乙型肝炎病毒前s1抗原定量測定試劑盒及其制備方法

乙型肝炎病毒前s1抗原定量測定試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于免疫診斷【技術領域】，具體涉及一種微粒子化學發光法乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法。試劑盒由測PreS1磁微粒、測PreS1示蹤結合物、校準品、分析緩沖液、樣本稀釋液組成，本發明還公開了該定量測定試劑盒的制備方法，其采用的是微粒子化學發光免疫分析技術，比ELISA具有更高的靈敏度和特異性，適合于臨床乙肝的輔助診斷，填補了國內微粒子化學發光法檢測前S1抗原檢測試劑生產的空白。
【專利說明】乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種免疫診斷技術，具體地說是一種磁微粒作為載體的乙型肝炎病毒 前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 我國是個肝炎大國，發病人數眾多，僅乙型肝炎病毒感染者就達1. 2億。約占我國 總人口的10%，乙型肝炎病程遷延，如得不到及時有效的治療，將會發展為肝硬化甚至肝癌， 即人們通常所說的"乙肝發展三部曲"。有資料顯示，全球每年有100萬人因感染乙肝病毒 而死亡，占全球疾病死亡原因的第九位，可見乙型肝炎是嚴重危害人類健康的疾病之一。
[0003] 完整的乙肝病毒為直徑42nm的球形顆粒，又稱為Dane顆粒，是1970年Dane發現 的；病毒含有雙層衣殼，外衣殼由脂質雙層與蛋白質構成，HBsAg鑲嵌于此層中，內衣殼含 有HBcAg，HBcAg在酶的作用下降解，而釋放出HBeAg ;在內衣殼內部為病毒的核心部分，含 有DNA和DNA多聚酶；DNA為雙股環狀，正股較短，負股較長，且有一缺口。負股DNA鏈上有 4個開放讀碼框，分別稱之為S、C、P、X區：S區中有S基因，pre-Sl基因和pre-S2基因，分 別編碼HBsAg、PreSl抗原、PreS2抗原；C區編碼HBcAg ;P區編碼多聚酶。
[0004] 乙型肝炎病毒至少有三種不同的抗原，而每種抗原物質都能刺激人體產生相應的 抗體，就是說抗原與抗體是配對的，乙型肝炎常見的有三對抗原和抗體。三對抗原抗體分別 是乙肝表面抗原和抗體，乙肝e抗原和抗體，乙肝核心抗原和抗體，但因核心抗原在血清 中一般不易檢出，僅其余兩對半在血液中可檢測出，故俗稱"兩對半"。近年來，前S1抗原 檢測要比HBeAg更反映 HBV復制情況。因此，前S1抗原作為HBV病毒感染、復制的指標比 HBeAg敏感，有獨立檢測的價值，是對HBV "五項(二對半)"標志物檢測起重要補充作用。
[0005] 前S1抗原在病毒侵入肝細胞過程中起重要作用，它主要存在于Dane顆粒和管型 顆粒上。前S1抗原在病毒感染、裝配、復制和刺激機體產生免疫反應等方面起有十分重要 的作用。前S1抗原主要存在于血清中HBV表面，提示機體內含有HBV就有前S1抗原。前 S1抗原與HBV-DNA，HBeAg檢測率高度符合是一項十分重要的病毒復制指標，提示前S1抗 原可作為HBeAg和HBV-DNA檢測的補充和對照。抗HBeAb ( + )慢性乙型肝炎(約占患者的 30%左右）和HBV慢性無癥狀攜帶者中，前S1抗原（+ )可表示病毒的復制，提示臨床上只檢 測"乙肝五項"是不夠的，補充前S1抗原的測定是十分重要的，可彌補因病毒變異和其它原 因造成的HBeAg陰性的"誤尋"。病毒附著于肝細胞上，最重要的介導部位是前S1抗原的 氨基酸(AA) 21-47片段，變異的病毒只要這一區段完好就有傳染性。急性乙型肝炎患者前 S1抗原陰轉越早，預后越好，是病毒清除的最早跡象，反之，前S1抗原持續陽性，將發展至 慢性肝炎。因此它是HBV的感染與復制狀況的重要指標。同時可作為預后及藥物療效的判 斷指標。
[0006] 前S1抗原的傳統檢測方法包括酶聯免疫法、膠體金法及化學發光檢測法，這些方 法雖然具有很多優點，但在檢測的靈敏度、特異性、穩定性等方面還有待進一步提高。全自 動微粒子化學發光免疫分析是在酶免疫分析基礎上結合了高靈敏度的化學發光測定技術 和磁性微粒分離技術，與其他方法相比，這種方法有許多獨特的優點，首先它用順磁性微粒 作為固相載體，由于顆粒體積小，表面積大，擴大了反應面積，大大提高了檢測靈敏度；其次 由于使用全自動儀器及配套試劑，使人為因素減至最低，提高了方法的穩定性和結果的重 復性，同時也使得批內差異與批間差異都較小。與放射免疫法相比，微粒子化學發光法除具 有高靈敏度、高精確度、高可靠性等優點外，還具有如下優點：a.無放射性污染，穩定性好； b.特異性高；c.試劑可隨用隨取，測定方便迅速，可作為急診檢測項目。根據大量的實驗結 果以及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及其發展前景來看，該方法逐漸成為取代 放射性免疫分析和酶免疫分析的首選。但是目前國內尚無生產用于前S1抗原定量檢測的 微粒子化學發光法診斷試劑，目前急需靈敏度和特異性較高的微粒子化學發光診斷試劑， 可以作為酶聯免疫試劑及膠體金等試劑的替代品，用于前S1抗原的診斷。


