膀胱腫瘤相關抗原檢測試劑盒的制作方法

膀胱腫瘤相關抗原檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種膀胱腫瘤相關抗原檢測試劑盒。試劑盒包含兩株特異性膀胱腫瘤相關抗原(BTAA)單克隆抗體。多孔板上包被的單克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體以及被測樣本的膀胱腫瘤相關抗原形成“包被抗體-抗原-HRP標記抗體”的夾心復合物結構。HRP進而與底物反應產生信號，用以進行膀胱腫瘤相關抗原定量分析。通過本發明的試劑盒，使得能夠迅速、靈敏地定量檢測樣本中的膀胱腫瘤相關抗原含量。
【專利說明】膀胱腫瘤相關抗原檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子免疫學領域，具體涉及檢測樣本中膀胱腫瘤相關抗原含量的試劑 盒。

【背景技術】
[0002] 膀胱癌是我國最常見的泌尿系腫瘤，大約90%的膀胱癌為膀胱尿路上皮癌。膀胱 癌的復發率很高，60% -70%的患者可能復發，11%復發的患者可進展為浸潤性腫瘤。目前 對于膀胱癌診斷及隨訪主要依賴于膀胱鏡檢查和尿細胞學檢查，患者依從性差，價格比較 昂貴，不易作為常規鏡檢；患者雖然特異度高且無創，但對低度表淺性的腫瘤敏感性低，容 易產生假陰性的結果。因此，尋找敏感度及特異度高的膀胱腫瘤標志物作為膀胱癌的早期 診斷、檢測以及預后評估受到越來越多的關注。
[0003] 膀胱腫瘤是泌尿系統最常見的腫瘤，其中以膀胱移行細胞癌（bladder transitional cell carcinoma, BTCC最多見）。BTCC生物學行為復雜多變，表現為易復 發、多發、浸潤和轉移，所以這些因素容易影響到對膀胱癌的診斷和治療。目前，膀胱癌的診 斷主要依靠尿脫落細胞學和膀胱鏡檢查，膀胱鏡檢查屬于侵入性檢查，患者較痛苦，某些情 況下尚有導致尿路感染的可能性，因而不適用于膀胱癌的群體性篩查。其他檢查方法，如尿 脫落細胞學檢查雖然特異度高，但是靈敏度較差，容易受到尿路感染等因素的干擾。一般來 講，一種新的臨床早期診斷和檢測方法應該具有非侵入性的特點，同時具有較好的靈敏度 和特異度，并且兼顧操作簡便，使用成本低。因此，尋找靈敏度高、特異度強，并且便于群體 性篩查的無創性檢查方法是近年來膀胱癌臨床研究的熱點。
[0004] 建立一種簡便快速、特異度強并且不具有侵入性的檢查方法有利于膀胱癌的早期 診斷，對善預后以及檢測復發都具有重要意義。


【發明內容】

[0005] 根據一些實施方式，提供了一種檢測樣本中膀胱腫瘤相關抗原的試劑盒，其包 含：
[0006] 包被有第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體的多孔板、
[0007] 樣品稀釋液、
[0008] 酶工作液、
[0009] 化學發光液。
[0010] 在一些實施方案中，包被有第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體的多孔板中第一膀 胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9317或9318的雜交瘤細胞所產生。 [0011] 當多孔板上的單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所產生時，則 酶工作液中的單克隆抗體由本發明的另一株雜交瘤細胞產生；反之亦然，當多孔板上的單 克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所產生時，則酶工作液中的單克隆抗體 由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞產生。
[0012] 在一些實施方案中，樣品稀釋液包含氯化鈉、山羊血清、吐溫-20、和防腐劑。在具 體實施方案中，樣品稀釋液包含30g/L氯化鈉、25ml/L山羊血清、5ml/L吐溫-20和0. 5ml/ L Proclin-300。樣本稀釋液可以配制成濃縮型，也可以不是。技術人員可以理解，其它濃 縮倍數也包括在本發明范圍內。
[0013] 在一些實施方案中，酶工作液包含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、小牛血清、辣 根過氧化物酶標記的第二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體和防腐劑。在一些實施方案中，第 二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9318或9317的雜交瘤細胞所產生。 在具體實施方案中，酶工作液包含5. 8g/L磷酸氫二鈉、0. 593g/L磷酸二氫鈉、8. Og/L氯化 鈉、200ml/L小牛血清、0. 5ml/L Proclin-300和0. 4 mg/L辣根過氧化物酶標記的第二膀胱 腫瘤相關抗原單克隆抗體。
