一種基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，通過基頻信號調制激發光源作用于待測標的物上，觸發熒光，使熒光成周期性增強與衰減，再通過二倍頻方波信號，控制采樣周期，將熒光上升周期和衰減周期都一分為二，分別獨立采樣后計算兩部分采樣差值并相加得到熒光信號的強度表征值，得到待測標的物的濃度值。本發明的方法不僅同樣可以消除樣品中底物的熒光干擾，還可以消除環境背景光、空間電磁波工頻干擾等信號，提升檢測樣品熒光測量信號強度，具備常規時間分辨熒光方法無法完成的優勢，可應用于生物、化學、醫學等領域標的物的熒光強度檢測。
【專利說明】一種基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于借助于測定材料的化學或物理性質來測試或分析材料的【技術領域】，特 別涉及一種可以消除樣品中底物的熒光干擾、消除環境背景光、消除空間電磁波工頻干擾 等信號以提升檢測樣品熒光測量信號強度、提高熒光檢測精準度的基于相均衡倍頻調制原 理的時間分辨熒光檢測方法。
【背景技術】
[0002] 目前，免疫層析（lateral flow immunoassay, LFIA)快速檢測試紙條多以膠體 金或者熒光色素作為標記物。近年來免疫熒光檢測領域在技術上取得突破，發展了時間分 辨熒光（Time-resolved fluorescence，TRF)免疫分析技術，此技術具有靈敏度高、特異性 強、熒光壽命長、穩定性好和無放射性污染等特點，可以廣泛應用于現場定量檢測，是未來 即時檢測技術發展的重要方向。
[0003] 時間分辨突光（Time-resolved fluorescence, TRF)免疫分析技術的具體操作過 程是：在試紙條上的檢測線（T)和質控線（C)區域進行熒光色素染色處理；將試紙條放入檢 測樣品，當檢測樣品中含有能和熒光色素結合的檢測標的物時，即能對樣品的測量標的物 進行熒光色素染色；然后利用激發光照射樣品，激發熒光色素發出熒光，由最終的熒光的強 度值分析出測量標的物的種類、濃度等信息。本技術要求在短時間根據熒光信息對測量標 的物進行正確的分析。
[0004] 然而，激發光照射激發出熒光的過程中，除了測量標的物發射的熒光，也即是標記 在樣品上的熒光色素的熒光信息外，還包括兩大類干擾熒光，干擾熒光包括環境背景熒光 和雜質激發熒光。所謂環境背景熒光，包括有樣品底液或試紙條本身的自發熒光、反射的波 段較寬的熒光、檢測系統的漏光及電磁干擾等；雜質激發熒光主要是由于樣品中包含非測 量標的物的物質，這類物質也可能會被激發光激發出熒光，只是這類熒光的激發和淬滅過 程和測量標的物熒光過程不同。上述這些干擾熒光波段與熒光色素發出的熒光波段相重疊 時，如果干擾突光和突光色素發出的突光相比，強度極其微弱，貝 1J利用傳統的時間分辨突光 檢測方法可以測量出標的物的濃度信息，但是，當熒光色素所發出的熒光的強度不足夠強 時，則會嚴重影響測量分析的結果。
[0005] 在傳統的時間分辨熒光檢測方法中，激發光照射樣品激發熒光發射衰減的過程 中，在熒光發射最大值時并不檢測熒光，而是延遲200 μ s左右時間，等待雜質激發熒光淬 滅，再開始檢測熒光，從而達到消除上述第二類干擾熒光的影響，以得到染色熒光色素所發 出的熒光強度，從而獲取測量標的物相對準確的信息。在此方法中，雖然能消除干擾物質激 發熒光的影響，但是由于干擾物質具有不確定性，控制檢測熒光延時也具有不確定性，故不 能肯定完全消除所有干擾物質激發熒光，且上述方法并不能消除第一類環境背景光干擾， 如背景自發熒光、檢測系統漏光和電磁干擾等。
【發明內容】
