一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及蜂蜜中雷公藤生物堿檢測領域，尤其涉及一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測方法。該方法包括以下的步驟：1）標準溶液的配制，2）試樣制備，3）提取，4）凈化，5）色譜條件，6）質譜條件；本發明建立了一種固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜檢測蜂蜜中雷公藤次堿的分析方法。樣品用水溶解后經固相凈化小柱，經HypersilGOLDC18柱（50mm×2.1mm,1.9um）分離，電噴霧離子源正離子多反應監測（SRM）模式串聯質譜進行檢測，外標法定量。考察并優化了試樣溶解溶劑、凈化方法、色譜和質譜條件等。本方法快速、靈敏、準確，適用于蜂蜜中雷公藤相關物質殘留的定性、定量檢測。
【專利說明】一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蜂蜜中雷公藤生物堿檢測領域，尤其涉及一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 蜂蜜作為一種傳統的天然保健食品，主要是由蜜蜂采集植物花蜜、植物活體分泌 物或在植物活體上吮吸養分的昆蟲分泌物貯存在巢脾內，并經蜜蜂體內特有物質結合充分 釀造、轉化、脫水、儲藏，留待成熟后的天然甜性物質。蜜蜂如果采集有毒植物的花粉釀成 蜜，蜂蜜就會混進有毒物質。
[0003] 《GB 14963-2011食品安全國家標準蜂蜜》3. 1蜜源要求：蜜蜂采集植物的花蜜、 分泌物或蜜露應安全無毒，不得來源于雷公藤（Tripterygium wilfordi Hook. F.)、博落回 [Macleaya cordata(Willd.) R. Br]、狼毒（Stelera chamaejasme L.)等有毒蜜源植物。
[0004] 有關研究發現，雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook. f.)主要殺蟲活性成分為 雷公藤生物堿，該類生物堿對多種害蟲有較強的拒食和毒殺作用，對小菜蛾、菜青蟲及二化 螟等鱗翅目害蟲尤為明顯，其中以雷公藤次堿的活性最為突出。
[0005] 目前對雷公藤次堿的分析方法由《農藥》第44卷第4期2005年4月公開的雷公 藤次堿的高效液相色譜分析方法，該方法采用高效液相色譜法，乙腈+〇. 〇2mol/L磷酸二氫 鉀水溶液（50+50)作為流動相，流速為lml/min，C18反相色譜柱，紫外檢測波長為195nm， 用外標法對提取物中的雷公藤次堿進行了定性定量分析，方法的變異系數為0. 24%，線性 相關系數為〇. 9995,平均回收率為99. 8%。
[0006] 但是在蜂蜜中進行雷公藤次堿的檢測方法還沒有公開報道過，本發明固相萃取凈 化-超高效液相色譜-電噴霧電離串聯質譜聯用方法雷公藤次的檢測方法，為蜂蜜的質量 控制提供了檢測手段。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述的技術問題，本發明的目的是提供固相萃取凈化-超高效液相色 譜-電噴霧電離串聯質譜聯用測定蜂蜜中雷公藤次堿的分析方法，本方法快速、靈敏、準 確，適用于蜂蜜中雷公藤相關物質殘留的定性、定量檢測。
[0008] 為了實現上述的目的，本發明采用了以下的技術方案：
[0009] -種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測方法，該方法包括以下的步驟：
[0010] 1)標準溶液的配制
[0011] 標準儲備液：稱取雷公藤次堿標準品IOmg (精確至0. Img)置于IOOmL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成l〇〇mg/L的標準儲備液；
[0012] 標準中間液：準確移取ImL標準儲備液置于IOOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成I. 〇mg/L的混合標準中間液；
[0013] 標準工作液：根據需要移取適量混合標準中間液，用甲醇一水（1:1 ;v/v)稀釋成 0? 01ng/mL、0. 02ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL的標準工作溶液。
[0014] 各種標準溶液避光保存于4°C冰箱中；
[0015] 2)試樣制備
[0016] 對未結晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對有結晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后， 置于不超過60°C的水浴中溫熱，待樣品全部融化后攪拌，迅速冷卻至室溫，在融化時必須防 止水分揮發；
[0017] 3)提取
