準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的方法
【專利摘要】本發明公開準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的方法，利用化學蛋白質組學驅動的秀麗線蟲feeding RNAi技術建立化合物表型篩選和靶點鑒定的無縫對接，所述活性化合物是指線蟲中有相應表型的活性化合物，所述表型包括但不限于脂質代謝障礙、細胞凋亡、自吞噬、衰老、神經退行性病變，抗感染。本發明不僅解決了目前困擾單純運用蛋白質組學手段分析藥物互作蛋白容易產生的假陽性和假陰性問題，能夠實現去偽存真，并且操作簡便，篩選快速、精確，為實現大通量的藥物互作蛋白的分析提供了可行方案，形成了更完善的化學蛋白質組學技術體系，為突破表型篩選蛋白質靶點鑒定的瓶頸提供了可能。
【專利說明】準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物祀點鑒定的 方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，更具體地講，涉及一種準確快速實現表型篩選所獲得活性 化合物藥物祀點鑒定的方法。
【背景技術】
[0002] 藥物發現策略主要包括"基于表型的篩選（phenotypic screening)"和"基于革己 點的篩選（target-based screening)"。該兩大類型的藥物篩選已經相繼主導過去一百年 的藥物開發。前者關注化合物誘導的細胞、組織或整個生物體的效應或表型，而后者在體外 分析化合物對純化的祀蛋白的效應。其中，基于祀點的藥物篩選在近30年占主導地位。然 而，1999年到2008年FDA批準的新藥統計分析表明基于祀點的篩選盡管在化Ilower跟蹤 類藥物的審批中占有優勢，但是在化St-in-class原創新藥的發現上只有17個，而非主流 技術"基于表型的篩選"first-in-class卻有28個。基于表型的篩選在化st-in-class原 創新藥開發中具有明顯優勢。學術界和產業界開始質疑基于祀標的篩選雖然有其優勢，但 也可能限制了藥物發現的范圍。而基于表型的篩選在藥物發現中正卷±重來，并激起了激 烈的爭議。諾華和葛蘭素史克公司是積極擁抱該種回潮的擁是者，而羅氏和基因技術公司 似乎對此疑慮重重。值得注意的是，無論是學術界還是產業界，無論是贊成基于表型篩選的 諾華和葛蘭素，還是反對者羅氏和基因技術公司佑enentech)，都源自基于表型篩選獲得活 性化合物后如何實現祀標鑒定該一問題。活性化合物的發現與祀標的鑒定兩者間實現無縫 對接是學術界和產業界關注的焦點和難點。祀標的鑒定的新技術已經成為能否讓基于表型 的篩選重新受到學術界和產業界的青睞，奪回被基于祀標的篩選侵占的主導地位的關鍵， 推動藥物研發革命的關鍵。
[0003] 目前，基于表型的藥物篩選包括基于細胞、組織表型的篩選W及基于動物表型的 篩選。基于細胞表型分析通常使用原代人類細胞株，永生化細胞系（原代或工程化），或來 自患者或正常人類原代細胞，W及被誘導的多能干細胞（iPSCs)分化的特定細胞類型等。 與基于祀標的藥物篩選相比，基于細胞表型分析的藥物篩選是處于復雜的蛋白相互作用和 信號網絡的生物環境，更接近于人體，是目前藥物表型篩選的主流。但是，其缺點是細胞不 能模擬人體的藥物吸收、分布、代謝和排泄過程，W及體內的毒性。導致很多體外有生物學 效應的化合物在體內效應不一致。
[0004] 與細胞相比，基于動物模型的篩選除了對疾病的療效數據，給予小動物的表型篩 選可提供對化合物吸收，分布，代謝和毒性豐富的信息。曬齒類動物，如小鼠、猴子等，與人 類種屬之間的保守型高，但是其成本高、操作復雜、周期長，不適合初期的藥物篩選。在過去 10 - 20年，很多疾病都找到了合適的與人類疾病相關性好小動物疾病模型，包括秀麗隱桿 線蟲，斑馬魚，非洲爪贍和果禍等，該些小動物體積小、好飼養、生命周期短，適合高通量的 藥物篩選，已經被成功應用于很多疾病相關的活性化合物篩選。無論是基于細胞的篩選W 及基于動物模型的篩選，兩者均受困于祀點鑒定。只有找到藥物的祀點分子才能理解藥物 與祀點結構互作的本質；才可W針對性的開發、設計、優化和改造化合物；同時，也有利于 藥物的臨床實驗設計，選擇合適的人群，增加藥物研發的可預測性，降低藥物研發的費用。