[0006] 本發明解決的技術問題是，現有技術中，激發光照射激發出熒光的過程中，除了測 量標的物發射的熒光，也即是標記在樣品上的熒光色素的熒光信息外，還包括環境背景熒 光和雜質激發熒光兩大類干擾熒光，而導致的雖然在傳統的時間分辨熒光檢測方法中，可 以在激發光照射樣品激發熒光發射衰減的過程中，在熒光發射最大值的時間點延遲200 μ s 左右時間，等待雜質激發熒光淬滅，再開始檢測熒光，從而達到消除上述第二類干擾熒光的 影響，以得到染色熒光色素所發出的熒光強度，從而獲取測量標的物相對準確的信息，但是 由于干擾物質具有不確定性，控制檢測熒光延時也具有不確定性，故不能肯定完全消除所 有干擾物質激發熒光，且并不能消除第一類環境背景光干擾，如背景自發熒光、檢測系統漏 光和電磁干擾等的問題，進而提供了一種優化的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光 檢測方法。
[0007] 本發明所采用的技術方案是，一種采用基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光 檢測方法，所述方法包括以下步驟： 步驟1. 1 :采用基頻信號發生器生成頻率為X的規則波信號作為基頻信號，所述頻率為 X的規則波信號調制激發光源，光源發射激發光，激發光作用于待測標的物上，觸發熒光； 步驟1. 2 :控制光電傳感器件以Ν倍于X的頻率對被觸發的熒光進行采樣，得到采樣周 期中每個時刻的熒光強度信號Ai ;i>0 ;30 < Ν < 80 ; 步驟1. 3 :將采樣周期中每個時刻的熒光強度信號&進行信號濾波和AD轉換，得到每 個時刻的熒光強度信號Ai對應的每個時刻的熒光強度數字信號Di ;i>0 ; 步驟1. 4 :將每個時刻的熒光強度信號數字Di根據采樣時間作圖得到光譜曲線；所述 光譜曲線包括熒光發光周期S和熒光衰減周期R ; 步驟1. 5 :對頻率為X的基頻信號進行倍頻調制，產生頻率為X'的倍頻信號，X' =2X ; 根據倍頻信號將熒光發光周期S分為時間相等的熒光發光周期Si和熒光發光周期S2，將熒 光衰減周期R分為時間相等的熒光衰減周期凡和熒光衰減周期R 2 ; 步驟1. 6 :對熒光發光周期SpS2和熒光衰減周期Ri、R2在光譜曲線上進行積分運算，得 到熒光發光周期Si的積分面積記為Φ 1，熒光發光周期S2的積分面積記為Φ 2,熒光衰減周 期札的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R2的積分面積記為Φ4 ;Φ2 > Φ1>0, Φ3>Φ4>0 ; 步驟1. 7 :將熒光發光周期S2的積分面積Φ2減去熒光發光周期Si的積分面積Φ 1， 得到S' =Φ2-Φ1，S'記為熒光發光周期的熒光強度值；將熒光衰減周期&的積分面積 Φ3減去熒光衰減周期R2的積分面積Φ4,得到R' =Φ3-Φ4, R'記為熒光衰減周期的熒 光強度值；將熒光發光周期的熒光強度值S'加上熒光衰減周期的熒光強度值R'，得到 Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3_Φ4,記為熒光色素發射的熒光總強度值；S' >0, R' >0 ; 步驟1. 8 :熒光色素發射的熒光總強度值△ Φ即表征待測標的物的熒光信號測量值， 通過標定方法得到待測標的物濃度值。
[0008] 優選地，所述步驟1. 1中，采用基頻信號發生器生成的頻率為X的規則波信號為方 波信號。
[0009] 優選地，所述步驟1. 1中的激發光源通過雙光源調制。
[0010] 優選地，所述步驟1. 2中，N=50。
[0011] 優選地，所述步驟1. 2中，光電傳感器件設為光電二極管。
