一種基于異槲皮甙含量鑒別蜂花粉的方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于異槲皮甙含量鑒別蜂花粉的方法，該方法包括以下步驟：蜂花粉的前處理、標準貯備液和工作液的配制、高效液相色譜-串聯質譜法檢測。本發明提供了一種高效、穩定、重復性好，準確的鑒別七種蜂花粉的方法，對于加強蜂花粉種類鑒別的研究，探索蜂花粉溯源信息，以及開發我國傳統中醫藥物，提高我國蜂花粉質量，保證消費者的健康等具有重要的意義。
【專利說明】
一種基于異槲皮甙含量鑒別蜂花粉的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蜂花粉的鑒別方法，具體涉及基于異槲皮甙鑒別蜂花粉的方法。
【背景技術】
[0002]蜂花粉是蜜蜂從蜜源植物的雄蕊中采集的花粉，加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花蜜形成的不規則扁圓形的團狀物。蜂花粉含有多種氨基酸、維生素、礦物元素、不飽和脂肪酸、有機酸、蛋白質、脂類、碳水化合物，多酚類和黃酮類物質、多糖、酶類、核酸、激素等活性物質，具有豐富的營養價值。蜂花粉因其成分多樣而富有多種活性功能，不僅對治療貧血有特殊的療效，對于治療前列腺疾病也有較好的療效；還具有抗癌、抗輻射、降血脂、防治心腦血管疾病的作用；此外，蜂花粉對于治療習慣性便秘、胃腸病、肝病、神經衰弱均有功效；同時，蜂花粉對保護皮膚和美容有明顯的作用，可除去多余的脂肪達到減肥美體的目的，其提取物還具有保濕、抗氧化、調理皮膚和頭發的功效(孫麗萍，田文禮，朱曉麗等.蜂花粉功能食品的研究思路.中國養蜂，2006，57 (10):39-40)。
[0003]蜂花粉中各成分的含量如下:蛋白質20-25%、碳水化合物40-50%、脂肪5-10%、礦物質2-30%、木質素10-15%、未知物質10-15%，黃酮類物質是蜂花粉中重要的功效組分，也是保健食品中的主要成分。
[0004]目前一些不法商家將價格較低的蜂花粉摻入價格較高的蜂花粉中賺取高額利潤，但是由于大多數的蜂花粉顏色，味道非常相近，所以很難對市場的蜂花粉進行鑒別。通常根據植物來源對蜂花粉進行分類，所以不同蜂花粉之間的營養成分和生物學功能均存在一定差異。
[0005]已有的研究報道中鑒別花粉品種的方法為:感官檢驗，顯微鏡鏡檢，比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜-大氣壓電離質譜法(LC-TSP-MS)、膠束毛細管電泳法(MECC)和高效液相色譜法(HPLC)(以下內容摘錄自蜂花粉中黃酮類化合物的檢測及純化方法的研究，該文獻是中國農業科學院孫麗萍撰寫的碩士論文，2005年10月公開)。其中:
[0006]感官檢驗主要通過眼看蜂花粉的顏色和品嘗味道來鑒別種類，但是很多蜂花粉顏色差異比較小乃至肉眼很難分辨，不同的人觀察后也會認為是不同的顏色；一些種類的蜂花粉均具有微甜的味道，很難通過品嘗分辨其種類，所以該方法最大的缺點是鑒別能力的準確度低，容易受人為因素的影響；
[0007]在電子顯微鏡下來源于不同植物的花粉大小和形狀存在一定的差異，因此，可以通過顯微鏡下的輪廓圖鑒定植物的種類。但是在顯微鏡下很多蜂花粉的形態非常接近，這容易造成鑒別方法主觀性強，準確性低；
[0008]比色法是在堿性溶液中加Al3+與3-羥基黃酮、5-羥基黃酮進行絡合反應，利用顏色和含量關系進行比色測定的方法，該法用于組成單一的標準對照物時，結果準確，但當應用于組分復雜的植物試樣時，比如花粉黃酮提取液，由于受到花色素、鞣酸及其它酚性成分等多種物質的干擾，而且底液常常出現渾濁現象，因此測定結果明顯偏高，而且測定結果重現性不好。
[0009]紫外分光光度法:是利用黃酮類化合物在紫外區有較強吸收，利用適當的對照品進行黃酮的測定。為了消除一些水溶性的強極性物質的干擾，將樣品用聚酰胺進行了分離提純，再采用紫外分光光度法測定，此為聚酰胺-紫外分光光度法。
[0010]高效液相色譜法:一種方法是采用樣品直接進樣，梯度洗脫，高效液相色譜分析，測定樣品所含黃酮苷類成分，但是由于黃酮苷類種類多，不可能一次分離，而且很多都沒有標準對照物可對照，很難定量；另一種方法是通過測定水解苷元含量來計算黃酮苷的量，其測定原理是:蜂花粉黃酮主要成分是以黃酮苷形式存在，經酸水解后生成黃酮醇類化合物，其主要是槲皮素、異鼠李素和山奈酚三種成分，，用HPLC分離測定這三種苷元的含量，再用計算方式轉換成相應蜂花粉黃酮苷的含量。
[0011]利用薄層色譜法可分離分析蜂花粉中的維生素，由斑點的數目、形狀、顏色、熒光及Rf值比較，從而鑒別蜂花粉種類(楊夢蘭，李忠奇，王偉等.TLC法鑒別花粉種類，廣東公安科技，2000，3: 16-19)，但是該方法中使用了大量的具有揮發性的有毒有害試劑，如氯仿，冰醋酸，二氯甲烷和氨水等，而且根據Rf值和顏色鑒別也具有主觀性強，準確性低等缺點。
