一種用作結合對的特異性結合反應培養基的水溶液的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種作為用于結合對的特異性結合反應培養基使用的水溶液，其中第一結合成員識別其互補第二結合成員，該溶液含有：a)一種控制pH的緩沖液；b)選自下述基團的化合物A：-由通式IR1-[[CR2R3]p-O]q-R4定義的化合物，其中R1是氫或羥基，各元件的R2獨立地是氫或羥基，R3是氫、甲基、乙基，R4是氫或烷基，p是2到10的一個整數，q是1到100的一個整數，附帶條件是該化合物至少攜帶兩個羥基；-多元醇；-糖類；c)非離子洗滌劑。
【專利說明】一種用作結合對的特異性結合反應培養基的水溶液
[0001] 本申請是申請日為2004年2月26日、申請號為No. 200480042127. 4、發明名稱為 "一種用作結合對的特異性結合反應培養基的水溶液"的中國發明專利申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及用作結合對的特異性結合反應培養基的水溶液。
[0003] 發明背景
[0004] 公知使用一種或多種抗體在一種試樣中檢測試驗物質（分析物）的免疫測定技 術。免疫測定技術方法的發展增強了該試驗的敏感性。盡管在近些年來有所發展，但仍然 希望消除非特異性的結合反應、交叉反應以及基質之中存在的化合物的影響。
[0005] 免疫測定法取決于結合成員對的第一結合成員（如一種抗原或配體）與結合成員 對的第二結合成員（如一種抗體或受體）特異性結合的能力。為了測定這種結合的延續， 用可檢測部分標記含有這種結合成員的一方的共軛物。這種結合成員對可以是一種抗原和 針對該抗原的抗體。
[0006] 免疫測定法可以以競爭性的免疫測定法形式或以夾心免疫測定法形式進行。在競 爭性的免疫測定法形式中抗原可以被固定到固相材料上，而結合到固相材料上的可檢測部 分的數量能夠被檢出、計量并將其與試樣中存在的抗體的數量相關聯。固相材料的實例包 括珠子、顆粒、微粒等等。在夾心免疫測定法形式中，將含有例如一種抗體的試樣與一種蛋 白質例如抗原相接觸。所述抗原被固定在固相材料上。固相材料的實例包括珠子、顆粒、微 粒等等。所述固相材料通常用一種已被可檢測部分標記的第二抗原或抗體生成。然后分別 在所述固相材料上第二抗原或抗體分別與相應抗體或抗原結合，在一個或多個洗滌步驟以 去掉未結合的物質之后，加入一種指示劑物質例如顯色物質，使其與可檢測部分反應，產生 可檢測信號，如顏色變化。然后檢出該顏色變化，計量并將其與試樣之中存在的抗體數量相 關聯。此外應注意還需要各種稀釋劑和緩沖液用于優化處理微粒、抗原、共軛物及參與化學 反應的其他試驗組分。
[0007] 為了在免疫測定法中獲得最佳結果，用于結合伙伴之間結合反應（例如抗體和抗 原反應或配體和受體生成復合體）的溶液必須提供一種培養基以優化抗體結合抗原的能 力，或必須提供一種培養基以優化配體結合受體的能力，同時強有力的降低甚至防止非特 異性相互作用、低親合性結合和基質效應，以免生成錯誤信號。
[0008] 為了消除非特異性相互作用和交叉反應，有人在結合反應之后將洗滌劑加入洗滌 步驟所用的緩沖液中以去除非特異性結合。
[0009] 對于免疫測定法，像western印記分析、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)等，使用含有 補充有牛血清白蛋白和〇. 01到〇. 〇5(v/v) Tween? 20的磷酸鹽緩沖鹽水的溶液作為培 養基，用于結合伙伴（例如抗體和抗原）之間的結合反應。但是常常發現用現有技術的這 種緩沖液不能避免非特異性或低親合性結合、交叉反應和基質效應。例如，當研究一種涉及 多元分析物檢測的CRP試驗時，由于應用多元抗體而帶來的交叉反應和基質效應看來已成 為一個問題，其不能通過利用常規的免疫測定緩沖液解決。
[0010] 因此本發明的目的是提供一種溶液，作為用于結合成員對的特異性結合反應的培 養基使用，其中強有力的降低或甚至防止非特異性結合、低親合性結合、交叉反應和基質效 應。此外，本發明的目的是提供一種免疫測定方法，其中非特異性和低親合性結合、交叉反 應和基質效應被降低或防止。