[0012] 優選地，所述步驟1. 3中的信號濾波和AD轉換包括以下步驟： 步驟2. 1 :將以N倍于X的采樣頻率采樣到的每個時刻的熒光強度信號Ai進行信號放 大得到放大熒光強度信號A/ ; 步驟2. 2 :將放大熒光強度信號A/通過高通濾波模塊進行濾波，濾除低頻噪聲和工頻 干擾； 步驟2. 3 :將濾波后的放大熒光強度信號A/通過模數轉換模塊進行轉換，得到與所述 采樣周期中每個時刻的熒光強度信號Ai對應的采樣周期中每個時刻的熒光強度數字信號 Di〇
[0013] 優選地，所述步驟1. 3中的濾波為中值濾波。
[0014] 本發明提供了一種優化的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，通 過基頻信號調制激發光源作用于待測標的物上，觸發熒光，使熒光成周期性增強與衰減，再 通過二倍頻方波信號，控制采樣周期，將熒光上升周期和衰減周期都一分為二，分別獨立采 樣后計算兩部分采樣差值并相加得到熒光信號的強度表征值，得到待測標的物的濃度值。 本發明的方法不僅同樣可以消除樣品中底物的熒光干擾，還可以消除環境背景光、空間電 磁波工頻干擾等信號，提升檢測樣品熒光測量信號強度，具備常規時間分辨熒光方法無法 完成的優勢，可應用于生物、化學、醫學等領域標的物的熒光強度檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發明中基頻信號和倍頻信號的示意圖，其中A為基頻信號，B為倍頻信 號； 圖2為本發明中步驟1. 6的對熒光發光周期Sp S2和熒光衰減周期凡、R2在光譜曲線 上進行積分運算的示意圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例對本發明做進一步的詳細描述，但本發明的保護范圍并不限于 此。
[0017] 本發明涉及一種采用基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，所述方 法包括以下步驟： 步驟1. 1 :采用基頻信號發生器生成頻率為X的規則波信號作為基頻信號，所述頻率為 X的規則波信號調制激發光源，光源發射激發光，激發光作用于待測標的物上，觸發熒光； 步驟1. 2 :控制光電傳感器件以N倍于X的頻率對被觸發的熒光進行采樣，得到采樣周 期中每個時刻的熒光強度信號Ai ;i>0 ;30 < N < 80 ; 步驟1. 3 :將采樣周期中每個時刻的熒光強度信號&進行信號濾波和AD轉換，得到每 個時刻的熒光強度信號Ai對應的每個時刻的熒光強度數字信號Di ;i>0 ; 步驟1. 4 :將每個時刻的熒光強度信號數字Di根據采樣時間作圖得到光譜曲線；所述 光譜曲線包括熒光發光周期S和熒光衰減周期R ; 步驟1. 5 :對頻率為X的基頻信號進行倍頻調制，產生頻率為X'的倍頻信號，X' =2X ; 根據倍頻信號將熒光發光周期S分為時間相等的熒光發光周期Si和熒光發光周期S2，將熒 光衰減周期R分為時間相等的熒光衰減周期凡和熒光衰減周期R 2 ; 步驟1. 6 :對熒光發光周期SpS2和熒光衰減周期Ri、R2在光譜曲線上進行積分運算，得 到熒光發光周期Si的積分面積記為Φ 1，熒光發光周期S2的積分面積記為Φ 2,熒光衰減周 期札的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R2的積分面積記為Φ4 ;Φ2 > Φ1>0, Φ3>Φ4>0 ; 步驟1. 7 :將熒光發光周期S2的積分面積Φ2減去熒光發光周期Si的積分面積Φ 1， 得到S' =Φ2-Φ1，S'記為熒光發光周期的熒光強度值；將熒光衰減周期&的積分面積 Φ3減去熒光衰減周期R2的積分面積Φ4,得到R' =Φ3-Φ4, R'記為熒光衰減周期的熒 光強度值；將熒光發光周期的熒光強度值S'加上熒光衰減周期的熒光強度值R'，得到 Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3_Φ4,記為熒光色素發射的熒光總強度值；S' >0, R' >0 ; 步驟1. 8 :熒光色素發射的熒光總強度值△ Φ即表征待測標的物的熒光信號測量值， 通過標定方法得到待測標的物濃度值。