【發明內容】

[0007] 本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種具有高靈敏度 和特異性，適合于臨床乙型肝炎病毒的輔助診斷的微粒子化學發光法前S1抗原定量測定 試劑盒及其制備方法。
[0008] 本發明解決上述技術問題采用的技術方案是：一種乙型肝炎病毒前S1抗原定量 測定試劑盒，其包括測PreSl磁微粒、測PreSl示蹤結合物、校準品、分析緩沖液、樣本稀釋 液。其特征是：所述測PreSl磁微粒為標記有PreSl單克隆抗體的磁性微粒子；測PreSl示 蹤結合物為標記有另一株PreSl單克隆抗體的異魯米諾；分析緩沖液、樣本稀釋液分別為 含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；校準品為一低含量前S1抗原的溶液和一高含量前S1抗 原的溶液，用于測定儀內儲存主曲線的校正。
[0009] 本發明還提供了上述乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒的制備方法，具體 步驟如下： (1) 制備測PreSl磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質量比1 : 2,磁微粒與PreSl單克隆抗體的比例為每毫克 磁微粒標記25 μ g的單抗，在22~26°C混勻的情況下進行標記，標記時間1小時，標記后采 用甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達到25mM，反應30分鐘，洗滌三次，加入磁微粒保存液 (含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統)，使之終濃度達到每20μ L測PreSl磁微粒中 含有80 μ g的磁微粒標記抗體，2~8°C保存； (2) 制備測PreSl示蹤結合物 另一株PreSl單克隆抗體與異魯米諾的標記，反應體系為：戊二醛使用濃度為 1. 0%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，PreSl單抗與異魯米諾的質量比為2 : 1，在22?26°C 反應1. 5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放； 最終將異魯米諾標記抗體用示蹤結合物稀釋液(含20%小牛血清的0. 01M PBS緩沖系統)按 照1 : 3000的稀釋比例稀釋成測PreSl示蹤結合物； (3) 制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (4) 制備樣本稀釋液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (5)校準品包括校準品1和校準品2,其中校準品1為低含量前S1抗原的溶液，校準品 2為高含量前S1抗原的溶液。
[0010] 本發明的原理是利用微粒子化學發光免疫分析技術，采用雙抗體夾心法定量測定 人血清/血漿中乙型肝炎病毒前S1抗原的含量。在磁性微粒子上共價標記PreSl單克隆 抗體，加入待測樣本和分析緩沖液，溫育后，再加入異魯米諾標記的另一株PreSl單克隆抗 體，形成磁微粒標記抗體-抗原-異魯米諾標記抗體復合物，充分洗滌后，加入激發液發光， 相對發光強度（RLU)與血清/血漿中PreSl含量呈正相關，樣本的含量可以利用該批號試 劑盒已設定的曲線，通過全自動化學發光測定儀自動計算出來。
[0011] 本發明試劑盒的優點是采用了微粒子化學發光免疫分析技術，比ELISA具有更高 的靈敏度和更好的特異性，填補了國內前S1抗原定量檢測的微粒子化學發光法診斷試劑 生產的空白。

【具體實施方式】
[0012] 本發明試劑盒采用微粒子化學發光免疫分析技術，檢測血清或血漿中是否存在前 S1抗原。下面具體描述前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法。