[0011] 發明概述
[0012] 本發明的目的是通過使用一種水溶液作為用于結合成員對的特異性結合反應的 培養基而實現的，其中第一結合成員識別其互補的第二結合成員，該溶液含有
[0013] a)控制pH的一種緩沖液；
[0014] b)選自下組的化合物A :
[0015] -由通式I RHKRfL-OL-R4定義的化合物，其中R1是氫或羥基，各單元中R2獨 立地是氫或羥基，R 3是氫、甲基、乙基，R4是氫或烷基，P是2到10的一個整數，q是1到100 的一個整數，附帶條件是該化合物至少攜帶兩個羥基；
[0016] -多元醇；
[0017]-糖類；
[0018] c)非離子洗滌劑。
[0019] 在化合物A的通式I中，如果R4是氫，相鄰的殘基R2也是氫。如果R 1是羥基，相 鄰的殘基R2是氫。在一個優選【具體實施方式】中，化合物A的分子式中的q是從1到50的 一個整數，更優選從1到30。
[0020] 本發明的發明人意外地發現本發明的水溶液可以降低免疫測定中的交叉反應、基 質效應、非特異性結合和低親合性結合。此外，還發現使用本發明水溶液時可以防止嗜異性 的抗體（人抗小鼠抗體）帶來的影響。另外，即使在應用于血漿的情況下，用該緩沖液能夠 避免風濕（rheuma)因子、血紅蛋白、膽紅素和甘油三脂帶來的負效果。
[0021] 在這里"結合成員對"包括一個"第一結合成員"和一個"第二結合成員"。兩種結 合成員會彼此特異性結合。結合成員對的第一結合成員可以分別是抗原或配體。第二結合 成員（如分別為抗體或受體）特異性地識別并結合第一結合成員（如分別為抗原或配體）。 第二結合成員是相應的結合成員，因此也稱為"相應結合成員"。技術人員會理解術語"第 一"結合成員和"第二"結合成員分別可以是例如抗原和相應抗體，或反之亦然。
[0022] 本發明的水溶液代表一種通用緩沖液，其在各種基質（例如血漿，血清等）中進行 的免疫測定和結合反應中作為培養基。在應用多分析物的情況下，例如如果使用蛋白質芯 片，需要同步孵育幾個（或多個）分析物和幾個抗體，經常發生非特異性結合和交叉反應。 在很多情況下觀察到這種不希望得到的結合反應。利用現有技術公知的標準ELISA緩沖液 不能防止這種交叉反應影響。另外在現有技術中，與其它參照的方法相比，所采用的天然樣 品可導致基質效應，這會引起錯誤的測量值。在此術語"基質"指天然樣品（例如血清）之 中存在的所有化合物；術語"基質"特別是指有機的、尤其是生物化合物，例如蛋白質。
[0023] 本發明的水溶液分別可以用作結合對的結合反應的培養基，作為用于免疫測定和 結合反應的樣品稀釋緩沖液以及抗體和抗原的稀釋緩沖液。進一步可應用于多分析物免 疫測定和蛋白質分析（proteomics)，其中能夠防止不希望得到的突光體標記抗體的交叉反 應。熒光體標記抗體往往會以非特異性方式結合其它蛋白質。使用本發明的水溶液能夠避 免這種影響。
[0024] 在免疫測定如ELISA和蛋白質芯片中，使用本發明的緩沖液可以展示出進一步的 積極效果。當用本發明緩沖液孵育帶有固定抗體的表面時，該固定化抗體的活性有所增強。 這使得分析物與固定化抗體的結合增強。總之，本發明緩沖液除降低非特異性信號和非特 異性影響之外，還會增強分析物和抗體之間特異性結合反應陽性作用帶來的特異性信號。 這種固定化抗體活性的所致增強提供更高的相應試驗的敏感性。
[0025] 本發明的緩沖液可以用于免疫測定ELISA、EIA、FIA、側向流式試驗 (lateral-flow-test)、蛋白質芯片、多分析物試驗、western印記、點印記、免疫組織化學、 受體配體試驗和免疫PCR。
[0026] 發明詳述
[0027] 在本發明一優選【具體實施方式】中，該水溶液進一步包括與免疫阻斷非特異抗體結 合有效量的蛋白質。此蛋白質優選選自牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、胎牛血清。進一 步優選該蛋白質以〇. 1到2% (w/v)的濃度存在于水溶液中，更優選0. 5到1. 5% (w/v)范 圍。這些蛋白質不能被免疫測定所用的任何抗體識別。這種未被識別的蛋白質可以免疫阻 斷由樣品之中可能存在的分子或化合物帶來的非特異性抗體結合。