[0018] 本發明提供的方法中，測量標的物通過激發光照射而發出熒光，并對得到的熒光 信號進行處理，能夠迅速且容易的求出熒光強度值，繼而通過標定方法得到標的物濃度值。
[0019] 本發明中，步驟1. 1采用如圖1所示的頻率為X的基頻信號A，完成了控制激發光 源并對待測標的物的觸發熒光的作業，步驟1. 2則是利用N倍于X的頻率控制采樣動作對 被觸發的熒光進行采樣，其優勢在于由于頻率較大，可以獲得不失真的熒光發光和衰減過 程中的熒光強度光譜曲線。步驟1. 3是數模轉化的過程，并同時完成了采樣周期中每個時 刻的熒光強度信號&的信號解調及濾波，保證去除由于表面粗糙、有背景干擾物等原因會 發生的熒光的抖動。步驟1. 4中，當每個時刻的熒光強度信號&轉化為每個時刻的熒光強 度信號數字Di后，實則是每個時刻的電壓值，即代表每個時刻的光強，可以用于制作基于 熒光檢測時間周期和熒光強度數值的光譜曲線，并根據光譜曲線進行積分得到光譜積分曲 線，此時曲線有明顯的上升段和下降段，光譜曲線的上升段為熒光發光周期S，光譜曲線的 下降段為熒光衰減周期R。步驟1. 5中，采用如圖1所示的頻率為2X的倍頻信號B進行倍 頻調制，將熒光發光周期S分為時間相等的兩部分，熒光衰減周期R分為時間相等的兩部 分，并在步驟1. 6中對熒光發光周期S的時間相等的兩部分和熒光衰減周期R時間相等的 兩部分在光譜曲線上進行積分運算，得到熒光發光周期S的兩部分的積分面積和熒光衰減 周期R的兩部分的積分面積，熒光發光周期&的積分面積記為Φ 1，熒光發光周期S2的積 分面積記為Φ2,熒光衰減周期&的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R 2的積分面積記為 Φ4,如圖2所示。在步驟1. 7中，將熒光發光周期S的兩部分積分面積相減，得到熒光發光 周期的熒光強度值Φ2-Φ1，將熒光衰減周期R的兩部分積分面積相減，得到熒光衰減周期 的熒光強度值Φ3-Φ4,此時的熒光發光周期的熒光強度值和熒光衰減周期的熒光強度值 已經消除了同樣處于熒光發光周期或熒光衰減周期的樣品底物的熒光干擾，亦消除了同樣 處于熒光發光周期或熒光衰減周期的環境背景光、空間電磁波工頻干擾等信號的干擾，且 由于采用的熒光發光周期和熒光衰減周期的積分面積分別時間相等，故只需要各減一次即 能得到熒光發光周期內的熒光實際強度值和熒光衰減周期內的熒光實際強度值，最后將其 相加，得到熒光色素發射的熒光總強度值Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3-Φ4,簡便易操作。步驟1.8將 熒光色素發射的熒光總強度值△ Φ通過標定方法，最后得到待測標的物濃度值，完成待測 標的物濃度的檢測。
[0020] 本發明采用的方法不僅可以消除待測標的物中底物的熒光干擾，還可以消除環境 背景光、空間電磁波工頻干擾等信號，提升了待測標的物熒光測量信號強度，更為安全可 靠，可行性強，可操作性強，具有常規時間分辨熒光的方法無法具備的優勢。
[0021] 本發明中，設置激發光源按一定頻率X開關，使觸發熒光成周期性增強與衰減，從 而實現控制待測標的物的熒光發射周期和衰減周期的目的。
[0022] 本發明中，激發光可以為普通光源，如發光二極管，亦可以設置為激光。
[0023] 本發明中，激發光源的頻率X是根據熒光激發物質的激發波長決定的，不同的待 測標的物，其激發波長不相同。