[0013] 一種乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒，其包括測PreSl磁微粒、測PreSl 示蹤結合物、校準品、分析緩沖液、樣本稀釋液。所述測PreSl磁微粒為標記有PreSl單克 隆抗體的磁性微粒子；測PreSl示蹤結合物為標記有另一株PreSl單克隆抗體的異魯米諾； 分析緩沖液、樣本稀釋液分別為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；校準品為一低含量前S1 抗原的溶液和一高含量前S1抗原的溶液，用于測定儀內儲存主曲線的校正。
[0014] 本發明上述前S1抗原定量測定試劑盒的制備方法，其具體步驟如下： (1) 制備測PreSl磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質量比1 : 2,磁微粒與PreSl單克隆抗體的比例為每毫克 磁微粒標記25 μ g的單抗，在22~26°C混勻的情況下進行標記，標記時間1小時，標記后采 用甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達到25mM，反應30分鐘，洗滌三次，加入磁微粒保存液 (含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統)，使之終濃度達到每20μ L測PreSl磁微粒中 含有80 μ g的磁微粒標記抗體，2~8°C保存； (2) 制備測PreSl示蹤結合物 另一株PreSl單克隆抗體與異魯米諾的標記，反應體系為：戊二醛使用濃度為 1. 0%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，PreSl單抗與異魯米諾的質量比為2 : 1，在22?26°C 反應1. 5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放； 最終將異魯米諾標記抗體用示蹤結合物稀釋液(含20%小牛血清的0. 01M PBS緩沖系統)按 照1 : 3000的稀釋比例稀釋成測PreSl示蹤結合物； (3) 制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (4) 制備樣本稀釋液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (5)校準品包括校準品1和校準品2,其中校準品1為低含量前S1抗原的溶液，校準品 2為高含量前S1抗原的溶液。
[0015] 本發明上述各種原材料的選擇要求如下： 1、磁微粒標記用PreSl單克隆抗體的選擇 首先就抗體的外觀、濃度、純度、效價進行驗證，結果抗體為微帶乳光的澄清液體，無肉 眼可見異物，無搖不散的沉淀，用紫外吸收法檢測其蛋白含量應不低于2. Omg/mL，效價應不 低于標示效價且不低于1 :10000, SDS-PAGE檢測純度應主帶清晰，無明顯雜帶，研究結果表 明PreSl單克隆抗體完全可用于本發明試劑盒的制備。
[0016] 2、異魯米諾標記用另一株PreSl單克隆抗體的選擇 首先仍就抗體的外觀、濃度、純度、效價進行驗證，結果抗體為微帶乳光的澄清液體，無 肉眼可見異物，無搖不散的沉淀，用紫外吸收法檢測其蛋白含量應不低于2. Omg/mL，效價應 不低于標示效價且不低于1 :10000, SDS-PAGE檢測純度應主帶清晰，無明顯雜帶，研究結果 表明另一株PreSl單克隆抗體也完全可用于本發明試劑盒的制備。
[0017] 3、磁微粒的選擇 通過對磁微粒的外觀，標記蛋白的比率，磁響應性，磁微粒吸附一致性等方面進行分 析，經過多次分析研究，將磁微粒混勻，在燈光下觀察，易分散，無聚集，無異物；將蛋白采用 不同的方法進行標記，標記率應大于90% ;將磁微粒置370-380特斯拉的磁鐵上，觀察磁微 粒的聚集速度，分散均勻的磁微粒在10秒鐘內完全聚集；磁微粒吸附一致性CV < 10%。研 究結果表明直徑為〇. 90-1. 10 μ m的磁微粒，含有羧基基團，標記率最高，可用于本發明診 斷試劑盒的制備。
[0018] 4、異魯米諾的選擇 將異魯米諾用DMS0 (二甲基亞砜）進行溶解，用純化水進行稀釋至1. 2 X 1(T5M/L的量， 加入10 μ L異魯米諾液體，各加入200 μ L激發液，測定其發光值，發光值應> 160000,經過 研究，符合要求的異魯米諾可作為發光的原料。
