電化學傳感器及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了電化學傳感器及其制備方法和應用，所述制備方法包括以下工序：(1)將裸金電極在硫酸溶液中以循環伏安法進行活化的活化工序；(2)將活化后的裸金電極在氯金酸水溶液中進行電鍍的電鍍工序；(3)將電鍍后的裸金電極與巰基苯硼酸溶液進行接觸的接觸工序。本發明提供的電化學傳感器能夠通過電化學性質對糖蛋白進行定量檢測。
【專利說明】電化學傳感器及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種電化學傳感器的制備及其應用。
【背景技術】
[0002]糖蛋白是一類由糖類和蛋白質以共價鍵連接而成的結合蛋白，廣泛的存在于動物、植物、微生物及病毒中。在維持生命體內環境、免疫防御、細胞識別、粘連與融合等方面發揮著重要作用。研究表明，腫瘤、阿爾茨海默氏病、類風濕性關節炎等疾病發生時，人體中糖蛋白的種類和豐度水平將會發生變化。已有很多糖蛋白如α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異抗原(PSA)已成為醫院癌癥篩查的常規檢測的疾病標志物。對糖蛋白含量進行檢測為疾病發生機制、早期診斷和預后評估體提供了重要的信息。
[0003]硼親和色譜法已成為一種有效的檢測糖蛋白的方法。糖蛋白的檢測普遍采用硼親和法進行檢測，硼親和法的基本原理為:在堿性的條件下，硼酸取代物可以與順式二羥基化合物在堿性條件下反應相互作用，形成五元環或六元環的酯，而在酸性的條件下，酯發生解離，整個過程快速、可逆。硼親和色譜法均需要昂貴的色譜儀進行完成檢測，同時檢測步驟繁瑣，限制了硼親和色譜法在檢測糖蛋白中的應用。因此，設計出一種操作簡單，成本低，同時對糖蛋白的檢測有優異的靈敏度的電化學傳感器是本領域亟需解決的問題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了克服現有技術中硼親和色譜法對糖蛋白的檢測只能借助昂貴色譜儀完成，且檢測步驟復雜的缺陷，提供一種電化學傳感器及其制備方法、操作過程簡單，成本低，同時對糖蛋白的檢測有優異的靈敏度的電化學傳感器及其在糖蛋白檢測中的應用。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供了一種電化學傳感器的制備方法，所述制備方法包括以下工序:
[0006](I)將裸金電極在硫酸溶液中以循環伏安法進行活化的活化工序；
[0007](2)將活化后的裸金電極在氯金酸水溶液中進行電鍍的電鍍工序；
[0008](3)將電鍍后的裸金電極與巰基苯硼酸溶液進行接觸的接觸工序。
[0009]本發明還提供了根據上述的制備方法所制備的電化學傳感器以及該電化學傳感器在檢測糖蛋白中的應用。
[0010]如圖1所示，本發明通過將裸金電極活化并在活化后的裸金電極的表面電鍍一層簇狀金納米粒子，然后將經過電鍍處理的裸金電極在巰基硼酸水溶液中進行接觸工序，接觸工序中納米金顆粒和巰基硼酸發生化學反應形成AU-S鍵并以“自組裝”的形式制成電化學傳感器。在堿性條件下，使用該電化學傳感器檢測糖蛋白時，傳感器表面的硼酸基團可以與糖蛋白的順式二羥基發生反應，從而能夠對糖蛋白進行檢測。
[0011]此外，根據本發明的電化學傳感器的制備方法，其具有簡單、生產成本低的優點；并且通過本發明的電化學傳感器的制備方法所制備的電化學傳感器具有優異的穩定性和寬的檢測線性范圍。
[0012]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中:
[0014]圖1是電化學傳感器的制備流程以及檢測糖蛋白的原理圖；
[0015]圖2是實施例1中電化學傳感器的掃描電鏡圖；