[0024] 本發明中，步驟1. 8的標定方法包括以下步驟： 步驟3. 1 :利用標準濃度樣本進行熒光激發； 步驟3. 2 :測量出標準濃度樣本對應的光強值； 步驟3. 3 :通過分段線性插值對光強值進行換算，得到不同的熒光強度值對應的標的 物濃度值； 步驟3. 4 :對應查詢，從熒光色素發射的熒光總強度值△ Φ對應得到待測標的物的熒 光信號測量值。
[0025] 本發明中，采用標定方法來確定熒光色素發射的熒光總強度值△ Φ對應的待測 標的物的熒光信號測量值，一則是為了使用標準的計量方式對所檢測的熒光信號測量值的 精度進行檢測是否符合標準，適用于精密度較高的測量，二則亦適用于校準，保證熒光信號 測量值的精準。
[0026] 所述步驟1. 1中，采用基頻信號發生器生成的頻率為X的規則波信號為方波信號。
[0027] 本發明中，將采用基頻信號發生器生成的頻率為X的規則波信號設置為方波信 號，因為理想的方波是在高和低兩個值之間是瞬時變化的，本發明采用方波來作為基頻信 號并在后續的步驟中利用基頻信號產生同為方波信號的倍頻信號，整體數據處理更為簡 便，亦更能直觀的顯示本發明中涉及到的光譜曲線。
[0028] 所述步驟1. 1中的激發光源通過雙光源調制。
[0029] 本發明中，采用雙光源調制激發光源，保證了激發光源的穩定性，使得其在被激發 過程中能穩定統一的作用在待測標的物上，觸發熒光。
[0030] 本發明中，不同波長激發光源采用的激發光顏色不同。
[0031] 本發明中，由于步驟1. 1中的激發光源通過雙光源調制，故光學檢測模塊一般設 置為雙光源反射式的光學檢測模塊，涉及雙共軛結構的光路設計，在實際工作過程中，一般 以高穩定性的LED為激發光源，并以光電傳感器件檢測當前掃描位置的熒光光強，將信息 傳輸回控制電路進行分析處理，最終得到待測標的物的濃度數據。
[0032] 本發明中，一般采用LED完成激發光源的作業，因 LED具有光譜帶寬窄，溫度系數 低，散射角度小等優點。
[0033] 所述步驟1. 2中，N=50。
[0034] 本發明中，將步驟1. 2中控制光電傳感器件的對被觸發的熒光進行采樣N倍于X 的頻率設置為N為50, 一般情況下，N為50時的采樣頻率可以較好的采樣到各點信號，又不 會由于采樣過于密集導致光譜曲線的失真。
[0035] 所述步驟1. 2中，光電傳感器件設為光電二極管。
[0036] 本發明中，光電傳感器件是常用的采用光電元件作為檢測元件的傳感器，其能將 光信號的變化借助光電元件將光信號轉換成電信號。本發明中，只要能將光信號轉換成電 信號的光電傳感器件在步驟1. 2中均適用。一般情況下，采用光電二極管即能滿足發明需 求。
[0037] 所述步驟1. 3中的信號濾波和AD轉換包括以下步驟： 步驟2. 1 :將以N倍于X的采樣頻率采樣到的每個時刻的熒光強度信號Ai進行信號放 大得到放大熒光強度信號A/ ; 步驟2. 2 :將放大熒光強度信號A/通過高通濾波模塊進行濾波，濾除低頻噪聲和工頻 干擾； 步驟2. 3 :將濾波后的放大熒光強度信號A/通過模數轉換模塊進行轉換，得到與所述 采樣周期中每個時刻的熒光強度信號Ai對應的采樣周期中每個時刻的熒光強度數字信號 Di〇
[0038] 本發明中，信號解調中需要將光源的光信號調制至頻率X并轉化成有效的電壓信 號，然后通過放大采樣周期中每個時刻的熒光強度信號&并通過高通濾波模塊，濾除低頻 噪聲和工頻干擾，濾除噪聲和干擾后，利用頻率為X的基頻信號和頻率為X'的倍頻信號進 行同步的解調，最后將解調后的結果送入模數轉換模塊進行轉換，得到對應熒光光強的數 字信號A。
[0039] 本發明中，模數轉換模塊可以用過高精度、低噪聲的24位Σ-Λ型AD轉換芯片來 完成。
