硼替佐米對k562細胞株中dna甲基轉移酶表達的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種硼替佐米對K562細胞株中DNA甲基轉移酶表達的檢測方法，設置對照組與實驗組：將K562細胞置于含10％滅活新鮮小牛血清RPMI-1640培養液，在37℃，體積分數為5％CO2、飽和濕度條件下培養，保持細胞活力＞97％，取指數生長期的K562細胞（1×105/ml）分為對照組與實驗組（3）Annexin-V法流式細胞儀（FCM）檢測K562細胞凋亡率。本申請的方法能確定硼替佐米對K562細胞株中DNA甲基轉移酶表達的抑制效果，從而為硼替佐米在白血病中的研究提供了可靠依據。
【專利說明】硼替佐米對K562細胞株中DNA甲基轉移酶表達的檢測方 法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物學檢測技術，具體是指一種硼替佐米對K562細胞株DNA甲基轉 移酶表達的檢測方法。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化異常是人類惡性腫瘤及白血病的一種最常見的可以查明的分子異 常，DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMTs)活性增高是其重要原因，硼替佐米 (bortezomib，商品名：萬珂）是蛋白酶體抑制劑類抗腫瘤藥物，臨床主要用于治療復發及難 治性多發性骨髓瘤，在白血病治療方面的應用仍處于理論研究和探索階段。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種硼替佐米對 K562細胞株DNA甲基轉移酶表達的檢測方法。通過該方法能確定硼替佐米對K562細胞株 中DNA甲基轉移酶表達的抑制效果，從而為硼替佐米在白血病中的研究提供了可靠依據。
[0004] 為實現上述目的，本發明的技術方案是 (1) 設置對照組與實驗組：將K562細胞置于含10%滅活新鮮小牛血清RPMI-1640培 養液，在37 °C，體積分數為5% C02、飽和濕度條件下培養，保持細胞活力> 97%，取指數生 長期的K562細胞（1 X 105/ml)分為對照組與實驗組，實驗組分別加入6nmol/L、20nmol/L和 60 nmol/L的硼替佐米，分別作用時間分別為12 h、24 h和36 h;對照組加入無硼替佐米的 細胞培養液，相同條件下培養； 本步驟獲得以下實驗組和對照組： A組，不加任何處理的對照組；B組，6 nmol/L硼替佐米處理組；C組，20 nmol/L硼 替佐米處理組；D組，60nmol/L硼替佐米處理組； (2) 蛋白印跡法檢測胞內DNMT1表達：收集硼替佐米作用12 h后的各處理組細 胞，Western及IP細胞裂解液提取胞內蛋白，參照試劑盒說明用BCA方法測定蛋白濃 度，并調節濃度，每泳道取100 μ g上樣，于10 %十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)后，電轉至硝酸纖維膜，以β-actin為內參蛋白，加入兔抗人DNMT1多克隆抗 體、β-actin -抗，堿性磷酸酶標記山羊抗兔二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯 色，采用BandScan軟件分析各組蛋白條帶與相應β-actin的A值之比。實驗重復3次； (3) Annexin-V法流式細胞儀（FCM)檢測K562細胞凋亡率：收集硼替佐米各濃度處理 12-36 h的K562細胞IX 106個，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心棄上清，加入100 μ 1 Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V (20 mg/L)10 μ?，室溫避光 30 min，再加入 PI(50 mg/L)5 μ?，避光反應 5 min 后，加入 400 μ? Binding Buffer，立即用 FCM 進行定 量檢測，同時以不加 AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。單純FITC陽性（FITC + /PI-)細胞群為早期凋亡細胞。
[0005] 總之，本檢測方法研究證實了在硼替佐米的干預下，白血病K562細胞株的DNMT1 的表達水平下降，腫瘤細胞的生長受到抑制，凋亡率增加，本研究為硼替佐米在白血病治療 中的應用以及其他以DNMT1為靶點藥物在白血病中的研究提供了可靠依據，同時為白血病 的基因治療提供新思路。
[0006] 下面結合【具體實施方式】對本發明做進一步介紹。
【具體實施方式】
[0007] 下面通過實施例對本發明進行具體的描述，只用于對本發明進行進一步說明，不 能理解為對本發明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明 作出一些非本質的改進和調整。 實施例
[0008] 材料的選擇： K562細胞株由浙江大學醫學院血液病實驗室贈送；RPMI1640培養基、蛋白提取試劑 盒及實驗相關引物合成由南京凱基生物公司提供。RPMI-1640培養基為美國Gibco公司產 品，Annexin V -異硫氰酸 熒光素（FITC)凋亡試劑盒為美國Bipec公司產品，硼替佐米為美國Millennium公司 產品。兔抗人DNMTl、0_actin多克隆抗體為美國Cell-signaling公司產品，堿性磷酸酶 標志山羊抗兔二抗，BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自上海優寧維生物科技有限公司。