[0019] 本發明前S1抗原定量測定試劑盒檢測樣品中前S1抗原的檢測方法是：首先取出 濃縮洗液，用純化水按照倍數進行稀釋。而后取出激發Α液和Β液，放置全自動化學發光測 定儀合適的位置。激發A液為含有4%NaOH的緩沖液，激發B液為含有0. 12%H202的緩沖液。 接著將試劑盒從冰箱中取出后，放于儀器試劑區至少混勻30分鐘后方可使用，并嚴格按照 設定的程序進行加樣和溫育。
[0020] 具體加樣方法如下：80 μ L血清/血漿樣本、10 μ L分析緩沖液以及20 μ L測PreSl 磁微粒在37°C的條件下反應20分鐘，加入150 μ L測PreSl示蹤結合物，37°C反應10分鐘， 再用稀釋后的洗液洗滌3次，最終分別加入200 μ L激發A液和激發B液，測定發光值。樣 本的含量可以利用該批號試劑盒已設定的曲線，通過發光儀自動計算出來。
[0021] 本發明質量控制要求是：試劑盒第一次操作，必須采用校準品進行定標，每間隔 10天用校準品對試劑盒的主曲線進行修正，按照修正的主曲線對樣本進行定量。
[0022] 本發明試劑盒檢測PreSl企業內控品，檢測的結果顯示：該試劑盒的陰、陽性參考 品符合率、靈敏度、精密度、準確度、線性、穩定性等各項質量指標均符合企業要求。陰性符
【權利要求】
1. 一種乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒，包括 (1) 測PreSl磁微粒：標記有PreSl單克隆抗體的磁性微粒子； (2) 測PreSl示蹤結合物：標記有另一株PreSl單克隆抗體的異魯米諾； (3) 校準品：一低含量前S1抗原的溶液和一高含量前S1抗原的溶液； (4) 分析緩沖液：含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液； (5) 樣本稀釋液：含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
2. -種制備權利要求1乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒的方法，其特征是具體 步驟如下： (1) 制備測PreSl磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質量比1 : 2,磁微粒與PreSl單克隆抗體的比例為每毫克 磁微粒標記25 μ g的單抗，在22~26°C混勻的情況下進行標記，標記時間1小時，標記后采用 甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達到25mM，反應30分鐘，洗滌三次，加入磁微粒保存液， 所述磁微粒保存液為含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統，使之終濃度達到每20 μ L 測PreSl磁微粒中含有80 μ g的磁微粒標記抗體，2~8°C保存； (2) 制備測PreSl示蹤結合物 另一株PreSl單克隆抗體與異魯米諾的標記，反應體系為：戊二醛使用濃度為 1. 0%-2. 0%，PreSl單抗與異魯米諾的質量比為2 : 1，在22?26 °C反應1. 5小時，用 pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放；最終將異魯米諾標 記抗體用示蹤結合物稀釋液，所述示蹤結合物稀釋液為含20%小牛血清的0. 01M PBS緩沖 系統，按照1 : 3000的稀釋比例稀釋成測PreSl示蹤結合物； (3) 制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1. Og/L，按上述配方配制稀釋液； (4) 制備樣本稀釋液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； 校準品包括校準品1和校準品2,其中校準品1為低含量前S1抗原的溶液，校準品2為 高含量前S1抗原的溶液。
3. 根據權利要求2所述乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒的制備方法，其特征在 于：步驟（2)中戊二醛使用濃度為1. 25%。
【文檔編號】G01N33/532GK104090108SQ201410347050
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】蒙紅勝, 劉京偉, 林芳芳, 王凌凌, 趙海英 申請人:威海威高生物科技有限公司