[0040] 本發明中，由于由光電傳感器件掃描采樣的結果仍存在一定的干擾信號，故步驟 1. 3中將采樣周期中每個時刻的熒光強度信號Ai進行信號濾波和AD轉換，得到每個時刻的 熒光強度信號A對應的每個時刻的熒光強度數字信號Dy -般情況下，設置控制電路，滿足 光電傳感器件將掃描采樣的信息反饋給CPU，并通過光電信號IV轉換模塊將光源的光信號 調制至一定頻率并轉化成有效的電壓信號，然后通過信號放大濾波模塊濾除低頻噪聲和工 頻干擾并最后通過AD轉換模塊熒光強度信號由模擬信號轉換成數字信號，得到轉換為數 字信號的熒光強度并進行后續的分析計算，最終得到待測標的物的實際濃度值。
[0041] 所述步驟1. 3中的濾波為中值濾波。
[0042] 本發明中，中值濾波是基于排序統計理論的一種能有效抑制噪聲的非線性信號處 理技術，其基本原理是把數字圖像或數字序列中一點的值用該點的一個鄰域中各點值的中 值代替，讓周圍的像素值接近的真實值，從而消除孤立的噪聲點，其優點在于能保護邊緣信 息，是經典的平滑噪聲的方法。
[0043] 本發明中，基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法可以通過設置相關 的設備來完成，設備可以由本領域技術人員在本發明的方法基礎上設置。一般情況下，在設 備的殼體內設置光學檢測機構和控制電路，設有待測標的物的試紙條自殼體的試紙條插入 口插入，控制電路控制光學檢測模塊對試紙條上的待測標的物的熒光強度進行檢測、掃描 采樣，采集熒光層析試紙條上控制線（C)與測量線（T)的熒光標記物發射光強，記錄光譜采 樣信息曲線并顯示，由控制電路對熒光強度進行分析，得到標的物的濃度。
[0044] 本發明中，可以通過選擇基于時間分辨熒光技術的層析試紙條，加入不同濃度的 檢測樣品，待試紙條完全干燥之后多次檢測其控制線（C)、測量線信號（T)，考察其T/C值的 穩定性，由于熒光漂白效果，C線、T線絕對光強都會衰減，而T/C值保持相對穩定，能達到 〇. 5 %的檢測靈敏度指標。
[0045] 本發明解決了現有技術中，激發光照射激發出熒光的過程中，除了測量標的物發 射的熒光，也即是標記在樣品上的熒光色素的熒光信息外，還包括環境背景熒光和雜質激 發熒光兩大類干擾熒光，而導致的雖然在傳統的時間分辨熒光檢測方法中，可以在激發光 照射樣品激發熒光發射衰減的過程中，在熒光發射最大值的時間點延遲200 μ s左右時間， 等待雜質激發熒光淬滅，再開始檢測熒光，從而達到消除上述第二類干擾熒光的影響，以得 到染色熒光色素所發出的熒光強度，從而獲取測量標的物相對準確的信息，但是由于干擾 物質具有不確定性，控制檢測熒光延時也具有不確定性，故不能肯定完全消除所有干擾物 質激發熒光，且并不能消除第一類環境背景光干擾，如背景自發熒光、檢測系統漏光和電磁 干擾等的問題，通過基頻信號調制激發光源作用于待測標的物上，觸發熒光，使熒光成周期 性增強與衰減，再通過二倍頻方波信號，控制采樣周期，將熒光上升周期和衰減周期都一分 為二，分別獨立采樣后計算兩部分采樣差值并相加得到熒光信號的強度表征值，得到待測 標的物的濃度值。本發明的方法不僅同樣可以消除樣品中底物的熒光干擾，還可以消除環 境背景光、空間電磁波工頻干擾等信號，提升檢測樣品熒光測量信號強度，具備常規時間分 辨熒光方法無法完成的優勢，可應用于生物、化學、醫學等領域標的物的熒光強度檢測。
【權利要求】
