一種基于弓形蟲基質蛋白1的間接elisa檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種基于弓形蟲MAG1蛋白的間接ELISA檢測試劑盒，由96孔酶標板、底物包被品、標準品、對照品、底物溶液、脫脂奶粉、樣本稀釋液、洗滌液、反應液、顯色液、終止液組成。本發明的試劑盒能夠識別人、兔、豬、狗、貓、猴、小鼠等多種哺乳動物IgG，較快速地檢測弓形蟲的感染，特異性和靈敏度高，特別是臨床大規模檢測時可極大提高工作效率。該方法無需昂貴的PCR檢測儀等設備，只需紫外分光光度計、恒溫箱等設備，操作簡單，特異性強、重復性好、結果清晰穩定，且待檢樣本極易獲得。
【專利說明】-種基于弓形蟲基質蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術，涉及一種基于弓形蟲基質蛋白1 (MAG1)的間接ELISA檢測 試劑盒及應用，可以檢測人、豬、貓、狗、小鼠等的弓形蟲感染。
【背景技術】
[0002] 弓形蟲是一種世界范圍內分布的細胞內寄生的原蟲，可以感染包括人在內的各 種溫血動物，引起弓形蟲病。廣泛的宿主群使其成為最為成功的一種寄生蟲（Boothroyd, 2009)。在人類患者中，弓形蟲病大多呈隱性感染，伴有淋巴結腫大、發低燒、全身乏力、喉 嚨痛以及昏睡。在免疫抑制的患者體內則呈現較為嚴重癥狀，包括弓形蟲腦炎、心肌炎、肺 炎、肝炎以及系統器官障礙（Utsuki et al.，2011)。在孕婦體內，先天性的感染可以導致 流產、新生兒畸形、失明等。在動物中，弓形蟲病在世界范圍內在成巨大經濟損失，它能夠 導致流產、死胎。此外，在畜產品中的組織包囊是弓形蟲感染給人的重要來源（Brown and Patterson, 2011)。
[0003] 弓形蟲的血清學診斷對于正常宿主的急性感染是可行的，但對受到免疫抑制 的病畜很難應用。所以在使用這種方法時不僅要選取特異性抗原，還要求弓形蟲感染 者體內針對該抗原的血清抗體滴度較高。此外，在設計此方法時，應充分考慮到抗體類 型、在體內持續時間、抗體滴度隨時間的變化等，力求敏感性、特異性和重復性俱佳。在 弓形蟲的保護性抗原中，SAG1、SAG2、GRA2、MAG1幾種抗原刺激機體產生抗體滴度較高 (Gamble, H. R. et al.，2000)。一些研究顯示，GRA6、GRA7、P35重組蛋白可以用來檢測 弓形蟲感染急性期產生的IgG抗體，效果比慢性期的好（Pietkiewicz, H.，et al.，2004; Hiszczynska_Sawicka，et al.，2005)。在Holec等人的研究中，針對重組MAGI的特異性 兔抗血清能與弓形蟲速殖子裂解物中的65 kDa蟲體天然MAG1抗原產生反應（Pfrepper, K. I.，et al.，2005)，這就為MAGI蛋白在免疫和診斷上的廣泛應用提供了理論基礎。使用 重組MAG1蛋白來檢測天然MAG1抗原刺激犬血清內產生的抗體，建立的間接ELISA方法具 有操作簡單、特異性好、靈敏度高等特點。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種基于弓形蟲基質蛋白1 (MAG1)的間接ELISA檢測試劑 盒，可快速有效的檢測弓形蟲感染的抗體水平，從分子生物學的角度，為預防、診斷弓形蟲 病奠定基礎，本發明同時提供檢測試劑盒中包被抗原的重組蛋白MAG1的制備方法和基因 序列。
[0005] 本發明試劑盒包含：96孔酶標板、底物包被品（凍干品)、標準品、對照品、底物溶 液、脫脂奶粉、樣本稀釋液、洗滌液、反應液、顯色液、終止液。
[0006] 底物包被品（凍干品)為含0. 15 mg MAG1重組蛋白，其核苷酸序列為：SEQ ID No : 3〇
[0007] 標準品為犬弓形蟲陽性血清。
[0008] 對照品為犬弓形蟲陰性血清。
[0009] 底物溶液1父10!111/瓶，為口!1為9.6的10 1111?85溶液（恥(：10.08 8，1((：10.002 g, Na2HP04. 12H20 0· 029 g, ΚΗ2Ρ04 (λ 002 g,加去離子水定容至 10 ml )。
[0010] 脫脂奶粉5 g。
[0011] 樣本稀釋液1X100 ml/瓶，為pH為7. 4的10 mM PBS溶液。
[0012] 洗滌液1 X 10 ml/瓶，為含0· 2% Tween20 pH為7. 4的0· 6 M PBS溶液，使用前用 去離子水按1 :60稀釋。
[0013] 顯色液1X10 ml/瓶(配制方法：2· 43 ml 0· 1 Μ檸檬酸溶液，2. 57 ml 0· 2M Na2HP04溶液，5 ml ddH20,加入4 mg 0PD粉末溶解，再加入15 μ? 30% H202溶液混勻）。
[0014] 反應液1 X 10 ml/瓶，含HRP-SPA酶標物。
[0015] 終止液 IX 10 ml/ 瓶，內含 2 mol/L H2S04。
[0016] 其中，底物包被品（凍干品)、標準品、對照品、反應液保存于-20 °C，盡量減少反復 凍融，顯色液避光保存。
[0017] 本發明試劑盒使用方法： 1.標本的采集及保存 血清：全血標本請于37 °C放置2小時或4 °C過夜后于離心機中1000 g離心10分 鐘，取上清檢測。
[0018] 2.操作步驟 (1)底物包被品用底物溶液溶解，充分混勻并盡量避免起泡。加樣時將樣品加于酶標板 底部，盡量不觸及孔壁，每孔100 μ 1。37 °C放置2小時或4 °C過夜。
[0019] (2)棄去液體，甩干。將洗滌液用去離子水按1 :60稀釋。每孔250 μ 1，洗滌5次， 每次3分鐘，甩干。