[0005] 目前已知的藥物祀點98% W上屬于蛋白質，包括G蛋白禪聯受體、絲氨酸、蘇氨 酸和酪氨酸蛋白激酶、鋒金屬膚酶、絲氨酸蛋白酶、核激素受體W及磯酸二醋酶等。盡管W RNAi為代表的遺傳學手段在藥物祀點的鑒定方面有一些成功的案例，蛋白質芯片、同位素 標記的策略W及化學蛋白質組學等從蛋白質角度鑒定藥物祀點才是最直接有效的策略。其 中，化學蛋白質組學是目前鑒定和發現藥物祀點的最有效的手段。化學蛋白質組學W活性 化合物為巧釣取相互作用的蛋白質，并結合質譜定性定量分析，發現藥物祀點。值得注意的 是，當藥物與祀點蛋白是共價鍵結合時，通過苛刻的沖洗，可W顯著減少非特異性結合蛋白 質。但小分子化合物與蛋白質常常呈非共價鍵形式相互作用，為了保證祀點蛋白的結合，不 能采用劇烈的沖洗，會殘留很多非特性結合的蛋白質，需要艱巨的去偽存真的工作，該是困 擾化學蛋白質組學與表型篩選對接的關鍵。
[0006] RNAi能夠非常快速地使祀基因失活，從而很快成為基因功能研究和祀標驗證的重 要工具。然而在哺乳動物細胞中進行大規模的RNAi是有困難的。Timmons和Fire首次描 述了通過喂食表達dsRNA的細菌給線蟲可達到RNAi的目的，該技術（feeding RNAU操作 方便，很快成為一種有效的篩選目的基因功能缺失型的重要工具，為快速篩選化合物的潛 在祀蛋白提供了可能。
[0007] 秀麗線蟲（Caenorh油ditis elegans)蟲體小、透明，生命周期較短、繁殖快，便于 表型觀察；實驗無需特殊條件、無菌要求低、不易交叉污染、便于操作及長期保藏；秀麗線 蟲具有2000個基因，是最早完成測序的生物體，約60%的基因與人類同源；在線蟲中基因 沉默、過表達、敲除及突變的技術非常成熟；CGC等線蟲保藏中也擁有大量突變體線蟲，另 外還擁有豐富的WormBook、WormBase等免費網絡資源提供線蟲的基本知識、實驗技術和基 因信息。線蟲雖小，只有1000個細胞，卻已經具備分化的細胞和器官，可W表現出衰老、行 為、認知和疾病等多細胞生物的復雜表型。同時，與細胞相比較，秀麗線蟲在化合物篩選方 面還得益于對化合物具有吸收、代謝、分部、排泄等藥物代謝動力學的完整過程勢，其獲得 的活性小分子化合物與人體實驗更接近。秀麗線蟲的復雜性正好適合于化合物的表性分 析。近年來在抗衰老、脂肪儲存和代謝、抗細菌和真菌感染、糖尿病、及神經退行性病變等領 域均有深入的研究，建立了高效的篩選模型，并獲得了一些重要的活性化合物。我們利用秀 麗線蟲和化學蛋白質組學可W實現兩者的無縫對接，解決目前制約化St-in-class原創藥 物發現的瓶頸和基礎性問題。
[0008] 番慕枝內醋（Annonaceous acetogenins)是從番慕枝科植物中分離得到的一類具 有廣譜生理活性的天然化合物。 申請人:的發明專利申請番慕枝內醋聚離類似物AA005及其 結構類似物在制藥中的應用（申請號：201310143100.5)已經掲示了番慕枝內醋聚離類似 物AA005及其結構類似物在制備預防或治療脂質代謝異常疾病藥物中的應用。我們在研究 中意外發現該化合物類似物可W阻斷秀麗線蟲及小鼠前脂肪細胞3T3-L1脂質累積，但其 作用祀標未知。本發明主要W該化合物為探針，探討化學蛋白質組學結合秀麗線蟲feeding RNAi鑒定藥物祀標的新方法。該種策略的成功實施可能為解決目前藥物候選蛋白從發現到 確證的瓶頸提供可能。
【發明內容】
[0009] 本發明的第一個目的在于，提供一種準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥 物祀點鑒定的方法。
[0010] 本發明的第二個目的在于，提供化學蛋白質組學聯合基于表型的秀麗線蟲 feeding RNAi技術在尋找具有活性的藥物或化合物祀點中的應用。
[0011] 本發明的第H個目的在于，提供線粒體H功能酶a亞基在制備番慕枝內醋聚離 類似物AA005抑制脂質累積的藥物祀標的應用。
[0012] 本發明第四個目的在于，提供線粒體H功能酶a亞基作為藥物祀標在篩選調控 脂質代謝的小分子化合物中的應用。
[0013] 為實現W上第一個發明目的，本發明公開W下技術方案；準確快速實現表型篩選 所獲得活性化合物藥物祀點鑒定的方法，其特征在于，所述方法利用化學蛋白質組學驅動 的秀麗線蟲feeding RNAi技術建立化合物表型篩選和祀點鑒定的無縫對接，所述活性化合 物是指線蟲中有相應表型的活性化合物，所述表型包括但不限于脂質代謝障礙、細胞調亡、 自吞瞻、衰老、神經退行性病變，抗感染，所述秀麗線蟲的feeding RNAi是化學蛋白質組學 數據驅動的，非全基因組范圍的feeding RANi。
[0014] 作為一個優選方案，準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物祀點鑒定的方 法，包括如下步驟：
[0015] (1)建立化合物對應的線蟲表型；
[0016] (2)活性化合物的結構修飾和活性測定；
[0017] (3)活性化合物相互作用蛋白的釣取；
[0018] (4)活性化合物相互作用蛋白的鑒定；
[0019] (5)秀麗線蟲feeding RNAi篩選祀蛋白；