[0016]圖3是實施例1中電化學傳感器的掃描電鏡圖；
[0017]圖4是測試例I中，裸金電極、經過電鍍的裸金電極以及電化學傳感器的循環伏安曲線對比圖。
[0018]圖5是測試例2中，裸金電極、經過電鍍工序的裸金電極以及電化學傳感器對糖蛋白響應的循環伏安曲線對比圖。
[0019]圖6是測試例3中，電化學傳感器在含有氯化鈉的磷酸緩沖溶液、含有對苯二酚和氯化鈉的磷酸緩沖溶液以及含有鄰苯二酚和氯化鈉的磷酸緩沖溶液中的循環伏安曲線的對比圖。
[0020]圖7是測試例4中，電化學傳感器在含氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液、含牛血紅蛋白和氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液以及含辣根過氧化物酶和氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液的示差脈沖曲線對比圖。
[0021]圖8是測試例5中，電化學傳感器對不同濃度辣根過氧化物酶響應的循環伏安曲線圖。
[0022]圖9是測試例5中，電化學傳感器對不同濃度辣根過氧化物酶響應的循環伏安檢測的結果統計圖。
【具體實施方式】
[0023]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0024]本發明提供了一種電化學傳感器的制備方法，所述制備方法包括以下工序:
[0025](I)將裸金電極在硫酸溶液中以循環伏安法進行活化的活化工序；
[0026](2)將活化后的裸金電極在氯金酸水溶液中進行電鍍的電鍍工序；
[0027](3)將電鍍后的裸金電極與巰基苯硼酸溶液進行接觸的接觸工序。
[0028]根據本發明，所述活化工序中硫酸溶液的濃度可以在寬的范圍內變動，為了使得裸金電極更好地活化，優選硫酸溶液的濃度為0.1-1.0mol/L ;更優選地，硫酸溶液的濃度為0.4-0.6mol/Lo作為所述硫酸溶液的溶劑優選為水。
[0029]在本發明中，在所述活化工序中，為了使得裸金電極具有更優異的活化程度，優選所述循環伏安法的條件包括:掃描電位為-0.3V-1.55V，掃描速度為0.05-0.15V/S，掃描圈數為25-35圈；更優選所述循環伏安法的條件包括:掃描電位為0.30V-1.55V，掃描速度為
0.01-0.50V/S，掃描圈數為 10-70 圈。
[0030]在本發明中，所述電鍍工序中氯金酸水溶液的濃度可以在寬的范圍內變動，為了使得裸金電極上電鍍的簇狀金納米粒子更加均勻，同時使得簇狀金納米粒子與裸金電極結合的更加緊密，優選氯金酸水溶液的濃度為10-60mmol/L ;為了進一步提高電鍍效果，更優選地，氯金酸水溶液的濃度為28-32mmol/L。
[0031]在本發明中，為了使得裸金電極上電鍍的簇狀金納米粒子更加均勻，同時使得簇狀金納米粒子與裸金電極結合的更加緊密，優選所述電鍍工序中恒電位為-0.30V ?-0.90V,電鍍時間為 100-600S。
[0032]在本發明中，所述接觸工序中巰基苯硼酸溶液的濃度可以在寬的范圍內變動，為了提高簇狀金納米粒子與巰基苯硼酸形成Au-S鍵的速率，優選所述接觸工序中巰基苯硼酸溶液的濃度為0.1-1.0mg/mL，其中溶劑為四氫呋喃和丙醇的混合溶液，且四氫呋喃和丙醇的體積比為10:1-1:10。
[0033]在本發明中，在所述接觸工序中，所述接觸的條件包括:接觸的溫度為20-30°C，接觸的時間為2-24h ;為了使得狀金納米粒子與巰基苯硼酸充分反應，優選所述接觸的條件包括:接觸的溫度為25-27°C，接觸的時間為10-20h。
[0034]在本發明中，為了排除裸金電極的表面的雜質，主要是氧化層影響電鍍工序的效果，優選所述制備方法還包括:在所述活化工序之前，將裸金電極的表面的雜質去除的除雜工序。