[0014] 在一些實施方案中，化學發光液包含化學發光液A和化學發光液B。所述化學發光 液A含有魯米諾和發光增強劑。化學發光液B含有過氧化物和發光增強劑。
[0015] 應當理解，本發明的各試劑可以配制成濃縮型，也可以不是。在一些實施方案中， 一些試劑配制成濃縮型，這可以減少運輸、儲存體積。技術人員可以理解，除了具體實例以 外的其它濃縮倍數也包括在本發明范圍內。
[0016] 在一些實施方案中，樣本來自哺乳動物，優選來自人類。樣本選自全血、血漿、和血 清。在具體實施方案中，樣本為人尿液。
[0017] 在一些實施方案中，本發明的試劑盒還可以根據需要包括校準品。校準品用于標 準曲線的繪制。在具體實施方案中，校準品包含已知濃度的膀胱腫瘤相關抗原純品，膀胱腫 瘤相關抗原的濃度在l〇ng/ml至4000ng/ml范圍內。在具體實施方案中，校準品中膀胱腫 瘤相關抗原的分別濃度為400、200、50、10、5、0 ng/ml。技術人員理解，其它濃度同樣適用， 例如只需三個濃度點就足以建立一條標準曲線。
[0018] 在一些實施方案中，本發明的試劑盒還可以根據需要包括質控品。在具體實施方 案中，質控品為已知膀胱腫瘤相關抗原濃度的高值尿液樣本稀釋而成。在具體實施方案中， 高值質控的濃度在160 ng/ml至240ng/ml范圍內；低值質控的濃度在16 ng/ml至24ng/ ml范圍內。
[0019] 根據一些實施方案，提供了一種膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體，其由保藏號為 CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所產生。
[0020] 根據另一些實施方案，提供了一種膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體，其由保藏號為 CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所產生。
[0021] 根據另一些實施方案，提供了選自如下一種或兩種的膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗 體在制備檢測試劑中的用途：由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所產生的膀胱腫瘤 相關抗原單克隆抗體、和由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所產生的膀胱腫瘤相關 抗原單克隆抗體。在一個具體實施方案中，保藏號為CGMCC No. 9317和9318的雜交瘤細胞 所產生兩株單克隆抗體共同用于制備檢測試劑。所述檢測試劑選自ELISA檢測試劑、免疫 比濁檢測試劑、磁顆粒檢測試劑、化學發光檢測試劑、免疫熒光檢測試劑和放射免疫檢測試 齊?;優選化學發光檢測試劑；更優選所述檢測試劑為檢測膀胱腫瘤相關抗原的檢測試劑。
[0022] 根據一些實施方案，提供一種雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCCNo. 9317。根據另一些 實施方案，提供一種雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCC No. 9318。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1 :采用本發明的試劑盒繪制的校準曲線。

【具體實施方式】
[0024] 為了使本發明易于理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明。以下提供了本 發明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是，這些僅僅是示例性的， 并不意圖限制本發明，與如下試劑和儀器的類型、型號、品質、性質或功能相同或相似的材 料均可以用于實施本發明。
[0025] 實施例1.單克隆抗體的制備與鑒定
[0026] 1.免疫 Balb/c 小鼠
[0027] 選取6周齡、體重約20g的雌性Balb/c小鼠，初次免疫，取Factor Η純品（購自 Fitzgerald，目錄號30C-CP2038U) 20-50 μ g加弗氏完全佐劑皮下多點注射，第14和28天 分別進行第二次和第三次免疫劑量同上，加弗氏不完全佐劑腹腔內注射，融合前3天加強 免疫，劑量20-50 μ g為宜，3天后，取脾融合。
