一種檢測載脂蛋白a5以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測載脂蛋白A5(ApoA5)以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒，包含有二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體和酶標抗ApoA5的單克隆抗體、封閉液、酶底物溶液、包被緩沖液、終止液、洗滌液、酶標板；二株未標記抗ApoA5單克隆抗體包被于酶標板作捕獲抗體，酶標抗ApoA5單克隆抗體為檢測抗體，包被緩沖液為0.05mol/l、pH9.6的碳酸鹽緩沖液，其中1升溶液中含1.59g?Na2CO3和2.93g?NaHCO3，封閉液為質量濃度1％牛血清白蛋白；酶底物溶液為60μg/ml的3，3’，5，5’四甲替聯苯胺和質量濃度為0.05％H2O2的0.1mol/l、pH6.0磷酸鹽緩沖液；終止液為1mol/lH2SO4溶液。本發明用二株單克隆抗體包被于酶標板以捕捉人體血液中的ApoA5，提高抗體捕獲能力，提高測定的靈敏度和準確度及線性范圍，達到檢驗與臨床要求。
【專利說明】一種檢測載脂蛋白A5以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及載脂蛋白A5(ApoA5)作為高甘油三酯血癥(HTG)診斷的生化指標，抗ApoA5抗體對的制備技術，酶標記顯色免疫反應技術和利用ApoA5的抗體來診斷高甘油三酯血癥(HTG)的【技術領域】，特別涉及一種定量檢測ApoA5以診斷高甘油三酯血癥(HTG)的試劑盒。
【背景技術】
[0002]臨床上檢測血脂的項目有很多，各醫院普遍檢查的基本項目有總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、載脂蛋白(Apo)B、Apo Al、脂蛋白(a) [Lp (a)]等。調查資料研究表明，高甘油三酯、高膽固醇、低的高密度脂蛋白-C(HDL-C)和高的低密度脂蛋白-C(LDL-C)共同構成了冠心病的危險因素。載脂蛋白(Apo)異常與冠心病和中風密切相關。盡早進行正確診斷，有利于早期防治這些嚴重的疾病。載脂蛋白檢測試劑的開發，有助于冠心病和中風的有效防治。
[0003]血清ApoAI可以代表HDL水平，與HDL-C呈正相關，其臨床意義也大體相似。但是，HDL是一系列顆粒大小與組成不均一的脂蛋白，病理狀態下HDL亞類與組成往往會發生變化，故ApoAI的升降不一定與HDL-C變化完全成比例。Ap0BlOO大約有有90%的比例分布在LDL中，所以血清ApoB主要代表LDL水平，它與血清LDL-C水平呈明顯正相關，ApoB水平高低的臨床意義也與LDL-C相似。但是，在少數情況下，可出現高ΑροΒΙΟΟ血癥而LDL-C濃度正常的情況，所以這兩種載脂蛋白可靠性和準確性都不十分令人滿意。
[0004]ApoA5屬于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝臟表達，與HDL/VLDL有關。ApoA5基因啟動子的單核苷酸變異(SNP)直接影響甘油三酯水平。實驗研究表明，在表達人類ApoA5轉基因的小鼠的血漿中甘油三酯的濃度下降為對照鼠的三分之一，而在缺少該基因的小鼠中卻增加了 4倍。ApoA5作為高甘油三酯血癥的病因診斷指標具有很高的敏感性和特異性。