[0018] 稱取試樣2. Og,精確至0? Olg,于15mL具蓋離心管中，加入IOmL水，采用超聲、力口 熱或漩渦方式使其溶解，待凈化；
[0019] 4)凈化
[0020] 移取試樣提取液于固相凈化小柱中，使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化，棄去流 出液，然后用5mL體積比為1:1的甲醇/水溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5mL乙腈洗 脫，收集洗脫液于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用體積比為1:1的甲醇/水溶液 定容至2mL，混勻后經0. 22 y m有機相濾膜過濾后用于上機分析；
[0021] 5)色譜條件
[0022] 色譜柱：Hypersil GOLD C18 柱，50mmX 2. lmm, I. 9um ;柱溫：35°C;進樣量：2uL ;流 速：0. 25mL/min ;流動相：A為水溶液，B為含0. 15%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫程序：0? 2. Omin, 70 % A ;2. 0 ?5. Omin, 70 % A ?5 % A ;5. 0 ?10. Omin, 5 % A ;10. 1 ?14. Omin， 70% A ；
[0023] 6)質譜條件
[0024] 掃描方式：正模式掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧電壓：+3500V ;鞘氣： 30arb ;輔助氣：10arb ;毛細管溫度：350°C ;蒸發溫度：30(TC ;碰撞氣：氬氣；SRM監測離子 對：868. 468/206. 022、868. 468/178. 028 ;S-Lens 電壓：155V ;碰撞電壓：41V:54V ;保留時 間為 6. 17min。
[0025] 本發明建立了一種固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜檢測蜂蜜中 雷公藤次堿的分析方法。樣品用水溶解后經固相凈化小柱，經Hypersil GOLD C18柱 (50mmX2. lmm, I. 9um)分離，電噴霧離子源正離子多反應監測（SRM)模式串聯質譜進行檢 測，外標法定量。考察并優化了試樣溶解溶劑、凈化方法、色譜和質譜條件等。結果表明：雷 公藤次堿在0.01ng/mL-20 ng/mL范圍內具有較好的線性關系，相關系數大于0.998。該方 法檢出限（S/N>10)為0? 01ng/kg，在0? 01ug/kg、0. 05ug/kg和0? 5ug/kg添加水平的回收率 為76% -96%，相對標準偏差（RSD，n = 6)小于10%。本方法快速、靈敏、準確，適用于蜂 蜜中雷公藤相關物質殘留的定性、定量檢測。
【具體實施方式】
[0026] 1實驗部分
[0027] I. 1儀器與試劑
[0028] Ultimate 3000超高效液相色譜一TSQ Vantage三重四極桿串聯質譜聯用儀（美 國Thermo Scientific公司）；MS 3 digital漩潤混合器（德國IKA公司）；MD 200氮吹儀 (杭州奧盛儀器有限公司）。
[0029] 雷公藤次堿（彡98%)購自南通飛宇生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色 譜純，氯化鈉、無水硫酸鎂均為分析純；HLB固相萃取小柱：500mg，6mL (美國Waters公司）。
[0030] 1. 2標準溶液的配制
[0031] 標準儲備液：稱取雷公藤次堿標準品IOmg (精確至0. Img)置于IOOmL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成l〇〇mg/L的標準儲備液；
[0032] 標準中間液：準確移取ImL標準儲備液置于IOOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成I. 〇mg/L的混合標準中間液；
[0033] 標準工作液：根據需要移取適量混合標準中間液，用甲醇一水（1:1 ;v/v)稀釋成 0? 01ng/mL、0. 02ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL的標準工作溶液。
[0034] 各種標準溶液避光保存于4°C冰箱中。
[0035] 1. 3試樣制備
[0036] 對未結晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對有結晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后， 置于不超過60°C的水浴中溫熱，待樣品全部融化后攪拌，迅速冷卻至室溫。在融化時必須防 止水分揮發。
[0037] 1. 4 提取
