一種基于磁性微珠的樣品無轉移低場nmr稀有細胞快速檢測方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學【技術領域】，公開了一種基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞檢測方法，包含以下步驟：(1)分別制備目標稀有細胞懸浮液的標準樣本和待測樣本；(2)分別加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混合均勻后立即用低場核磁共振分析儀分別對標準樣本和待檢樣本進行弛豫時間測定；(3)使核磁共振造影劑與樣本中的稀有細胞進行免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀分別對標準樣本和待檢樣本進行弛豫時間測定；(4)計算弛豫時間改變量，繪制標準曲線，得出待檢樣本中目標稀有細胞的含量。本發明可簡便、快速、高特異性和高靈敏度地檢測生物體液樣本中的稀有細胞，且由于兩次檢測之間沒有樣品的轉移過程可獲得較高準確率。
【專利說明】一種基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢 測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學檢測技術，特別涉及一種生物體液樣本中稀有細胞的檢測 方法。
【背景技術】
[0002] 稀有細胞是指生物體液樣本（包括血液、胸水、腹水、尿液、腦脊液等）中的一些非 典型細胞，大量研究表明，對稀有細胞的檢測和鑒定對于相關疾病的病理機制及靶向藥物 開發具有重要指導意義。因此，尋找準確、快速地的稀有細胞檢測方法將成為亟待解決的問 題。然而稀有細胞在生物體液中的濃度非常低，與非目標細胞的比例大約是1 :1〇7,用傳統 技術無法計數，所以迫切需要一種簡單準確快速的方法解決這一難題。
[0003] 由于循環稀有細胞在體液中的含量很少，要經過有效的富集步驟才能在后續的實 驗中識別鑒定。目前市場上廣泛應用于稀有細胞檢測研究的方法主要有密度梯度離心法、 膜過濾法和免疫磁性分離技術。
[0004] 密度梯度區帶離心法又稱為區帶離心法，是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心 沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶 的分離方法。使用此法可以同時使樣品中幾個活全部組分分離，具有良好的分辨率。此法 的優點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離 具有沉降系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持 顆粒活性，并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。此法的缺點是：①離心時間較長；② 需要制備惰性梯度介質溶液。研究中經常利用密度梯度離心的原理，用ficoll液分離和純 化人或動物外周血單個核細胞（PBMC)。
[0005] 膜過濾方法是根據某些稀有細胞體積大于外周血中粒細胞從而使稀有細胞從外 周血中分離富集出來，然后利用免疫熒光技術對稀有細胞進行鑒別診斷。該方法中，膜過濾 細胞富集過程相對容易，但是并不是所有稀有細胞體積都大于外周血中粒細胞的，很多稀 有細胞的體積和粒細胞大小差不多，甚至比粒細胞體積更小。基于以上的認識，膜過濾方法 被逐漸拋棄。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種可簡便、快速、高特異性和高靈敏度地檢測生物體液 樣本中含量較低的稀有細胞的低場核磁共振檢測分析方法。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀 有細胞檢測方法，包含以下步驟：
[0008] (1)樣本制備
[0009] 將純培養的目標稀有細胞的細胞系，以緩沖液進行不同梯度稀釋，制得系列濃度 的稀有細胞懸浮液標準樣本；
[0010] 對待測生物體液樣本進行Ficoll密度梯度離心獲取候選混合細胞群，遞經洗滌 高心重懸，制得稀有細胞懸浮液待檢樣本；
[0011] (2)親和富集前核磁共振弛豫時間檢測
[0012] 取上述標準樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混 合均勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值?\ ;
[0013] 取上述待檢樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混 合均勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值Τ/ ;
[0014] (3)親和富集后核磁共振弛豫時間檢測
[0015] 取上述加入核磁共振造影劑的標準樣本，在4?8°C溫度下孵育10?15min，使核 磁共振造影劑與標準樣本中的稀有細胞發生免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀 進行弛豫時間測定，得弛豫時間值T 2 ;