[0005]高水平甘油三酯可使小密低密度脂蛋白(sLDL)濃度升高，具有較強的致動脈粥樣硬化作用。甘油三酯水平越高，低密度脂蛋白中的膽固醇酯越多。人們已經證實，動脈粥樣硬化斑塊中的膽固醇主要來自于低密度脂蛋白，低密度脂蛋白既是血漿中含膽固醇最多的，也是致動脈粥樣硬化性最強的脂蛋白。另外，流行病學研究表明，高水平甘油三酯使高密度脂蛋白濃度下降，高密度脂蛋白濃度受甘油三酯水平的影響，兩者呈負相關。近來研究表明，血甘油三酯水平異常與體內凝血因子異常密切相關，血漿甘油三酯水平升高可以導致體內凝血因子水平升高，從而促進血凝，并可使組織型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)合成增加，抑制纖維蛋白溶解，形成高凝狀態，促進冠心病的發生。有實驗結果表明，甘油三酯濃度上升lmmol/L，心血管意外發生率男性上升32 %，女性為76 %。在校正高密度脂蛋白的影響后，危險率男性上升14%，女性為37%。這些結果表明血清甘油三酯濃度升高是心血管疾病的重要危險因素。
[0006]高甘油三酯血癥患者常同時有高血壓和胰島素抵抗。胰島素抵抗通常指患者有傾向于非胰島素依賴糖代謝異常，該類患者常較早地形成冠狀動脈疾病。通常將脂質三聯癥、高凝狀態、高血壓、胰島素抵抗稱為代謝綜合征。已證實高甘油三酯血癥患者常合并有代謝綜合征中的其它異常。高甘油三酯血癥的臨床意義在于此。而作為直接影響甘油三酯水平的指標ApoA5顯得尤為重要，ApoA5的單核苷酸多態性有望作為風險指示標和降低血脂濃度的治療靶點。
[0007]本發明就是將ApoA5通過ELISA實驗應用于臨床實踐以達到高甘油三酯血癥的病因診斷，以及冠心病和中風等心血管疾病有效防治的目的。
[0008]ApoA5的酶聯免疫定量測定，絕大部分運用了二株抗體，如專利200610018747.5，一株單克隆抗體為捕獲抗體，另一株單克隆抗體(或多克隆抗體)為標記抗體，形成酶聯夾心法測定ApoA5。但這一方法測定ApoA5的線性范圍窄，因此其測定靈敏度和準確度都受到限制。
【發明內容】
[0009]本發明的目的為了克服現有ApoA5的酶聯免疫定量測定運用二株抗體存在的缺點，而提供一種檢測ApoA5以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒，本發明結合三明治抗體技術以及針對ApoA5的抗體對開發技術研制出了三抗法定量測定ApoA5試劑盒，用二株單克隆抗體替代傳統方法中的一株單克隆抗體為捕獲抗體，提高了抗體捕獲能力，提高了測定的靈敏度和準確度，以及線性范圍，使在普通酶標儀上定量檢測ApoA5，達到檢驗與臨床要求。本發明利用ApoA5作為HTG診斷的生化指標，制備抗ApoA5的單克隆抗體對，以及利用改進了的酶聯免疫法(ELISA)定量測定人血清中ApoA5的濃度，而對高甘油三酯血癥進行病因診斷，從而達到冠心病和中風等心血管疾病的有效防治。
[0010]本發明的目的是通過如下技術方案實現的:
[0011]—種檢測ApoA5以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒,試劑盒內包含有二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體和另一株酶標抗ApoA5的單克隆抗體、封閉液、酶底物溶液、包被緩沖液、終止液、洗滌液、酶標板；其特征在于:以二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體均勻包被于單位面積的酶標板上作為捕獲抗體，以另一株酶標抗ApoA5的單克隆抗體為檢測抗體，包被緩沖液為0.05mol/l、pH9.6的碳酸鹽緩沖液，其中I升溶液中含1.59gNa2C03和2.93gNaHCO3,封閉液為質量濃度I %牛血清白蛋白；酶底物溶液為60 μ g/ml的3，3’，5，5’四甲替聯苯胺(TMB)和質量濃度為0.05% H2O2的0.lmol/1、pH6.0磷酸鹽緩沖液；終止液為Imol/IH2SO4 溶液。