[0028] 2.細胞融合的步驟
[0029] 制備飼養細胞層：取一只未免疫的Balb/c小鼠，6周齡，拉頸處死，浸泡在75%酒 精內5min，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用無菌注射器注入6ml預冷的培養液（嚴禁刺 破腸管），反復沖洗，吸出沖洗液，沖洗液放入l〇ml離心管，1200 rpm/分離6min，用20% (v/v)胎牛血清（FCS)的培養液混懸，調整細胞數至lX105/ml，加入96孔板，100μ 1/孔， 放入37°C C02孵箱培養。
[0030] 制備免疫脾細胞：取免疫好的Balb/c小鼠，拉頸處死，無菌取脾臟，用10ml不完全 培養液洗一次，脾臟研碎，過200目細胞篩，將脾細胞轉移至10ml離心管中，800rpm離心10 min，細胞用10ml培養液洗2次，細胞計數，取1 X 108脾淋巴細胞懸液備用。
[0031] 制備骨髓瘤細胞SP2/0 :取對數生長骨髓瘤細胞離心，用無血清培養液洗2次，計 數，取得5 X107細胞備用。
[0032] 細胞融合：將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 :10的比例混合在一起，在50ml離心管中 用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm，8min ;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影 響聚乙二醇（PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。
[0033] 加入37°C預溫的lml 45% (g/100ml)PEG(分子量4000)溶液，邊加邊輕微搖動。 37°C水浴作用90s。加37°C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、 21111、31111、41111、51111和61111。離心，800印111，6111；[11。充上清，用含20 (%(￥八）小牛血清碰1'選擇 培養液重懸。將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100 μ 1。將培養板置 37°C、5% C02培養箱中培養。
[0034] 3.雜交瘤細胞的篩選
[0035] 脾細胞和骨髓瘤細胞融合后5天，形成多種細胞的混合體，補加 HAT培養基 100 μ 1，第10天換HT培養基培養。雜交瘤細胞布滿孔底1/5面積時，即可采用間接CLIA 法檢測培養上清，篩選陽性克隆。以Factor Η純品（Fitzgerald)包被酶標板（5yg/ ml) 100 μ 1/孔，4°C過夜，將酶標板孔中的液體倒盡，加入PBST，重復洗滌三次；加入封閉液 200 μ 1/孔進行封閉，置于37°C，1小時。甩干封閉液，加入100 μ 1細胞培養上清，陽性對照 選小鼠的免疫血清，陰性對照選SP2/0培養上清，空白為洗滌液，于37°C靜置2h。加入HRP 標記羊抗鼠二抗（1:5000) 100μ 1/孔，于37°C靜置60min。加入PBST，重復洗滌三次；加入 底物反應液100 μ 1/孔，37°C置暗處反應10分鐘。加入H2S04 (2mol/L) 50 μ 1/孔，終止反應。 酶標儀檢測450nm吸光度值。以Factor Η純品（Fitzgerald)為抗原，免疫小鼠，成功得到 2株分泌BTAA單克隆抗體的雜交瘤細胞株（編號12D4和11E9)，這二株單克隆抗體分別特 異性識別并結合Factor Η純品（Fitzgerald)。
[0036] 4.雜交瘤的克隆化
[0037] 篩選得到的陽性克隆，采用有限稀釋法對雜交瘤克隆化，克隆前1天制備飼養細 胞層，將要克隆的雜交瘤細胞用不完全培養基從培養孔內輕輕吹干，計數。調整細胞為5個 細胞/ml。取準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞ΙΟΟμΙ。孵育于37°C、 5% C02孵箱中。在第7天換液，以后每3天換液1次。9天可見細胞克隆形成，化學發光法 檢測檢測抗體效價。并將最強的陽性克隆再次克隆化，直至細胞陽性率達100%，即可定株； 定株的細胞擴大培養。并送保藏中心保藏。
[0038] 5.雜交瘤細胞的保藏
[0039] 將雜交瘤細胞株（分類名BTAA雜交瘤細胞株）于2014年6月16日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區北辰西路1號院3號），保藏編 號分別為 CGMCC No. 9317、CGMCC No. 9318。