[0028] 在另一【具體實施方式】中，該水溶液含有選自下列的鹽：NaCl、KC1、NH4C1。進一步 優選該水溶液具有l〇〇mM到1. 5mM的離子強度，更優選200mM到1M，甚至更優選200mM到 800mM，特別更優選200mM到600mM，最優選250mM到500mM。本發明人意外地發現用作用于 結合反應的培養基的該緩沖液在200mM到600mM范圍內的高離子強度會進一步降低非特異 性結合和交叉反應，同時沒有負面影響特異性結合反應。
[0029] 在特定優選【具體實施方式】中，該水溶液緩沖液選自Tris(三（羥甲基）_氨基甲 烷）、Pipes (哌嗪-1，4-雙-2-乙烷磺酸）、Mes (4-嗎啉代乙烷磺酸）、ifepes (4-(2-羥乙 基）-1-哌嗪-乙烷磺酸）、磷酸鹽緩沖液。
[0030] 在另一優選【具體實施方式】中，化合物A選自下組：聚亞烷基二醇，聚丙二醇，丙二 醇，聚乙二醇，乙二醇，單糖，雙糖，三糖，蔗糖，甘露糖，海藻糖，多元醇，甘油和其混合物。在 一優選【具體實施方式】中化合物A的濃度在0.5到25 % (v/v)范圍之內，優選2.0到20 % (v/ v)，更優選2. 0到15 % (v/v)，進而更優選2. 0到10 % (v/v)，甚至更優選2. 0到7 % (v/v)， 最優選約5% (v/v)。如果化合物A是液相，該濃度則為％ (v/v)。如果該化合物A是固體 (例如糖類），該濃度應被理解為％ (w/v)。
[0031] 在另一優選【具體實施方式】中，該水溶液含有選自下述的通式化合物作為非離子洗 滌劑：
[0032] a)具有取代基R1和R2 (Rhph-R2)的取代的苯基，其中R1是C「C9烷基，R2 是-0-[CH2-CH2-0] a-H基團，其中" a"是5到40的一個整數，其中R2相對于R1在對位、間位 或鄰位；
[0033] b)
[0034]
【權利要求】
1. 一種在結合對的特異性結合反應過程中達到降低基質效應或者降低或防止因嗜異 性抗體引起的效應的體外方法，其中第一結合成員識別其互補的第二結合成員，其中所述 的特異性結合反應是在血漿或血清的基質中進行的，所述方法包括使用水溶液作為所述特 異性結合反應的介質，該水溶液含有 a) 控制pH的緩沖劑； b) 選自下組的化合物A : -由通式I ^-[[CI^inp-OL-R4定義的化合物，其中R1是氫或羥基，各單元中R2獨立地 是氫或羥基，R3是氫、甲基、乙基，R4是氫，P是2到10的整數，q是1到50的整數，附帶條 件是該化合物至少攜帶兩個羥基； -多元醇； 一糖類； c) 非離子型洗滌劑， 其中所述水溶液具有200mM-lM的離子強度。
2. 權利要求1的方法，其中所述的水溶液包含免疫阻斷非特異性抗體結合的有效量的 蛋白質。
3. 權利要求2的方法，其中所述蛋白質選自牛血清白蛋白，卵清蛋白、酪蛋白或胎牛血 清。
4. 權利要求2的方法，其中所述蛋白質的濃度在0. 1到2% (w/v)范圍之內。
5. 權利要求1的方法，其中所述的水溶液包含選自NaCl、KCl、NH4Cl的鹽。
6. 權利要求1的方法，其中所述水溶液具有200-800mM的離子強度。
7. 權利要求1的方法，其中所述水溶液具有250-800mM的離子強度。
8. 權利要求1的方法，其中所述緩沖劑選自：三（羥甲基）_氨基甲烷，哌 嗪-1，4-雙-2-乙烷磺酸，4-嗎啉代乙烷磺酸，4-(2-羥乙基）-1-哌嗪-乙烷磺酸，磷酸鹽 緩沖劑。
9. 權利要求1的方法，其中所述化合物A選自下組：聚亞烷基二醇，聚丙二醇，丙二醇， 聚乙二醇，乙二醇，單糖，雙糖，三糖，蔗糖，甘露糖，海藻糖，多元醇，甘油，和其混合物。
10. 權利要求1的方法，其中所述化合物A的濃度在2. 0到20% (w/v或v/v)范圍之 內。
11. 權利要求1的方法，其中所述化合物A的濃度在2. 0到15% (w/v或v/v)范圍之 內。