[0038] 稱取試樣2. Og (精確至0. Olg)于15mL具蓋離心管中，加入IOmL水，采用超聲、力口 熱及漩渦等方式使其溶解，待凈化。
[0039] 1. 5 凈化
[0040] 移取試樣提取液于固相凈化小柱（使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化）中，棄去 流出液，然后用5mL甲醇/水（1/1 :V/V)溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5mL乙腈洗脫， 收集洗脫液于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用甲醇/水（1/1 :V/V)定容至2mL， 混勻后經0. 22 y m有機相濾膜過濾后用于上機分析。
[0041] 1.6色譜條件
[0042] 色譜柱：Hypersil GOLD C18 柱（50mmX2. lmm, I. 9um);柱溫：35°C ;進樣量：2uL ; 流速：0. 25mL/min。流動相：A為水溶液，B為含0. 15%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序： 0 ?2. Omin, 70% A ;2. 0 ?5. Omin, 70% A ?5% A ;5. 0 ?10. Omin，5% A ; 10. 1 ?14. Omin， 70% A0
[0043] 1. 7質譜條件
[0044] 掃描方式：正模式掃描；檢測方式：多反應監測（SRM);電噴霧電壓（Spray voltage) :+35〇OV ;鞘氣（Sheath gas pressure) :3〇arb ;輔助氣（Auxiliary gas flow) :IOarb ;毛細管溫度（Capillary Temperature) :350 °C ;蒸發溫度（Vaporizer Temperature) :300°C ;碰撞氣：気氣（I. 5mtorr)。SRM 監測離子對：868. 468/206. 022(定 量）、868. 468/178. 028 ;S-Lens 電壓：155V ;碰撞電壓 41V:54V ;保留時間為 6. 17min。
[0045] 2結果與討論
[0046] 2. 1前處理條件的優化
[0047] 采用各取IOmL水、水-甲醇（9:1，V/V)、水-甲醇（8:2, V/V)、水-甲醇（7:3, V/ V)、水-甲醇（6:4, V/V)、水-甲醇（5:5, V/V)溶解樣品。結果表明上述溶液均能較好的溶 解試樣，水的比例越高，過固相凈化小柱的阻力越小，同時考慮環境因素，因此采用水作為 試樣溶解液。根據試樣和測定目標物的性質，考察了 HLB、PSA、C18、NH4、MAX等5種固相萃 取凈化小柱的凈化效果和回收效率。試驗表明：HLB固相萃取凈化小柱對目標物的凈化效 果和回收率達到滿意結果。采用5mL甲醇-水（1:1，V/V)混合溶液作為淋洗液，能較好的 除去保留在小柱中的色素。試驗比較了甲醇和乙腈洗脫目標物的能力，結果表明乙腈能力 優于甲醇。
[0048] 綜上所述，本文采用水溶解試樣后上HLB固相萃取小柱，甲醇-水（1:1，V/V)淋 洗，最后用乙腈洗脫。
[0049] 2. 2色譜條件的優化
[0050] 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、酸化甲醇-水、酸化乙腈-水等流動相對雷公藤 次堿目標分析物的分離效果。結果表明，以酸化甲醇-水溶液為流動相，采用梯度洗脫，目 標物的分離度和峰形較好。
[0051] 2.3質譜條件的優化
[0052] 將雷公藤次堿標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離 子，再對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子，通過優化S-Lens、碰撞能量（Collision Energy)等參數進行優化，得到二級質譜圖。
[0053] 分別考察電噴霧電離源（ESI)的正離子和負離子模式和大氣壓力化學電離源 (APCI)的正離子和負離子模式四種電離方式，試驗表明，目標物在電噴霧電離源（ESI)的 正離子模式下最佳。
[0054] 通過多反應離子監測（SRM)選擇相對豐度較高的離子對，確定為定量和定性離子 對。同時，優化S-Iens電壓、碰撞電壓等參數。
[0055] 2. 4基質效應
[0056] 取空白蜂蜜樣品按本文1. 4和1. 5節進行前處理得到的上機分析液為標準溶液的 稀釋液，以各組分的峰面積對質量濃度繪制基質加標標準曲線，將其斜率與標準品的標準 曲線的斜率相比，斜率為80% -120%。結果表明經過凈化處理后對各目標測定物的基質效 應影響不明顯。
[0057] 2. 5方法的線性范圍和檢出限