1. 一種基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征在于：所述方法包 括以下步驟： 步驟1. 1 :采用基頻信號發生器生成頻率為X的規則波信號作為基頻信號，所述頻率為 X的規則波信號調制激發光源，光源發射激發光，激發光作用于待測標的物上，觸發熒光； 步驟1. 2 :控制光電傳感器件以N倍于X的頻率對被觸發的熒光進行采樣，得到采樣周 期中每個時刻的熒光強度信號& ;i>0 ;30 < N < 80 ; 步驟1. 3 :將采樣周期中每個時刻的熒光強度信號&進行信號濾波和AD轉換，得到每 個時刻的熒光強度信號Ai對應的每個時刻的熒光強度數字信號Di ;i>0 ; 步驟1. 4 :將每個時刻的熒光強度信號數字Di根據采樣時間作圖得到光譜曲線；所述 光譜曲線包括熒光發光周期S和熒光衰減周期R ; 步驟1. 5 :對頻率為X的基頻信號進行倍頻調制，產生頻率為X'的倍頻信號，X' =2X ; 根據倍頻信號將熒光發光周期S分為時間相等的熒光發光周期Si和熒光發光周期S2，將熒 光衰減周期R分為時間相等的熒光衰減周期凡和熒光衰減周期R 2 ; 步驟1. 6 :對熒光發光周期SpS2和熒光衰減周期Ri、R2在光譜曲線上進行積分運算，得 到熒光發光周期Si的積分面積記為Φ 1，熒光發光周期S2的積分面積記為Φ 2,熒光衰減周 期札的積分面積記為Φ3,熒光衰減周期R2的積分面積記為Φ4 ;Φ2 > Φ1>0, Φ3>Φ4>0 ; 步驟1. 7 :將熒光發光周期S2的積分面積Φ2減去熒光發光周期Si的積分面積Φ 1， 得到S' =Φ2-Φ1，S'記為熒光發光周期的熒光強度值；將熒光衰減周期&的積分面積 Φ3減去熒光衰減周期R2的積分面積Φ4,得到R' =Φ3-Φ4, R'記為熒光衰減周期的熒 光強度值；將熒光發光周期的熒光強度值S'加上熒光衰減周期的熒光強度值R'，得到 Λ Φ = Φ2-Φ1+Φ3_Φ4,記為熒光色素發射的熒光總強度值；S' >0, R' >0 ; 步驟1. 8 :熒光色素發射的熒光總強度值△ Φ即表征待測標的物的熒光信號測量值， 通過標定方法得到待測標的物濃度值。
2. 根據權利要求1所述的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征 在于：所述步驟1. 1中，采用基頻信號發生器生成的頻率為X的規則波信號為方波信號。
3. 根據權利要求1所述的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征 在于：所述步驟1. 1中的激發光源通過雙光源調制。
4. 根據權利要求1所述的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征 在于：所述步驟1. 2中，N=50。
5. 根據權利要求1所述的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征 在于：所述步驟1. 2中，光電傳感器件設為光電二極管。
6. 根據權利要求1所述的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征 在于：所述步驟1. 3中的信號濾波和AD轉換包括以下步驟： 步驟2. 1 :將以N倍于X的采樣頻率采樣到的每個時刻的熒光強度信號&進行信號放 大得到放大熒光強度信號A/ ; 步驟2. 2 :將放大熒光強度信號A/通過高通濾波模塊進行濾波，濾除低頻噪聲和工頻 干擾； 步驟2. 3 :將濾波后的放大熒光強度信號A/通過模數轉換模塊進行轉換，得到與所述 采樣周期中每個時刻的熒光強度信號Ai對應的采樣周期中每個時刻的熒光強度數字信號 Di〇
7.根據權利要求1所述的基于相均衡倍頻調制原理的時間分辨熒光檢測方法，其特征 在于：所述步驟1. 3中的濾波為中值濾波。
【文檔編號】G01N21/64GK104101587SQ201410353200
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】蔣凱, 湯亞偉, 王萍, 張濤 申請人:蘇州和邁精密儀器有限公司