[0040] 實施例2.單克隆抗體的大量生產
[0041] 已具備兩株單克隆抗體雜交瘤細胞株：取IX 1〇7的細胞濃度注射于Balb/c小鼠 腹腔，10天后收集腹水。通過以下步驟純化單克隆抗體：
[0042] 1.收集所得的腹水以2500 rpm離心，取上清。加等體積的PBS(pH7. 4)與1/2體 積的飽和硫酸銨，4°C、靜置30min ;
[0043] 2.以 3000 rpm，4。。，離心 20min ;
[0044] 3.去沉淀，上清加等體積的飽和硫酸銨，靜置30min ;
[0045] 4.以 3000 rpm，4°C,離心 20min ;
[0046] 5.取沉淀，加5ml生理鹽水與5ml飽和硫酸銨靜置30min ;
[0047] 6.以 3000 rpm，4。〇，離心 20min ;
[0048] 7.沉淀加5ml生理鹽水與5ml (λ 02M的PB緩沖液（PH7. 4);
[0049] 8.加8倍柱體積的ΡΒ緩沖液平衡Protein G凝膠柱（購自GE公司）；
[0050] 9.將第7步中的混合液加到凝膠柱中；
[0051] 10.使用10倍柱體積的PB緩沖液洗脫雜蛋白；
[0052] 11.用0. 2M pH2. 8甘氨酸緩沖液洗脫抗體并收集；
[0053] 12.使用再生液清洗柱子；
[0054] 13.加平衡液平衡柱子。
[0055] 實施例3.本發明膀胱腫瘤相關抗原的化學發光檢測試劑盒的制備
[0056] 1.制備包被有膀胱腫瘤相關抗原單抗的多孔板：
[0057] a)包被：采用0. 05M、pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的實施例2制備的 膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體（CGMCC No. 9317)混合制成包被混合液，并將其加載于多孔 板上，4°C包被12h ;
[0058] 碳酸鹽緩沖液標準配方：
[0059] 無水碳酸鈉 1. 600g
[0060] 碳酸氫鈉 2. 940g
[0061] pH值9. 60?9. 80純化水定容至1000ml
[0062] b)洗板：稀釋20倍濃縮洗液至1倍濃度，使用1倍濃度洗液洗板2次；20倍濃縮 洗液標準配方：
[0063] 氣化鈉 90.000g 十二水合磷酸氫二鈉 29._g -:水合磷酸二氣鈉 2.970g 吐溫 20 10.000ml pH位6.20-6.60 純化水定容至1000ml
[0064] c)封閉：將封閉液（磷酸氫二鈉5. 8g，磷酸二氫鈉0. 593g，氯化鈉8. 0g，山羊血清 100ml，Proclin-3000. 5ml，純化水定容至1000ml)加載于多孔板上，室溫2小時，甩干，干燥 過夜。
[0065] 2.酶工作液的制備：
[0066] 2. 1標記步驟：
[0067] (1)稱取1 mg辣根過氧化物酶（HRP，購自Sigma)溶解于300 μ 1蒸餾水中。
[0068] (2)于上液中加入0· 6 μ 1新配的0· 1Μ NaI04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0069] (3)將上述溶液裝入透析袋中，使用ImM pH 4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。
[0070] (4)加20 μ 1 1M pH 9. 5碳酸鹽緩沖液，使HRP的pH升高到9. 0至9. 5,然后立即 加入1 mg本發明的另一株抗體（CGMCC No. 9318)(在lml 0· 01M碳酸鹽緩沖液中），室溫避 光輕輕攪拌2小時。
[0071] (5)加0· 05ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C 2小時。
[0072] (6)將上述液裝入透析袋中，使用0· 15M pH7. 4 PBS透析，4°C過夜。
[0073] (7)加入等體積的甘油，-20°C保存，最終辣根過氧化物酶標抗體濃度為lmg/ml。
[0074] 2. 2酶標記抗體濃度確定：
[0075] 采用方針法選擇酶標抗體的工作濃度，取2 μ 1酶標抗體（lmg/ml)加入到5ml酶 稀釋液中，即1 :2500的比例。
[0076] 2. 3酶工作液的配制：
[0077] 將2. 1步驟中制備的辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，以1 :2500的比例將酶標 抗體溶于酶緩沖液中。酶緩沖液配方為：5. 8g/L磷酸氫二鈉、0. 593 g/L磷酸二氫鈉、8. 0g/ L 氯化鈉、200ml/L 小牛血清、0· 5 ml/LProclin-300)。