[0058] 配制一系列不同濃度的標準工作溶液（0? 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10、 20ng/mL)，并依次進樣，分別以雷公藤次堿的峰面積Y為縱坐標，以相應的濃度值為橫坐 標，作標準曲線，結果表明，目標物在〇.〇1?20ng/mL范圍內其濃度與峰面積呈良好的 線性關系，線性關系方程為Y = -166. 356+14146. 4*X，相關系數r大于0. 998。以實際檢 測時的信噪比（S/N>10)確定方法檢出限為0.01ug/kg。
[0059] 2.6方法的回收率和精密度
[0060] 在〇? 01ug/kg、0. 05ug/kg和0? 5ug/kg三個添加水平下進行空白加標回收率試驗， 每個水平重復6次，結果見表1。0. 01ug/kg添加水平時目標物的回收率為76% -92%，RSD 為9% ;0. 05mg/kg添加水平時目標物的回收率為82% -96%，RSD為7% ;0. 5mg/kg添加水 平時目標物的回收率為77% -85%，RSD為5%，均符合殘留檢測的要求。
[0061] 表1方法的平均回收率和相對標準偏差（n = 6)
[0062]
【權利要求】
1. 一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟： 1) 標準溶液的配制 標準儲備液：稱取雷公藤次堿標準品10 mg,精確至0.1 mg,置于100 mL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成100 mg/L的標準儲備液； 標準中間液：準確移取1 mL標準儲備液置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成1. 〇mg/L的混合標準中間液； 標準工作液：根據需要移取適量混合標準中間液，用甲醇一水，體積比為1:1，稀釋成 0. 01 ng/mL、0. 02 ng/mL、0. 1 ng/mL、0. 2 ng/mL、0. 5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的標準工作溶液； 各種標準溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 試樣制備 對未結晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對有結晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后，置于 不超過60°C的水浴中溫熱，待樣品全部融化后攪拌，迅速冷卻至室溫，在融化時必須防止水 分揮發； 3) 提取 稱取試樣2.0 g，精確至0.01 g，于15 mL具蓋離心管中，加入10 mL水，采用震蕩、超 聲、加熱或漩渦方式使其溶解，待凈化； 4) 凈化 移取試樣提取液于固相凈化小柱中，使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水活化，棄去流出 液，然后用5 mL體積比為1:1的甲醇/水溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5 mL乙腈洗 脫，收集洗脫液于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用體積比為1:1的甲醇/水溶液 定容至2 mL，混勻后經0. 22Mm有機相濾膜過濾后用于上機分析； 5) 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18 柱，50_X2. lmm, 1. 9um ;柱溫：35°C ;進樣量：2uL ;流速： 0. 25 mL/min ;流動相：A為水溶液，B為含0. 15%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫程序：0? 2. Omin，70%A ;2. 0 ?5. 0 min，70%A ?5%A ;5. 0 ?10. 0 min，5% A ;10. 1 ?14. Omin，70%A ; 6) 質譜條件 掃描方式：正模式掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧電壓：+3500 V;鞘氣：30 arb; 輔助氣：10 arb ;毛細管溫度：350°C ;蒸發溫度：30(TC ;碰撞氣：氬氣；SRM監測離子對： 868. 468/206. 022、868. 468/178. 028 ;S-Lens 電壓：155 V ;碰撞電壓：41V:54V;保留時間為 6. 17 min〇
【文檔編號】G01N30/88GK104407081SQ201410402202
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】雷美康, 彭芳, 吳曉勤, 祝子銅, 徐佳文 申請人:衢州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心