[0020] (6)哺乳動物中祀蛋白的驗證，所述哺乳動物為與線蟲表型相對應的哺乳動物細 胞或動物模型。
[0021] 作為一個優選方案，，步驟（2)所述活性化合物的結構修飾包括在非活性位點加 入標記信號W利于親和層析，標記信號如生物素biotin。
[0022] 作為一個優選方案，步驟（3)活性化合物相互作用蛋白的釣取是指通過抗生物素 的瓊脂糖微球，如Streptavidin微球。
[0023] 作為一個優選方案，進行步驟（3)活性化合物相互作用蛋白的釣取所用的蛋白裂 解液可W是線蟲或細胞的全細胞裂解液，也可W是線蟲或細胞的細胞器組分的裂解液。
[0024] 作為一個優選方案，步驟（4)活性化合物相互作用蛋白的鑒定通過LC-MS進行分 析。
[0025] 為實現W上第二個發明目的，本發明公開W下技術方案；化學蛋白質組學聯合基 于表型的秀麗線蟲feeding RNAi技術在尋找具有活性的藥物或化合物祀點中的應用。
[0026] 為實現W上第H個發明目的，本發明公開W下技術方案；線粒體H功能酶a亞基 在制備番慕枝內醋聚離類似物AA005抑制脂質累積的藥物祀標的應用。線粒體H功能酶a 亞基，在線蟲中是T08B2. 7,哺乳動物中是HADHA。
[0027] 為實現W上第四個發明目的，本發明公開W下技術方案；線粒體H功能酶a亞基 作為藥物祀標在篩選調控脂質代謝的小分子化合物中的應用。
[0028] 首先，本發明建立基于秀麗線蟲的高通量的表型篩選技術，W番慕枝內醋聚離類 似物AA005及生物素標記的AA005炬iotin-AA005)作為分子探針，依巧秀麗線蟲建立液體 培養給藥的方法和脂肪定量的方法，形成基于秀麗線蟲的高通量藥物篩選技術，有利于通 量篩選活性化合物。
[0029] 所述AA005的結構式如下：
【權利要求】
1. 準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的方法，其特征在于，所述 方法利用化學蛋白質組學驅動的秀麗線蟲feeding RNAi技術建立化合物表型篩選和靶點 鑒定的無縫對接，所述活性化合物是指線蟲中有相應表型的活性化合物，所述表型包括但 不限于脂質代謝障礙、細胞凋亡、自吞噬、衰老、神經退行性病變，抗感染，所述秀麗線蟲的 feeding RNAi是化學蛋白質組學數據驅動的，非全基因組范圍的feeding RANi。
2. 根據權力要求1所述的準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的 方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 建立化合物對應的線蟲表型； (2) 活性化合物的結構修飾和活性測定； (3) 活性化合物相互作用蛋白的釣取； (4) 活性化合物相互作用蛋白的鑒定； (5) 秀麗線蟲feeding RNAi篩選革巴蛋白； (6) 哺乳動物中靶蛋白的驗證，所述哺乳動物為與線蟲表型相對應的哺乳動物細胞或 動物模型。
3. 根據權力要求2所述的準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的 方法，其特征在于，步驟（2)所述活性化合物的結構修飾包括在非活性位點加入標記信號 以利于親和層析，標記信號如生物素 biotin。
4. 根據權力要求2所述的準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的 方法，其特征在于，步驟（3)活性化合物相互作用蛋白的釣取是指通過抗生物素的瓊脂糖 微球。
5. 根據權力要求2所述的準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的 方法，其特征在于，進行步驟（3)活性化合物相互作用蛋白的釣取所用的蛋白裂解液可以 是線蟲或細胞的全細胞裂解液，也可以是線蟲或細胞的細胞器組分的裂解液。
6. 根據權力要求2所述的準確快速實現表型篩選所獲得活性化合物藥物靶點鑒定的 方法，其特征在于，步驟（4)活性化合物相互作用蛋白的鑒定通過LC-MS進行分析。
7. 化學蛋白質組學聯合基于表型的秀麗線蟲feeding RNAi技術在尋找具有活性的藥 物或化合物靶點中的應用。
8. 線粒體三功能酶α亞基在制備番荔枝內酯聚醚類似物AA005抑制脂質累積的藥物 靶標的應用。
9. 線粒體三功能酶α亞基作為藥物靶標在篩選調控脂質代謝的小分子化合物中的應 用。
【文檔編號】G01N33/68GK104237530SQ201410377168
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】王立順, 韓冰, 黃黎瑩 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院