[0078] 3.樣品稀釋液的制備：
[0079] 1000ml樣品稀釋液包括30. 0g氯化鈉、25. 0ml山羊血清、5. 0ml吐溫-20、0. 5ml Proclin-300。
[0080] 4.化學發光液：化學發光液A和化學發光液B為外購試劑（購自：羅氏），其中化 學發光液A含有魯米諾和發光增強劑，化學發光液B含有過氧化物和發光增強劑。或者根 據化學發光技術，自行配制。
[0081] 5.校準品的配制：
[0082] 用樣品稀釋液將Fitzgerald公司的Factor Η純品稀釋，使得校準品中的膀胱腫 瘤相關抗原濃度梯度分別為400、200、50、10、5、Ong/ml。
[0083] 根據需要，校準品可溯源至Fitzgerald公司的參考物質或者其它參考物質。
[0084] 6.質控品的配制：
[0085] 收集膀胱腫瘤相關抗原臨床檢測高值的人尿液樣本（尿液可以是任何市售尿液 樣本、或收集自臨床機構），用樣品稀釋液稀釋高值人尿液至期望的濃度范圍內。高值質控： 160ng/ml 至 240ng/ml ;低值質控：16ng/ml 至 24ng/ml。2-8°C 保存備用。
[0086] 將上述各試劑組裝成試劑盒，根據需要還可以在試劑盒中并入使用說明書、封板 膜等工具。
[0087] 測試例
[0088] 測試例1.本發明膀胱腫瘤相關抗原化學發光試劑盒的使用方法
[0089] 1. 1.實驗前準備
[0090] 1. 1.自4°C冰箱中取出試劑盒，均應平衡到室溫（18-25°C )。
[0091] 1. 2. 20倍濃縮洗滌液用純化水或蒸餾水稀釋20倍后使用。
[0092] 2.試驗方法
[0093] 2. 1.加樣溫育：取足夠數量的包被板，固定于框架上，分別設置校準品孔、質控品 孔和待測樣品孔，記錄各孔位置；在待測樣品孔中加入45 μ 1樣品稀釋液，按順序在校準品 孔中加入校準品50μ 1，在質控品孔加入質控品50μ 1，在樣品孔中分別加入5μ 1的待測樣 品（等同于樣本進行了 10倍稀釋）。每孔加入酶工作液50 μ 1 (建議在20min內完成此步 操作），震蕩混勻，加蓋封板膜，37°C溫育30min。
[0094] 注：校準品和質控品無需稀釋，可直接使用。
[0095] 2. 2.洗板：
[0096] 手工洗板：每孔加入350 μ 1洗液，靜置5-10秒后棄盡，重復沖洗5次后，拍干；
[0097] 洗板機洗板：每孔加入350 μ 1洗液，每次洗滌間隔5-10秒，重復沖洗5次后，拍 干。
[0098] 2. 3.發光：每孔加入50 μ 1化學發光液Α和50 μ 1化學發光液Β，充分混勻后讀 數。
[0099] 2. 4.測定：立即置化學發光儀下測定RLU值。
[0100] 2. 5.計算：根據校準品的濃度及對應的RLU值，以校準品S0孔調零，使用雙對數 線性擬合方式（log(X)-log(Y))計算結果，結果乘以稀釋倍數（10倍），即為樣品最終濃度。
[0101] 線性方程為 log(RLU) = 4. 513+1. 065 log (濃度）；r = 1. 00。
[0102] 濃度 RLU Ong/ml 44396 5ng/ml 177976 1Ong/ml 375563 50 ng/ml 21960B7 200ng/ml 9266176 400ng/ml 18709627
[0103] 測試例2.本發明試劑盒的方法學指標
[0104] 1.準確度：回收率應在85%至115%之間；
[0105] 2.空白檢出限：應不高于1 ng/ml ;
[0106] 3.測量系統的線性：在10ng/ml至4000ng/ml范圍內線性相關系數r彡0. 9900。
[0107] 4.重復性：批內變異系數CV批內應不超過10% ;
[0108] 5.批間差：批間變異系數不超過15% ;
[0109] 表1.準確性、最低檢出限、系統線性、重復性檢測結果
[0110]

【權利要求】