12. 權利要求1的方法，其中所述化合物A的濃度在2. 0到10% (w/v或v/v)范圍之 內。
13. 權利要求1的方法，其中所述化合物A的濃度在2.0到7% (w/v或v/v)范圍之內。
14. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑為通式化合物，其選自 a) 具有取代基R1和R2的取代的苯基O^-Ph-R2)，其中R1是Q-C；烷基，R 2 是-0-[CH2-CH2-〇] a-H基團，其中" a"是5到40的整數，其中R2相對于R1在對位、間位或鄰 位； b)
其中n、X、y及z都是5到40的整數，R是脂肪酸殘基。
15. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑選自：十二烷基聚（乙二醇醚）m，其 中m是5到40的整數；1-0-正辛基-β-D-吡喃葡糖苷（正辛葡糖苷）；烷基酚聚（乙二 醇-醚） m，其中m是5到40的整數；1-0-正十二烷基-β-D-吡喃葡糖基（1-4) α-D-批 喃葡糖苷；十二烷基聚_(乙二醇醚）m，其中m是5到40的整數；聚（氧化乙烯）（20)-脫 水山梨醇單脂肪酸酯；辛基酚聚（乙二醇醚），其中m是5到40的整數。
16. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑的濃度在0.1-1. 0% (v/v)范圍之 內。
17. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑的濃度在0.15-1. 0% (v/v)范圍之 內。
18. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑的濃度在0.2-1. 0% (v/v)范圍之 內。
19. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑的濃度在0.2-0. 8% (v/v)范圍之 內。
20. 權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑與化合物A的比率為1 :15到1 :25。
21. 權利要求1的方法，其中所述水溶液不含有二硫蘇糖醇。
22. 權利要求1的方法，其中pH被調整在5. 6到9. 6范圍內。
23. 權利要求1的方法，其中所述水溶液能夠防止KD值高至1(Γ7Μ的低親合性結合。
24. 權利要求1的方法，其中所述水溶液能夠防止KD值高至Hr%的低親合性結合，并 將KD值為10_7Μ到10_8Μ范圍內的中親合性結合降低至少90%。
25. 權利要求1的方法，其中所述水溶液能夠防止KD值為高至1(Γ7Μ的低親合性結合， 并將K D值為10_7Μ到10_9Μ范圍內的中親合性結合降低至少90%。
26. 權利要求1的方法，其中所述水溶液能夠增強抗體的結合活性。
27. 權利要求1到26的任一項的方法，其中所述結合反應是抗體抗原結合反應。
28. 權利要求1到26的任一項的方法，其中所述結合反應是受體配體結合反應。
29. 權利要求1到26的任一項的方法，其中所述水溶液用作樣品及試劑的稀釋緩沖液 或用作洗滌緩沖液。
30. 權利要求1的方法，其中所述被降低或防止的因嗜異性抗體引起的效應是所述嗜 異性抗體與反應中使用的抗體的結合。
31. 權利要求1的方法，其中所述被降低或防止的因嗜異性抗體引起的效應是所述嗜 異性抗體與反應中使用的俘獲抗體的結合。
32. 權利要求1的方法，其中所述被降低或防止的因嗜異性抗體引起的效應是所述嗜 異性抗體與反應中使用的檢測抗體的結合。
33.權利要求1的方法，其中所述嗜異性抗體為人抗小鼠抗體。
【文檔編號】G01N33/53GK104090097SQ201410365848
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2004年2月26日 優先權日:2004年2月26日
【發明者】P·勞赫, T·波利夫克, A·策爾默 申請人:康多爾生物技術有限公司