[0016] 取上述加入核磁共振造影劑的待檢樣本，在4?8°C溫度下孵育10?15min，使核 磁共振造影劑與待檢樣本中的稀有細胞發生免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀 進行弛豫時間測定，得弛豫時間值T 2' ；
[0017] (4)標準曲線制作與結果得出
[0018] 計算標準樣本的弛豫時間改變量Λ Τ2,所述Λ Τ2 = T2-I\，以Λ Τ2為縱坐標，以標 準樣本中的目標稀有細胞含量為橫坐標，繪制成標準曲線；
[0019] 計算待檢樣本的弛豫時間改變量AT2test，所述AT2test = Τ2' -ΤΛ AT2test不為 ο，則表明待檢樣本中含有目標稀有細胞，同時依據上述標準曲線得出待檢樣本中目標稀有 細胞的含量。
[0020] 由上述檢測步驟可知：本發明利用核磁共振造影劑可以和稀有細胞結合的特性， 運用免疫磁性分離技術，在外加低磁場的作用下通過檢驗磁珠-細胞懸浮液中水分子的氫 原子信號來定量循環稀有細胞。
[0021] 具體來說，本發明在利用密度梯度離心等方法前期處理細胞樣品后，加入偶聯有 目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑（即NMR檢測反應體系），采用適宜溫度孵育 誘導目標稀有細胞和免疫磁性微珠結合。通過NMR檢測孵育前后兩次弛豫時間變化來定量 地反應體系中目標稀有細胞的數目信息。由于整個檢測反應沒有任何樣品、試劑的加入和 轉移，使得體系處于一個穩定狀態，排除了兩次檢測中由于外來物引入導致的假陽性，使得 檢測更加準確精密。本發明中所述的目標稀有細胞的最終檢出評價方法基于核磁共振技術 的弛豫時間特性參數的變化，所述弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛 豫時間T。
[0022] 優選地，本發明的檢測方法中，步驟（2)中所使用的核磁共振造影劑為順磁性 納米磁珠或超順磁性納米磁珠，且所述的順磁性納米磁珠或超順磁性納米磁珠優選為抗 EpCAM免疫納米磁珠、抗CD45免疫納米磁珠、鏈霉親和素納米磁珠、葉酸修飾的磁性脂質體 中的一種或幾種。
[0023] 由于磁性微珠很小只有50nm(目前市面上商業化的同類磁珠多為μ m級），對細胞 的功能和活性都不會產生影響，完全滿足于稀有細胞檢測需求（活細胞且細胞不會受損）。 上述的免疫磁珠將固化試劑特有的優點與免疫學反應的高度特異性結合于一體，從而快速 地實現從混合細胞群中捕獲和分離稀有目標細胞的目的，所得稀有細胞可用于計數或其他 方面研究應用。
[0024] 優選地，本發明的檢測方法中，所述步驟（2)中，在加入偶聯有目標稀有細胞特異 表達抗體的核磁共振造影劑之前，還包括下述步驟：加入偶聯有抗CD45的核磁共振造影劑 將非目標細胞進行磁性標記，通過外加磁場方式將上述標記的非目標細胞除去。
[0025] 本發明中免疫磁珠富集方法，除上述
【發明內容】
中步驟（2)所描述的直接加入偶聯 有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，使核磁共振造影劑與稀有細胞發生靶向 免疫（抗原抗體反應）富集（陽性富集）外，亦可采用陰性+陽性雙富集的方法達到目標細 胞磁性富集的目的。具體操作方法即為：在加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁 共振造影劑之前，先利用偶聯有抗⑶45的核磁共振造影劑（磁性微珠）將非目標細胞（主 要為上皮細胞中含量較多的白細胞等）進行磁性標記，通過外加磁場方式將白細胞從含有 目標稀有細胞的細胞群混合物中去除掉（陰性標記非目標細胞）；然后，上述獲得細胞亞群 混合物，根據亞群標志物選擇適宜的偶聯有目標細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑（磁 性微珠）進行免疫反應富集，從而獲得標記有目標細胞的核磁共振造影劑（陽性標記目標 細胞）。通過上述陰性+陽性雙富集的操作方法，可達到排出干擾因素、更精確可靠地實現 目標細胞磁性富集的目的。
[0026] 優選地，本發明的檢測方法中，所述步驟（2)中，核磁共振造影劑加入量優選為： 每200個目標稀有細胞中加入1微升核磁共振造影劑。此比例的核磁共振造影劑不但可以 最優化地獲得稀有細胞，還能夠減少由于核磁共振造影劑加入過多導致的背景增強，影響 檢測效果。
[0027] 優選地，本發明的檢測方法中，所述步驟（2)和步驟（3)中，控制低場核磁共振分 析儀的磁場強度為20?25MHz，磁體溫度為30?35°C，重復時間3?5s。更優選地，控制 低場核磁共振分析儀的磁場強度優選為20. 18MHz，磁體溫度優選為35°C，重復時間優選為 5s〇
[0028] 對上述核磁共振體系磁場強度、磁體溫度和重復時間的控制，可使檢測更加準確， 可控性更強，且利于平行實驗的比較和質控。
[0029] 優選地，本發明的檢測方法中，所述步驟（4)中，計算標準樣本的弛豫時間改變量 Λ T2和待檢樣本的弛豫時間改變量△ T2test時，分別取多次測量弛豫時間的平均值進行計 算，從而能使本發明的檢測結果更為準確可靠。
[0030] 由上述的論述可知，本發明通過將核磁共振造影劑（如超順免疫微磁珠）富集和 低場核磁共振儀檢測相結合，將稀有細胞的分離和鑒定有機整合在一起，從而快速實現從 混合細胞群中捕獲和分離稀有目標細胞。在本發明中利用免疫磁性微珠選擇和分離來高度 富集和濃縮體液樣品中存在的任何稀有細胞，將所捕獲的細胞可檢測地標以稀有細胞特異 性表達抗體，且被超順磁性微珠所包被，以使得能對所捕獲的稀有細胞進行鑒別和計數以 及與污染性非靶細胞明確地在核磁共振儀上做區分。由于具有在每7. 5ml體液中可檢測到 微量稀有細胞的極強敏感性，是一種具有極強敏感性和特異性的廣譜的分離方案。更重要 的，本發明的檢測方法由于兩次檢測弛豫時間之間沒有樣品的轉移過程而避免了假陽性， 該方法可以客觀有效地對目標稀有細胞進行檢測和定量，相比于傳統檢測方法，該方法具 有快速、便捷檢測的優勢，可以用于大規模樣本的快速檢測。