[0035]在本發明中，所述除雜工序可以按照本領域的常規方法進行，為了簡化除雜工序的步驟，優選除雜工序的具體步驟為:在三氧化二鋁水溶液的存在下，將裸金電極在麂皮上進行打磨拋光，然后將拋光后的裸金電極依次置于乙醇和水中進行超聲處理。
[0036]在本發明中，除雜工序中三氧化二鋁水溶液的濃度以及超聲處理的時間均可以在寬的范圍內變動，為了使得除雜工序的除雜效果更加徹底，優選三氧化二鋁水溶液的濃度為0.05-0.50mol/L，優選在水中的超聲處理的時間為0.5min_10min，在乙醇中的超聲處理的時間為 0.5min_10min。
[0037]本發明還提供了根據上述的制備方法所制備的電化學傳感器以及該電化學傳感器在檢測糖蛋白中的應用。
[0038]以下將通過實施例對本發明進行詳細描述，但本發明并不僅限以下實施例。
[0039]以下實施例和測試例中，循環伏安測試以及示差脈沖測試通過上海辰華儀器公司的CHI 660電化學工作站進行(循環伏安測試以及示差脈沖測試采用三電極系統，電化學傳感器為工作電極，鉬絲電極為對電極，銀-氯化銀電極為參比電極，并且在測試之前通15分鐘純氮氣)；掃描電鏡為日立公司的S-4800倍發射掃描電子顯微鏡。
[0040]以下實施例和測試例中:辣根過氧化酶購自阿拉丁試劑公司；牛血紅蛋白、巰基苯硼酸購自Sigma公司；鄰苯二酚、對苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉購自上海化學試劑公司，且為分析純。
[0041]實施例1
[0042]電化學傳感器的制備:
[0043](I)除雜工序:先將裸金電極的表面在麂皮上用三氧化二鋁溶液打磨拋光；用二次水洗滌干凈后，放入無水乙醇超聲5分鐘，再放入二次水中超聲5分鐘；接著二次水洗滌干凈后，于25°C下干燥15min待用；
[0044](2)活化工序:將除雜工序后的裸金電極放在0.5mol/L的硫酸水溶液中用循環伏安法從-0.3V到1.55V開始掃描，掃描速度為0.1V/S,掃描30圈；掃描結束后用二次水沖洗電極并于25°C下干燥15min待用；
[0045](3)電鍍工序:將活化工序后的裸金電極在30mmol/L的氯金酸水溶液中在_0.60V恒電位進行電化學沉積400秒，二次水洗滌后于25°C下干燥15min待用；
[0046](4)接觸工序:在25°C下，將電鍍工序后的裸金電極放入濃度為0.5mg/mL的巰基苯硼酸溶液中12小時，然后取出用二次水清洗并在25°C下干燥15min，得到電化學傳感器，其中巰基苯硼酸溶液的溶劑為四氫呋喃和丙醇的混合溶液，且四氫呋喃和丙醇的體積比為10:1。
[0047]將電化學傳感器進行掃描電鏡檢測，檢測結果如圖2和圖3所示，圖2是放大倍數是10000倍的結果，圖3是放大倍數是6000倍的結果；由圖2和3可知，電化學傳感器的表面沉積有一層呈簇狀的金納米顆粒。
[0048]實施例2
[0049]電化學傳感器的制備:
[0050](I)除雜工序:先將裸金電極的表面在麂皮上用三氧化二鋁溶液打磨拋光；用二次水洗滌干凈后，放入無水乙醇超聲5分鐘，再放入二次水中超聲5分鐘；接著二次水洗滌干凈后，于25°C下干燥15min待用；
[0051](2)活化工序:將除雜工序后的裸金電極放在0.lmol/L的硫酸水溶液中用循環伏安法從-0.3V到1.55V開始掃描，掃描速度為0.05V/s,掃描25圈；掃描結束后用二次水沖洗電極并于25°C下干燥15min待用；
[0052](3)電鍍工序:在25°C下，將活化工序后的裸金電極在10mmol/L的氯金酸水溶液中在-0.30V的恒電位下電化學沉積100秒，二次水洗滌后于25°C下干燥15min待用；