[0012]所述的二株未標記抗ApoA5單抗隆抗體按1:0.1 一 9混勻，同時均勻包被于單位面積的酶標板孔上。
[0013]所述的二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體記為Abl+Ab2 ;另一株抗ApoA5的單克隆抗體記為Ab3，Ab3標記辣根過氧化物酶HRP后記為Ab3-HRP ;從而有Abl+Ab2與ApoA5結合，ApoA5與Ab3-HRP結合，先后形成Abl+Ab2?ApoA5?Ab3_HRP反應鏈，此為本發明三抗法定量測定ApoA5試劑盒的核心。Abl、Ab2、Ab3要求作用于ApoA5抗原的不同位點，Abl+Ab2與Ab3分別配對后對ApoA5抗原有較好的結合力及較高的特異性，先后形成Abl+Ab2?ApoA5?Ab3-HRP反應鏈，HRP使顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)顯色，再通過酶標儀測定OD值，根據標準曲線計算求得待測樣品ApoA5的含量。
[0014]所述抗ApoA5的抗體為單克隆抗體對。
[0015]所述抗ApoA5單克隆抗體用純化的ApoA5免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細胞，融合該脾臟細胞和小鼠的骨髓瘤細胞系SP2/0 ;利用HAT選擇培養基選擇雜交瘤細胞，并利用ELISA方法篩選鑒定產生抗ApoA5抗體的細胞；進行三次克隆化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細胞株，保存所篩選到的產生與ApoA5高特異性結合的單抗的細胞株，通過小鼠腹水生產抗ApoA5的單抗。再利用Protein A-SePharose親和層析柱進一步純化腹水中抗ApoA5的單抗，ELISA及Western-Blot鑒定分離純化的單抗。
[0016]抗ApoA5單抗隆抗體對的篩選，主要采用抑制法篩選高親和力的亞克隆，進而在多次克隆化和ELISA相加實驗結果的基礎上進行競爭抑制表位分析和親和力的測定，得到不同表位的單抗細胞株，進一步生產腹水并純化得到多量抗體，進行單株標記，采用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后采用ELISA競爭抑制法進行單標抗體表位測定，從而篩選出高效親和力的三明治抗體對。
[0017]酶標抗ApoA5的單克隆抗體采用的是過碘酸鈉法辣根過氧化物酶標記抗體。以Na14先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與ApoA5的單克隆抗體即免疫球蛋白上的氨基相結合，進一步用NaBH4還原生成穩定的酶標記抗體。透析純化后離心去除沉淀，上清即為酶-抗體結合物。
[0018]將二株未標記抗ApoA5單抗隆抗體按1:0.1 — 9均勻包被于單位面積的酶標板孔上，包被緩沖液為0.05mol/l、pH9.6的碳酸鹽緩沖液，即I升溶液中含1.59g Na2CO3和
2.93g NaHCO30封閉液為質量濃度I %牛血清白蛋白；酶底物溶液為60 μ g/ml的3，3’，5，5’四甲替聯苯胺(TMB)和質量濃度為0.05% H2O2的0.lmol/l、pH6.0磷酸鹽緩沖液；終止液為ImoVlH2SO4溶液。