1. 一種檢測樣本中膀胱腫瘤相關抗原的試劑盒，其包含： 包被有第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體的多孔板、 樣品稀釋液、 酶工作液、 化學發光液； 其中： 樣品稀釋液包含：氯化鈉、山羊血清、吐溫-20、和防腐劑； 酶工作液包含：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、小牛血清、辣根過氧化物酶標記的第 二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體和防腐劑； 化學發光液包含：化學發光液A和化學發光液B ;所述化學發光液A含有魯米諾和發光 增強劑，化學發光液B含有過氧化物和發光增強劑； 當所述第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所 產生時，第二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所產 生，或者當所述第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細 胞所產生時，第二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞 所產生； 樣本來自哺乳動物，優選人類；樣本優選為人尿液。
2. 根據權利要求1所述的檢測樣本中膀胱腫瘤相關抗原的試劑盒，還包括校準品， 校準品包含已知濃度的膀胱腫瘤相關抗原純品，膀胱腫瘤相關抗原的濃度在l〇ng/ml 至4000ng/ml范圍內。
3. 根據權利要求1所述的檢測樣本中膀胱腫瘤相關抗原的試劑盒，還包括質控品， 質控品為已知膀胱腫瘤相關抗原濃度的高值尿液樣本稀釋而成。
4. 一種檢測樣本中膀胱腫瘤相關抗原的CLIA試劑盒，其包含： 包被有第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體的多孔板、 樣品稀釋液、 酶工作液、 化學發光液； 其中： 樣品稀釋液包含：30g/L氯化鈉、25ml/L山羊血清、5ml/L吐溫-20和0. 5ml/L Proclin-300 ； 酶工作液包含：5. 8g/L磷酸氫二鈉、0. 593g/L磷酸二氫鈉、8. 0g/L氯化鈉、200ml/L小 牛血清、0. 5ml/L Proclin-300、和0. 4 mg/L辣根過氧化物酶標記的第二膀胱腫瘤相關抗原 單克隆抗體； 化學發光液由化學發光液A和化學發光液B組成；所述化學發光液A含有魯米諾和發 光增強劑，化學發光液B含有過氧化物和發光增強劑； 當所述第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所 產生時，第二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所產 生，或者當所述第一膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細 胞所產生時，第二膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞 所產生。
5. -種膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體，其由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所 產生。
6. -種膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體,其由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所 產生。
7. 選自如下一種或兩種的膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體在制備檢測試劑中的用途： 由保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞所產生的膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體、和 由保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞所產生的膀胱腫瘤相關抗原單克隆抗體； 所述檢測試劑選自：ELISA檢測試劑、免疫比濁檢測試劑、磁顆粒檢測試劑、化學發光 檢測試劑、免疫熒光檢測試劑和放射免疫檢測試劑，優選化學發光檢測試劑； 所述檢測試劑優選為檢測膀胱腫瘤相關抗原的檢測試劑。
8. -種雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCC No. 9317的雜交瘤細胞。
9. 一種雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCC No. 9318的雜交瘤細胞。
【文檔編號】G01N33/577GK104142401SQ201410359816
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】于暉, 李雨心, 陳勤慧, 王旭, 劉洋 申請人:北京普恩光德生物科技開發有限公司