[0053](4)接觸工序:將電鍍工序后的裸金電極放入濃度為0.lmg/mL的巰基苯硼酸溶液中20小時，然后取出用二次水清洗并在25°C下干燥15min，得到電化學傳感器，其中巰基苯硼酸溶液的溶劑為四氫呋喃和丙醇的混合溶液，且四氫呋喃和丙醇的體積比為1:1。
[0054]將電化學傳感器進行掃描電鏡檢測，檢測結果為電化學傳感器的表面沉積有一層呈簇狀的金納米顆粒。
[0055]實施例3
[0056]電化學傳感器的制備:
[0057](I)除雜工序:先將裸金電極的表面在麂皮上用三氧化二鋁溶液打磨拋光；用二次水洗滌干凈后，放入無水乙醇超聲5分鐘，再放入二次水中超聲5分鐘；接著二次水洗滌干凈后，于25°C下干燥15min待用；
[0058](2)活化工序:將除雜工序后的裸金電極放在1.0mol/L的硫酸水溶液中用循環伏安法從-0.3V到1.55V開始掃描，掃描速度為0.15V/s,掃描35圈；掃描結束后用二次水沖洗電極并于25°C下干燥15min待用；
[0059](3)電鍍工序:將活化工序后的裸金電極在60mmol/L的氯金酸水溶液中在-0.90V的恒電位下電化學沉積600秒，二次水洗滌后于25°C下干燥15min待用；
[0060](4)接觸工序:在25°C下，將電鍍工序后的裸金電極放入濃度為1.0mg/mL的巰基苯硼酸溶液中10小時，然后取出用二次水清洗并于25°C下干燥15min待用，得到電化學傳感器，其中巰基苯硼酸溶液的溶劑為四氫呋喃和丙醇的混合溶液，且四氫呋喃和丙醇的體積比為1:10。
[0061]將電化學傳感器進行掃描電鏡檢測，檢測結果為電化學傳感器的表面沉積有一層呈簇狀的金納米顆粒。
[0062]測試例I
[0063]實施例1中的裸金電極、經過電鍍的裸金電極和電化學傳感器的循環伏安檢測:
[0064](I)電解質溶液的配制:配制濃度為100mmol/L且pH為8.5的磷酸緩沖溶液，再加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度為86mmol/L。
[0065](2)將裸金電極、電鍍后的裸金電極和電化學傳感器依次浸入上述電解質溶液中。
[0066](3)開始循環伏安檢測，掃描電位為-0.1OV到1.30V。
[0067]循環伏安檢測的結果如圖4所示，圖中a為裸金電極，b為電鍍后的裸金電極，c是電化學傳感器；由圖可以看出，裸金電極的氧化還原電位不明顯，說明裸金電極的電化學活性很差，而電鍍后的裸金電極和電化學傳感器有一對明顯的氧化還原電位，從而說明電鍍后的裸金電極和電化學傳感器具有優異的電化學活性。
[0068]測試例2
[0069]實施例1中的裸金電極、經過電鍍的裸金電極和電化學傳感器的對糖蛋白的檢測:
[0070]糖蛋白的種類繁多，其中辣根過氧化酶為典型的糖蛋白，本測試例采用辣根過氧化酶作為測試對象。
[0071](I)辣根過氧化酶溶液的配制:配制溶劑為濃度為lOOmmol/L且pH為8.5的磷酸緩沖溶液，并加入氯化鈉使得氯化鈉濃度為86mmol/L，再加入辣根過氧化酶使其濃度為
2.5 μ mol/L0
[0072](2)分別將裸金電極、電鍍后的裸金電極、電化學傳感器依次浸入上述的辣根過氧化酶溶液中。
[0073](3)開始循環伏安法檢測，掃描電位為-0.10V到1.30V。
[0074]循環伏安法檢測的結果如圖5所示，圖中a為裸金電極，b為電鍍后的裸金電極，c電化學傳感器；由圖可知，裸金電極和電鍍后的裸金電極的氧化還原峰高度相對于圖3沒有明顯變化，說明裸金電極和電鍍后的裸金電極對辣根過氧化酶沒有電化學響應；而電化學傳感器的氧化峰電流相對于圖3有明顯降低，說明該電化學傳感器對辣根過氧化酶有優異的電化學響應。
[0075]測試例3
[0076]實施例2中的電化學傳感器二羥基化合物的定性檢測:
[0077]二羥基化合物包括順式二羥基化合物和反式二羥基化合物，對苯二酚為反式二羥基化合物，鄰苯二酚是順式二羥基化合物。
[0078](I)鄰苯二酚溶液、對苯二酚溶液和電解質溶液的配制:分別配制濃度為0.1mol/L的鄰苯二酚和對苯二酚溶液，其中電解質溶液為濃度為lOOmmol/L且pH為8.5的磷酸緩沖溶液，且磷酸緩沖溶液含有濃度為86mmol/L的氯化鈉。
[0079](2)將三個電化學傳感器分別浸入三份電解質溶液中。
[0080](3)對上述兩份電解質溶液中分別加入鄰苯二酚溶液和對苯二酚溶液，且使鄰苯二酌.和對苯二酌.濃度為I μ mol/Lo
[0081](4)循環伏安法檢測，掃描電位為0.55V到1.30V。
[0082]循環伏安法檢測結果如圖6所示，a為只有電解質溶液，b為電解質溶液加入了對苯二酚，c為電解質溶液加入了鄰苯二酚；相對于a，b中電化學傳感器的氧化峰電流沒有明顯變化，c中電化學傳感器的氧化峰電流明顯降低，從而說明電化學傳感器對順式二羥基化合物有明顯的電化學響應。
[0083]測試例4
[0084]實施例2中的電化學傳感器的對糖蛋白和非糖蛋白的定性檢測:
[0085]其中，牛血紅蛋白是非糖蛋白，辣根過氧化物酶是糖蛋白。
[0086](I)牛血紅蛋白溶液、辣根過氧化物酶溶液和電解質溶液的配制:配制濃度為
0.lmol/L的牛血紅蛋白溶液、濃度為0.lmol/L辣根過氧化物溶液，其中電解質溶液為濃度為lOOmmol/L且pH為8.5的磷酸緩沖溶液，且磷酸緩沖溶液含有濃度為86mmol/L的氯化鈉。
[0087](2)將三個電化學傳感器分別浸入三份浸入電解質溶液中。
[0088](3)對于一份電解質溶液中，加入牛血紅蛋白溶液并且使牛血紅蛋白的濃度為
3.1ymoVL0對于另一份電解質溶液中，加入辣根過氧化物酶溶液并且使辣根過氧化物酶的濃度為2.5 μ mol/Lo
[0089](4)循環伏安法檢測，掃描電位為0.00V到1.30V。
[0090]循環伏安法檢測的結果如圖7所示，a為只有電解質溶液，b為電解質溶液加入了牛血紅蛋白，c為電解質溶液加入了辣根過氧化物酶；相對于a，b中氧化峰電流沒有明顯變化，c中氧化峰電流明顯降低，從而說明該電化學傳感器對辣根過氧化物酶有靈敏的電化學響應，電化學傳感器對牛血紅蛋白沒有電化學響應。
[0091]測試例5
[0092]實施例3中的電化學傳感器對糖蛋白的定量檢測:
[0093](I)辣根過氧化酶溶液和電解質溶液的配制:配制濃度為0.lmol/L的辣根過氧化酶溶液，電解質溶液為濃度為lOOmmol/L且pH為8.5的磷酸緩沖溶液，且磷酸緩沖溶液含有濃度為86mmol/L的氯化鈉。
[0094](2)將9個電化學傳感器分別浸入9份電解質溶液中。
[0095](3)依次向9份電解質溶液中加入辣根過氧化酶溶液,使辣根過氧化酶的濃度依次為 0nmol/L,2.50nmol/L,25.00nmol/L,0.25 μ mol/L,2.50 μ mol/L,6.25 μ mol/L,12.50 μ mol/L,18.75 μ mol/L,25.00 μ mol/L。
[0096](4)循環伏安法檢測，掃描電位為0.00V到1.30V。
[0097]循環伏安法檢測的結果如圖8所示，辣根過氧化酶的濃度依次為0nmol/L，
2.50nmol/L, 25.0Onmo I/L, 0.25ymol/L,2.50 μ mol/L, 6.25μ mol/L,12.50 μ mol/L,18.75 μ mol/L, 25.00 μ mol/L的體系依次用a、b、C、d、e、f > g、h以及i表示。由圖可知從a_i，隨著辣根過氧化酶的濃度，氧化峰電流依次降低。然后用氧化峰電流為縱坐標，辣根過氧化酶的濃度為橫坐標勞倫茲方程進行線性擬合，擬合的結果如圖9所示，其線性方程為:Y=L 075-0.76/{[X(nM) +0.546]2+l.486}，相關系數為0.998。從而說明，本發明提供的電化學傳感器能夠對糖蛋白進行定量檢測。