[0019]與現有檢測指標和技術及產品相比，本發明有突出的優點和實用性:
[0020]1、檢測特異性強而實用。ApoA5屬于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝臟表達，與HDL/VLDL有關。ApoA5基因啟動子的單核苷酸變異(SNP)直接影響甘油三酯水平。ApoA5作為高甘油三酯血癥的病因診斷指標具有很高的敏感性和特異性。本發明避免了目前市場上的同類產品只能單純表現結果，卻不能明確說明病因的缺點。高甘油三酯血癥一經查出是ApoA5基因突變原因引起，即可針對病因進行相應治療，從而從根本上解決高甘油三酯血癥及其引發的相關疾病的預防和治療。
[0021]2、檢測靈敏度和準確度高，以及線性范圍大。人血液中ApoA5的濃度范圍變化很大，約為20-410ng/ml很低，平均約為215ng/ml。本發明結合三明治雙抗體技術以及針對ApoA5的抗體對開發技術研制出了三抗法定量測定ApoA5試劑盒，用二株單克隆抗體替代傳統方法中的一株單克隆抗體為捕獲抗體，提高了抗體捕獲能力，提高了測定的靈敏度和準確度，以及線性范圍，使在普通酶標儀上定量檢測ApoA5達到檢驗與臨床要求。
[0022]本發明實驗結果及分析:
[0023]ELISA檢測不同樣品中ApoA5的濃度，利用所制備的抗ApoA5的單克隆抗體對，采用三抗ELISA方法，測定不同樣品中ApoA5的濃度。結果如下表和圖1。
[0024]抗體:抗ApoA5, 0.1 μ g/ml, 100 μ I/孔；封閉液:1% BSA。由測定結果可見,三抗ELISA方法對ΑροΑ5的檢測下限即靈敏度為30ng/ml左右，接近高加索白人血清的ApoA5濃度的最低值(24ng/ml),遠低于亞洲人ApoA5濃度的最低值(91ng/ml),以及遠遠低于人血液中ApoA5的平均濃度(215ng/ml)。
[0025]
陰性約照50100200?00800
-挑稀釋1? BSAng/iing/iilng/nilηκ* mlngfml
L 1:3(100 O* IBl 0.!79 0,510 §,530 O, §62 0,948 L 301 1.299 L 803 1.79? 2.20? 2.19SB, 1:4000 0.1^2 0.tHH 0.η 0,551 0._ 0.901 L 322 L 338 1.THH 1.772 陽 2-1-1?
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明的ΑροΑ5濃度與不同二抗稀釋度的吸光度的曲線圖。
【具體實施方式】
[0027]高甘油三酯血癥(HTG)診斷試劑盒的生產方法:
[0028]1、ΑροΑ5的單克隆抗體對的制備
[0029]用純化的ΑροΑ5作為抗原分別免疫BALB/c小鼠，間隔21天免疫第二次，以后每間隔10天免疫一次，共免疫3 — 4次，然后取出免疫小鼠的脾臟細胞，用PEG將該脾臟細胞與小鼠的骨髓瘤細胞系SP2/0進行融合，利用HAT選擇性培養基在96孔細胞培養板上篩選雜交瘤細胞，用ELISA方法鑒定抗ApoA5的細胞株，進行三次克隆化后得到穩定分泌高特異性單克隆抗體的細胞株，在相同抗原包被板上采用ELISA抑制法，即參照組中加入細胞培養上清，在抑制組加入細胞培養上清和抗原混合物，比較兩組OD值差異從而篩選出高親和力的亞克隆。然后在間接ELISA實驗上進行相加法表位分析，即參照組中分別加入兩個單株細胞培養上清，測定組中同時加入兩株細胞培養上清，比較兩組OD值(Al、A2和A1+2)，通過下面公式計算:
9 Λ.