[0020] (3)將脫脂奶粉用樣本稀釋液稀釋，每孔250 μ 1，37 °C放置1小時。
[0021] (4)棄去液體，甩干，洗5次，同步驟2。
[0022] (5)將待檢樣本用樣本稀釋液按1:50稀釋，每孔100 μ 1。同時，設立陽性對照 (標準品）及陰性對照(對照品）。37 °C放置1小時。
[0023] (6)棄去液體，甩干，洗5次，同步驟2。
[0024] (7)加反應液，每孔100 μ 1。37 °C放置1小時。
[0025] (8)棄去液體，甩干，洗5次，同步驟2。
[0026] (9)加顯色液，每孔100 μ 1，37 °C避光顯色15分鐘。
[0027] (10)加終止液，每孔50 μ 1，輕輕搖晃，迅速使用紫外分光光度計在492nm波長下 測各孔0D值。
[0028] (11)結果判定：樣本的0D值> 0. 789時，判斷為陽性；樣本的0D值< 0. 789時， 判斷為陰性。
[0029] 本發明的重組蛋白MAG1的制備方法如下： (1)以弓形蟲 DNA 為模板，以上游引物（5 ' -CGGGGTACCGTGCCAGAGCTACCAGAAGTGG-3 '） 和下游引物（5' -CGCGAATTCCGCCAGATCCCTGAACCCTTAG-3'）進行 PCR 擴增，擴增片段為 529 bp，核苷酸序列見序列表SEQ ID No :3。PCR產物回收后與質粒pET28b -起用I及 feoR I進行雙酶切，構建原核表達質粒pET28b-MAGl。
[0030] (2)將原核表達質粒pET28b-MAGl轉入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，以IPTG 對重組蛋白進行誘導表達。
[0031] (3)對誘導表達獲得的重組蛋白進行純化處理，得到可用于制備試劑盒的抗原蛋 白。
[0032] 本發明的優點： (1)抗原來源各易，重組蛋白MAG1可在實驗室大量制備。
[0033] (2)本試劑、試劑盒及檢測技術能夠識別人、兔、豬、狗、貓、猴、小鼠等多種哺乳動 物IgG，較快速地檢測弓形蟲的感染。
[0034] (3)特異性好，敏感性高，該試劑盒的抗原是弓形蟲MAG1重組蛋白，成分單一，不 含無關雜蛋白，具有較高的特異性和敏感性，穩定性好。
[0035] (4)操作簡單，成本低廉，重復性好，結果清晰，且待檢樣本極易獲得。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1是MAG1的PCR擴增結果。
[0037] 圖2是SDS-PAGE檢測重組蛋白MAG1的誘導表達。
[0038] 圖3是MAG1蛋白純化后SDS-PAGE鑒定。
【具體實施方式】
[0039] 本發明結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明 目的，而不用于限制本發明范圍。
[0040] 實施例一弓形蟲MAG1蛋白的原核表達及純化 1.材料 10X PCR Buffer、7? DNA polymerase、dNTP 等 PCR 反應所需試劑，DNA Marker DL2000,凝膠純化回收試劑盒，購自愛思進公司；Ni-FF親和層析柱，購自北京韋氏博慧 色譜科技有限公司；限制性內切酶命I及價〇R I，T4DNA連接酶，核酸電泳染料 GoldView，購自賽百盛生物公司；Biometra T-Gradient Thermoblock梯度PCR儀，電泳儀， 北京市六一儀器廠產品；凝膠成像分析系統，上海培清科技有限公司；恒溫搖床，超聲裂解 儀，生化培養箱，微量振蕩器，移液槍，移液槍槍頭。
[0041] 2. MAG1片段的擴增及純化回收 ISl F€R IfΜ
【權利要求】
1. 一種基于弓形蟲基質蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒由96 孔酶標板、底物包被品、標準品、對照品、底物溶液、脫脂奶粉、樣本稀釋液、洗滌液、反應液、 顯色液、終止液組成，其中底物包被品為含基質蛋白1重組蛋白的凍干品，標準品為犬弓形 蟲陽性血清，對照品為犬弓形蟲陰性血清，底物溶液為pH為9. 6的PBS溶液，脫脂奶粉，樣 本稀釋液為pH為7. 4的PBS溶液，洗滌液為含0. 2% Tween20 pH為7. 4的PBS溶液，反應 液含HRP-SPA酶標物，終止液為H2S04，基質蛋白1重組蛋白的核苷酸序列為：SEQ ID No : 3〇
2. 根據權利要求1所述的一種基于弓形蟲基質蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒，其特 征在于，洗滌液使用前用去離子水按1 :60稀釋。
3. 根據權利要求1所述的一種基于弓形蟲基質蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒，其特 征在于，顯色液配制方法：2. 43 ml 0.1 Μ檸檬酸溶液，2. 57 ml 0.2M Na2HP04溶液，5 ml ddH20,加入4 mg 0PD粉末溶解，再加入15 μ? 30% H202溶液混勻。
4. 根據權利要求1所述的一種基于弓形蟲基質蛋白1的間接ELISA檢測試劑盒，其特 征在于，底物包被品、標準品、對照品、反應液保存于-20 °C，盡量減少反復凍融，顯色液避 光保存。
【文檔編號】G01N33/569GK104155443SQ201410383382
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】杜愛芳, 卓洵輝, 張智, 趙現鋒, 周前進 申請人:浙江大學