[0098]以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0099]此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【權利要求】
1.一種電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下工序: (1)將裸金電極在硫酸溶液中以循環伏安法進行活化的活化工序； (2)將活化后的裸金電極在氯金酸水溶液中進行電鍍的電鍍工序； (3)將電鍍后的裸金電極與巰基苯硼酸溶液進行接觸的接觸工序。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其中，所述活化工序中的硫酸溶液的濃度為0.1-1.0mol/L ； 優選地，硫酸溶液的濃度為0.4-0.6mol/L。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其中，在所述活化工序中，所述循環伏安法的條件包括:掃描電位為-0.3V-1.55V，掃描速度為0.05-0.15V/S，掃描圈數為25-35圈。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其中，在所述電鍍工序中，所述氯金酸水溶液的濃度為 10_60mmol/L ； 優選地，氯金酸水溶液的濃度為28-32mmol/L。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其中，所述電鍍工序中的恒電位為-0.30V ?-0.90V,電鍍時間為 100-600s。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其中，在所述接觸工序中，所述巰基苯硼酸溶液的濃度為 0.1-1.0mg/mL ； 優選地，所述巰基苯硼酸溶液的溶劑為四氫呋喃和丙醇的混合溶液，且四氫呋喃和丙醇的體積比為10:1-1:10。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其中，在所述接觸工序中，所述接觸的條件包括:接觸的溫度為20-30°C，接觸的時間為2-24h。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其中，所述制備方法還包括:在所述活化工序之前，將裸金電極的表面的雜質去除的除雜工序； 優選地，所述除雜工序的具體步驟為:在三氧化二鋁水溶液的存在下，將裸金電極在麂皮上進行打磨拋光，然后將拋光后的裸金電極依次置于乙醇和水中進行超聲處理； 更優選地，所述三氧化二鋁水溶液的濃度為0.05-0.50mol/L，所述在水中的超聲處理的時間為0.5min-10min,在乙醇中的超聲處理的時間為0.5min-10min。
9.一種電化學傳感器，其特征在于，該電化學傳感器通過權利要求1-8中任意一項所述的方法所制備。
10.根據權利要求1-8中的任意一項所述的制備方法所制備的電化學傳感器在檢測糖蛋白中的應用。
【文檔編號】G01N27/26GK104132974SQ201410400472
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月14日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】劉云春, 沈冬冬, 楊周生 申請人:安徽師范大學