[0012]此外，采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結合二階導數譜和熱擾動下的二維相關紅外光譜技術對6種不同花粉，即杏花花粉、油菜花粉、茶花花粉、西瓜花粉、荷花花粉和虞美人花粉，進行了快速無損的鑒別(吳杰，周群，吳黎明等.六種蜂花粉的紅外光譜三級鑒別研究，光譜學與光譜分析，2010，30 (2) =353-357)，但是該方法需要實驗人員具有豐富的結構解析的經驗，所以紅外光譜法不適合普通檢測人員對蜂花粉種類進行鑒別，而且該方法只能用于定性分析，不能定量分析。
[0013]異槲皮甙，又名:槲皮素3-0-13_D-葡萄糖-(2— I)-β _D_葡萄糖苷、槲皮素
3-0-β-D-葡萄糖苷、陸地棉苷、羅布麻甲素，其結構式如式I所示:
[0014]
【權利要求】
1.一種蜂花粉的鑒別方法，該方法包括以下步驟:蜂花粉的前處理、標準貯備液和工作液的配制、高效液相色譜-串聯質譜法檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的前處理包括以下步驟:將蜂花粉用95%的乙醇溶液超聲提取2-3次，提取物離心，合并上清液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的前處理包括以下步驟:將蜂花粉用其重量3-14倍體積的95%的乙醇溶液，超聲提取2-3次，每次50-70min，提取物3000-5000r/min離心,合并上清液。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的前處理包括以下步驟:將蜂花粉粉碎過100-150目篩，加入其重量5-10倍量體積的95%的乙醇溶液，超聲提取2次，每次提取50-60min，將提取物3000_5000r/min離心10_15min，合并上清液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測方法包括色譜質譜條件為:流動相為0.1%的甲酸溶液和乙腈；C18色譜柱，柱溫為30°C ;流速為0.2mL/min ;進樣量為5.0 μ L ； 質譜條件為:霧化器溫度:350°C，霧化器流速:6L/min，霧化器壓力35psi，毛細管電壓:3500V，鞘流氣溫度:350°C，鞘流氣流速:9L/min，錐孔電壓:1000V。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述色譜條件中的洗脫梯度為:
時間(分鐘) |A相(0.1 %甲酸溶液)|B相(乙腈) O9010 TTo9010 ?Γ07525 θΓθ7525 9Λ90?0 2090K)
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)標準忙備液(2.0mg/mL)的配制:準確稱取標準物質異槲皮式50.0mg,置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分搖勻，備用； 2)標準工作液的配制:取適量標準貯備液于1mL容量瓶中，用甲醇依次稀釋定容，配制成以下系列標準工作液:lng/mL、10ng/mL、50ng/mL, 100ng/mL、500ng/mL 和 1000ng/mL,備用; 3)蜂花粉樣品前處理方法:稱取粉碎均勻的蜂花粉樣品12份，每份1.5±0.1g置于錐形瓶中，加入15mL95%的乙醇溶液，超聲提取60min，將混合溶液置于50mL離心管中3000r/min離心15min，上清液移入25mL容量瓶內，沉淀加入7.5mL95 %乙醇溶液繼續超聲提取60min，3000r/min離心15min，上清液全部移入容量瓶內，最后用95%乙醇定容至25mL，從容量瓶內吸取部分蜂花粉試樣溶液用純水稀釋10倍，取1.0mL待分析；4)液相色譜-串聯質譜條件:流動相為0.1%的甲酸溶液和乙腈；洗脫條件見表1 ;C18色譜柱，柱溫為30°C ;流速為0.2mL/min ;進樣量為5.0 μ L ;霧化器溫度:325°C，霧化器流速:6L/min，霧化器壓力35psi，毛細管電壓:3500V，鞘流氣溫度:350°C，鞘流氣流速:9L/min，錐孔電壓:1000V.標準物質異槲皮甙的母離子為626.9，定量離子為303.0，碰撞能量為15v，定性離子為465.0，碰撞能量為7v，駐留時間為100ms，傳輸電壓為10v ； 表1:液相梯度洗脫表
5)測定方法為定性測定和定量測定。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述定性測定為:根據蜂花粉試樣溶液中待測物質的含量，選擇峰面積相近的標準工作液和樣品溶液等體積參插進樣，通過色譜保留時間與質譜選擇離子共同定性。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述定量測定為:分別取適量蜂花粉試樣溶液和相應濃度的標準工作液，作單點校準或多點校準，以色譜峰面積積分值定量，標準工作液及試樣液中藥物的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。
【文檔編號】G01N30/06GK104198636SQ201410403217
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】周金慧, 李熠, 孫麗萍, 吳黎明, 徐響 申請人:中國農業科學院蜜蜂研究所