[0009] 檢測方法： (1) 設置對照組與實驗組：將K562細胞置于含10%滅活新鮮小牛血清RPMI-1640培 養液，在37 °C，體積分數為5% C02、飽和濕度條件下培養，保持細胞活力> 97%，取指數生 長期的K562細胞（1 X 105/ml)分為對照組與實驗組，實驗組分別加入6nmol/L、20nmol/L和 60 nmol/L的硼替佐米，分別作用時間分別為12 h、24 h和36 h;對照組加入無硼替佐米的 細胞培養液，相同條件下培養； 本步驟獲得以下實驗組和對照組： A組，不加任何處理的對照組；B組，6 nmol/L硼替佐米處理組；C組，20 nmol/L硼 替佐米處理組；D組，60nmol/L硼替佐米處理組； (2) 蛋白印跡法檢測胞內DNMT1表達：收集硼替佐米作用12 h后的各處理組細 胞，Western及IP細胞裂解液提取胞內蛋白，參照試劑盒說明用BCA方法測定蛋白濃 度，并調節濃度，每泳道取100 μ g上樣，于10 %十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)后，電轉至硝酸纖維膜，以β-actin為內參蛋白，加入兔抗人DNMT1多克隆抗 體、β-actin -抗，堿性磷酸酶標記山羊抗兔二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯 色，采用BandScan軟件分析各組蛋白條帶與相應β-actin的A值之比。實驗重復3次； (3) Annexin-V法流式細胞儀（FCM)檢測K562細胞凋亡率：收集硼替佐米各濃度處理 12-36 h的K562細胞IX 106個，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心棄上清，加入100 μ 1 Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V (20 mg/L)10 μ?，室溫避光 30 min，再加入 PI(50 mg/L)5 μ?，避光反應 5 min 后，加入 400 μ? Binding Buffer，立即用 FCM 進行定 量檢測，同時以不加 AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。單純FITC陽性（FITC + /PI-)細胞群為早期凋亡細胞。
[0010] 本申請檢測了硼替佐米干預K562細胞株后，DNMT1酶催化活性和細胞生活狀態 變化。用蛋白印跡法分析硼替佐米作用12 h后，發現胞內DNMT1的活性均下降，與對照組 相比，差異有統計學意義（P<〇. 05)。提示DNMT1轉錄水平及催化甲基轉移能力下降。同 時，研究還發現該作用在一定的濃度范圍內呈現明顯的濃度依賴性。
[0011] 本申請的檢測方法亦證實經硼替佐米處理K562細胞后，腫瘤細胞增殖減緩，凋亡 率增加。硼替佐米能有效地誘導K562細胞凋亡，細胞凋亡率隨硼替佐米濃度的升高而增 大，硼替佐米作用36 h后凋亡細胞比例顯著高于其他時間，細胞凋亡率與作用時間呈正相 關趨勢。
【權利要求】
1. 一種硼替佐米對K562細胞株中DNA甲基轉移酶表達的檢測方法，其特征在于： (1) 設置對照組與實驗組：將K562細胞置于含10%滅活新鮮小牛血清RPMI-1640培 養液，在37 °C，體積分數為5% C02、飽和濕度條件下培養，保持細胞活力> 97%，取指數生 長期的K562細胞（1 X 105/ml)分為對照組與實驗組，實驗組分別加入6nmol/L、20nmol/L和 60 nmol/L的硼替佐米，分別作用時間分別為12 h、24 h和36 h;對照組加入無硼替佐米的 細胞培養液，相同條件下培養； 本步驟獲得以下實驗組和對照組： A組，不加任何處理的對照組；B組，6 nmol/L硼替佐米處理組；C組，20 nmol/L硼 替佐米處理組；D組，60nmol/L硼替佐米處理組； (2) 蛋白印跡法檢測胞內DNMT1表達：收集硼替佐米作用12 h后的各處理組細 胞，Western及IP細胞裂解液提取胞內蛋白，參照試劑盒說明用BCA方法測定蛋白濃 度，并調節濃度，每泳道取100 μ g上樣，于10 %十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)后，電轉至硝酸纖維膜，以β-actin為內參蛋白，加入兔抗人DNMT1多克隆抗 體、β-actin -抗，堿性磷酸酶標記山羊抗兔二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯 色，采用BandScan軟件分析各組蛋白條帶與相應β -actin的A值之比；實驗重復3次； (3) Annexin-V法流式細胞儀（FCM)檢測K562細胞凋亡率：收集硼替佐米各濃度處理 12-36 h的K562細胞IX 106個，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心棄上清，加入100 μ 1 Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V (20 mg/L)10 μ?，室溫避光 30 min，再加入 PI(50 mg/L)5 μ?，避光反應 5 min 后，加入 400 μ? Binding Buffer，立即用 FCM 進行定 量檢測，同時以不加 AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照，單純FITC陽性（FITC + /PI-)細胞群為早期凋亡細胞。
【文檔編號】G01N33/68GK104142405SQ201410371771
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】吳圣豪, 鄭翠蘋, 陳松燕, 蔡小平, 石岳堅 申請人:溫州市中心醫院