0009]本發明與現有技術相比具有的有益效果為:本發明方法加入乙醇既可消泡，因此不會影響定容刻度的判斷，又不會結果對結果產生影響，本發明方法步驟簡單，易于操作。
【具體實施方式】
[0010]為讓本領域的技術人員更加清晰直觀的了解本發明，下面將對本發明作進一步的說明。
[0011]一種改進的測定氨基酸含量的方法，包括以下步驟:
(1)準確稱取試樣0.1OOOg于1ml安瓿瓶中，然后向瓿瓶中準確加1+1的鹽酸5ml，將安瓿瓶封口，冷卻后，用膠布包好安瓿瓶，防止在恒溫消化時安瓿瓶破裂，置于110°C恒溫干燥箱中消化12小時；
(2)取出安瓿瓶冷卻至室溫，切開安瓿瓶，過濾消化液，立即準確移取ImL濾液于50mL容量瓶中，此時容量瓶內很多泡沫，加2-3滴乙醇消泡，然后加水稀釋至刻度；
(3)稀釋液通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾，得到的濾液待用；濾液可在4°C條件下存放4小時；
(4)標樣的稀釋處理
用ρΗ2.20的0.07mol/L檸檬酸鈉稀釋2.5 μ mol/mL的標樣(17種氨基酸2.5Mmol/L混標溶液(天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸))25倍，得濃度為
0.1 μ mol/mL的標樣待用，所述稀釋標樣可在4°C條件下保存I個月；
(5)配制流動相
流動相A液:稱取58.8g檸檬酸鈉，溶解于2.5L水中，加乙醇210mL，加高氯酸50mL，加水稀釋至3L，將該稀釋液用60%高氯酸或4mol/L氫氧化鈉，準確調節pH值至3.20,并通過0.45mm孔徑的濾膜過濾；
流動相B液:稱取檸檬酸鈉58.8g和硼酸12.4g溶解于800mL水中，加4mol/L氫氧化鈉溶液30mL，加水稀釋至1L，將該稀釋液用60%高氯酸或4mol/L氫氧化鈉溶液調節其pH值為10.00并通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；
流動相C液:稱取氫氧化鈉4g，加水稀釋至500mL，并通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；以上三種流動相不用時均應在4°C環境中存放；
(6)反應液的配制
硼酸-碳酸鈉緩沖溶液:稱取122.1g無水碳酸鈉、56.4g硫酸鉀和40.7g硼酸加水至
3L ；
A反應液:用量筒量取500mL硼酸-碳酸鈉緩沖溶液倒入試劑瓶中,加0.2mL氯酸鈉溶液，混合均勻；
B反應液:稱取鄰苯二甲醛400mg，加乙醇7mL、2-巰基乙醇lmL、10%的十二烷基聚乙二醇醚2mL，用硼酸-碳酸鈉緩沖溶液定容至500ml ;以上A、B反應液可在4°C條件下保存7天；
(7)上機分析
用微量注射器注入10 μ L試樣及標樣于高效液相色譜儀上進入分析，得色譜圖；根據出峰時間鑒定樣品中氨基酸的種類，將樣品峰面積與標樣對比，計算樣品中各種氨基酸含量。
[0012]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種改進的測定氨基酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)準確稱取試樣0.1OOOg于1ml安瓿瓶中，然后向瓿瓶中準確加1+1的鹽酸5ml，將安瓶瓶封口，冷卻后，用膠布包好安瓶瓶，防止在恒溫消化時安瓶瓶破裂，置于恒溫干燥箱中消化； (2)消化完成后取出安瓿瓶冷卻至室溫，切開安瓿瓶，過濾消化液，立即準確移取ImL濾液于50mL容量瓶中，此時容量瓶內很多泡沫，加2-3滴乙醇消泡，然后加水稀釋至刻度； (3)稀釋液通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾，得到的濾液待用；濾液可在4°C條件下存放4小時； (4)標樣的稀釋處理 用ρΗ2.20的0.07mol/L檸檬酸鈉稀釋2.5 μ mol/mL的標樣25倍，得濃度為0.1 μ mol/mL的標樣待用，所述稀釋標樣可在4°C條件下保存I個月； (5)配制流動相 流動相A液:稱取58.8g檸檬酸鈉，溶解于2.5L水中，加乙醇210mL，加高氯酸50mL，加水稀釋至3L，將該稀釋液用60%高氯酸或4mol/L氫氧化鈉，準確調節pH值至3.20,并通過0.45mm孔徑的濾膜過濾； 流動相B液:稱取檸檬酸鈉58.8g和硼酸12.4g溶解于800mL水中，加4mol/L氫氧化鈉溶液30mL，加水稀釋至1L，將該稀釋液用60%高氯酸或4mol/L氫氧化鈉溶液調節其pH值為10.00并通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾； 流動相C液:稱取氫氧化鈉4g，加水稀釋至500mL，并通過0.45 μ m孔徑的濾膜過濾；以上三種流動相不用時均應在4°C環境中存放； (6)反應液的配制 硼酸-碳酸鈉緩沖溶液:稱取122.1g無水碳酸鈉、56.4g硫酸鉀和40.7g硼酸加水至3L ； A反應液:用量筒量取500mL硼酸-碳酸鈉緩沖溶液倒入試劑瓶中,加0.2mL氯酸鈉溶液，混合均勻； B反應液:稱取鄰苯二甲醛400mg，加乙醇7mL、2-巰基乙醇lmL、10%的十二烷基聚乙二醇醚2mL，用硼酸-碳酸鈉緩沖溶液定容至500ml ;以上A、B反應液可在4°C條件下保存7天； (7)上機分析 用微量注射器注入10 μ L試樣及標樣于高效液相色譜儀上進入分析，得色譜圖；根據出峰時間鑒定樣品中氨基酸的種類，將樣品峰面積與標樣對比，計算樣品中各種氨基酸含量。
2.根據權利要求1所述的改進的測定氨基酸含量的方法，其特征在于:所述步驟(I)中于消化條件為110°C恒溫干燥箱中消化12小時。
3.根據權利要求2所述的改進的測定氨基酸含量的方法，其特征在于:所述步驟(4)中標樣為17種氨基酸2.5Mfl1l/L混標溶液。
4.根據權利要求3所述的改進的測定氨基酸含量的方法，其特征在于:所述17種氨基酸分別為:天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸。
【文檔編號】G01N30/06GK104165946SQ201410403269
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】張玉良, 陳凱松 申請人:廣州衡創測試技術服務有限公司