[0030]Al= -...............-...............-.........:......-..................4 X 100%
Λ； +Λ:
[0031]在比較計算結果的基礎上進行表位分析和親和力的測定，Al值小于50%為相加陰性，即兩細胞株分泌的抗體識別抗原的表位相同，Al值大于50%為相加陽性，表示兩細胞株之間無競爭，即兩細胞株分泌的抗體識別抗原的兩個不同的表位，從而初步得到針對抗原不同表位的單抗細胞株。進一步將得到的單抗細胞株分別注射入小鼠腹腔進行腹水生產，利用Protein A-Sepharose親和層析柱純化腹水得到多量單克隆抗體,用HRP酶對純化的抗體進行單株標記，用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后用ELISA競爭抑制法在參照組中加入酶標抗體，在測定組中加入酶標抗體和未標記待測抗體混合物，比較兩組OD值，參照組OD值大于測定組OD值的表示存在競爭抑制，視為兩抗體識別抗原的表位相同。反之，兩抗體不存在競爭抑制時視為兩抗體識別抗原的表位不同，從而最終篩選得到高效親和力的三明治抗體對。
[0032]2、酶標記抗ApoA5單克隆抗體的方法
[0033]酶標抗ApoA5的單克隆抗體采用的是過碘酸鈉法辣根過氧化物酶標記抗體。稱取HRP溶解蒸餾水中。加入新配的0.lmol/1、Na14溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。Na14先將HRP表面的糖分子氧化成醛基。上述溶液裝入透析袋中，加Im mol/l、PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。加0.2mol/l、PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0?9.5,然后立即加入ApoA5的單克隆抗體,在0.0lmol/1碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。待醛化的HRP與ApoA5的單克隆抗體即免疫球蛋白上的氨基相結合后，再加新配的4mg/ml NaBH4液，置4°C 2小時，NaBH4將其還原生成穩定的酶標記抗體。上述液裝入透析袋中，在0.15mol/l、pH7.4PBS透析，4°C過夜。透析純化后離心去除沉淀，上清即為酶一抗體結合物(Ab3-HRP)。
[0034]3、各種緩沖液及試劑的配制方法
[0035]①包被緩沖液:0.05mol/l、ρΗ9.6 的 Na2CO3-NaHCO3 =Na2CO3(MW105.99) 1.59g 和NaHCO3(MW84.01)2.93g，加蒸餾水至 1000ml。
[0036]②封閉液:1%牛血清白蛋白(BSA)溶液:牛血清白蛋白Ig;加磷酸鹽緩沖液(PBS)(配制如下)至100ml。
[0037]0.01mol/l、ρΗ7.4 的 PBS 溶液:NaCI (MW58.44) 8.0g，KCl (MW74.55) 0.2g，KH2PO4 (MW136.09)0.24g, Na2HPO4.12H20 (MW358.14)3.6g，加蒸餾水至 1000ml。
[0038]③洗滌液:ρΗ7.4 的 PBS — Tween-20，在 100ml0.0lmol/1、ρΗ7.4 的 PBS 溶液中加
0.5ml 吐溫-20 (Tween-20)即可。
[0039]④酶底物3，3 ’，5，5 ’四甲替聯苯胺(TMB)溶液:
[0040]i)四倍的底物緩沖液:稱取35.8g Na2HPO4.12H20 ;稱取21.1g檸檬酸；各加超純水至500ml即分別獲得A母液B母液，取A液300ml，用B液調PH值至5.2即得，使用時四倍稀釋。
[0041]ii)TMB濃縮液:準確稱量粉劑TMB400mg加入1ml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得四十倍的TMB底物濃縮液。
[0042]i i i)工作液配制:1ml底物緩沖液中加入0.025ml TMB濃縮液完全混勻后4 μ 130%的雙氧水即可，臨用前現配。
[0043]⑤終止液:lmol/1 H2SO4溶液:濃硫酸(95-98% )54.3ml，加蒸餾水至100rnl即可，配時將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊混勻。
[0044]高甘油三酯血癥(HTG)診斷試劑盒的操作步驟:
[0045]1、制定標準曲線
[0046]將二株純化的未標記抗ApoA5單克隆抗體溶液Abl與Ab2按1:1比例混勻，然后用包被緩沖液稀釋到0.1μ g/ml，加入到96孔酶標板中，每孔100 μ 1，37°C包被I小時或4°C過夜；洗滌液洗板3次，甩干，加入I % BSA封閉，每孔200 μ 1，37°C封閉I小時；不洗，甩干，分別加入0、50、100、200、400、800ng/ml的ApoA5標準抗原，每孔100μ 1，37°C孵育I小時；洗滌液洗板3次，甩干，加入酶標記的抗ApoA5單抗(Ab3-HRP)溶液(用洗滌液稀釋到
0.1 μ g/ml)，每孔100 μ 1，37°C孵育I小時；洗滌液洗板3次，甩干，加入酶底物(TMB)工作液，每孔100 μ 1，避光顯色5分鐘，加入終止液，每孔50 μ I。利用酶標儀在450nm波長測定光吸收值(A450nm)，以濃度(ng/ml)為橫坐標，A450nm為縱坐標，繪制標準曲線。
[0047]2、測定血清中的ApoA5濃度
[0048]將純化的二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體溶液Abl與Ab2按1:1比例混勻，單克隆抗體混合液(Abl+Ab2)用包被緩沖液稀釋到0.1 μ g/ml，加入到96孔酶標板中，每孔ΙΟΟμ 1，37°C包被I小時或4°C過夜；洗滌液洗板3次，甩干，加入1% BSA封閉，每孔200μ 1，37°C封閉I小時；不洗，甩干，加入適當倍數稀釋的待檢測血清，每孔ΙΟΟμ 1，37°C孵育I小時或4°C過夜；洗滌液洗板3次，甩干，加入酶標記的抗ApoA5單抗溶液(Ab3_HRP)，用洗滌液稀釋到0.1 μ g/ml，每孔ΙΟΟμ 1，37°C孵育I小時；洗滌液洗板3次，甩干，加入酶底物(TMB)工作液，每孔100 μ 1，避光顯色5分鐘，加入終止液，每孔50 μ I。利用酶標儀在450nm波長測定光吸收值(A450nm)，根據標準曲線，由所測得的A450nm值，計算求得血清中ApoA5的濃度。
[0049]3、結果判定
[0050]根據ApoA5作為高甘油三酯血癥(HTG)病因診斷指標的截斷值(cut off值)215ng/ml,濃度低于該值的可判定為ApoA5缺乏,有高甘油三酯血癥的危險；或可判定ApoA5基因突變為高甘油三酯血癥的主要病因。
【權利要求】
1.一種檢測載脂蛋白A5(ApoA5)以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒，試劑盒內包含有二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體和另一株酶標抗ApoA5的單克隆抗體、封閉液、酶底物溶液、包被緩沖液、終止液、洗滌液、酶標板；其特征在于:以二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體均勻包被于單位面積的酶標板上作為捕獲抗體，以另一株酶標抗ApoA5的單克隆抗體為檢測抗體，包被緩沖液為0.05mol/l、pH9.6的碳酸鹽緩沖液，其中I升溶液中含1.59gNa2CO3和2.93g NaHCO3，封閉液為質量濃度1%牛血清白蛋白；酶底物溶液為60 μ g/ml的3，3，，5，5，四甲替聯苯胺(TMB)和質量濃度為0.05% H2O2的0.lmol/1、pH6.0磷酸鹽緩沖液；終止液為ImoVlH2SO4溶液。
2.根據權利要求1所述檢測ApoA5以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒，其特征在于:所述的二株未標記抗ApoA5單抗隆抗體按1:0.1 — 9混勻，同時均勻包被于單位面積的酶標板孔上。
3.根據權利要求1所述檢測ApoA5以診斷高甘油三酯血癥的試劑盒，其特征在于:所述的二株未標記抗ApoA5的單克隆抗體記為Abl+Ab2 ;另一株抗ApoA5的單克隆抗體記為Ab3，Ab3標記辣根過氧化物酶HRP后記為Ab3-HRP ;從而有Abl+Ab2與ApoA5結合，ApoA5與Ab3-HRP結合，先后形成Abl+Ab2?ApoA5?Ab3_HRP反應鏈，此為本發明三抗法定量測定ApoA5試劑盒的核心。
【文檔編號】G01N33/577GK104165992SQ201410362427
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】錢金宏, 廖園園, 廖偉 申請人:武漢璟泓萬方堂醫藥科技股份有限公司