[0031] 現有的對于稀有細胞的檢測方法均涉及到免疫熒光技術，需通過熒光顯微鏡鏡檢 來對體液中循環稀有細胞的個數進行定量，普遍具有操作復雜、靈敏性低、檢驗時間長、價 格高、對操作人員要求高，不易重復的弊端（如i *FISH檢測方法成熟的操作人員單次僅能 同時操作6個樣本，整個過程耗時2天）。與現有技術相比，本發明將偶聯有特異表達抗體 的核磁共振造影劑富集稀有目標細胞技術與具有快速和高靈敏度檢測技術的低場核磁共 振儀相結合，從而實現了快速、高效而高靈敏地檢測外周血中稀有細胞的目的，具有如下優 點：（1)可使目標稀有細胞直接從生物體液中分離出來，具有簡便、快速的特點；（2)和離 心、過濾等方法相比，稀有細胞在磁性分離時受到的剪切力小，可避免細胞的失活；(3)具 有很高的選擇性；(4)外加磁場不會對原料液中的離子和帶電溶質的運動產生影響；（5)儀 器設備簡單，操作費用低。（6)本發明屬同一反應體系的兩次NMR檢測，期間無樣品轉移從 而避免了外來物質引入導致的假陽性，進一步提高了檢測的準確率及便捷性。可適應大規 模高通量檢測。本發明的方法可以實現大規模樣本的稀有細胞快速檢測，無論對于產業化 還是客戶體驗上都無疑具有重要的意義。該方法為首次被提出，目前未見相關報道，且該方 法適用于對生物體液樣本中的各種稀有細胞（包括所有的循環稀有上皮細胞）的檢測、鑒 定和定量分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明的稀有細胞檢測方法的流程圖；
[0033] 圖2是實施例1中以標準樣本的弛豫時間改變量Λ T2為縱坐標、以標準樣本中的 目標稀有細胞含量為橫坐標所制成的標準曲線。
【具體實施方式】
[0034] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的各實 施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發明各實施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節。但是，即使沒有這些技術細節和基 于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現本申請各權利要求所要求保護的技術方 案。
[0035] 實施例1
[0036] (1)樣本制備
[0037] 待檢樣本制備：
[0038] 1. 1從乳腺癌模型鼠處獲得抗凝血樣（?10ml)，所述樣品包含懷疑含有目標稀 有細胞的混合細胞群。采集的標本應在當天處理！室溫避光保持時間不應超過24小時；
[0039] 1.2 Ficoll密度梯度離心法獲取候選混合細胞群
[0040] 1)加入適量細胞分層液（Ficoll溶液配制而成）至無菌離心管A底部，然后將上 述抗凝血測試樣以PBS液作適當稀釋后（2:1)，沿管壁輕輕加在分層液上面，使兩者形成一 個清晰的界面。
[0041] 2) 400 Xg水平離心30min (離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩，以保證形成清 晰的界面）。
[0042] 3)離心后管內最終可見三層液體，上層為黃色液體，中間層為透明液體，底層為 棕紅色沉積紅細胞（紅細胞和粒細胞密度大于分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集 成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當的單 個核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀），吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸 (300Xg lOmin洗滌兩次）于B管中而獲得可用于下一步免疫微磁珠富集的細胞懸浮液樣 本。
[0043] 標準樣本制備：
[0044] 將純培養目標稀有細胞，以PBS進行不同梯度稀釋（0, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 10 7celΙ/ml)，從而獲得系列濃度的目標稀有細胞懸浮液標準樣本；
[0045] (2)親和富集前核磁共振弛豫時間檢測
[0046] 將偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的超順磁免疫磁珠（以20〇Cell/lul磁珠的 比例）加入處理好的標準樣本細胞體系中（溶于一定體積的緩沖液中），充分混合均勻（手 動混勻）后立即用低場核磁共振分析儀測定核磁共振的弛豫時間T1 ;
[0047] 取上述待檢樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的超順磁免疫磁珠，混 合均勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值T/。
[0048] (3)親和富集后核磁共振弛豫時間檢測與結果得出
[0049] 取上述加入超順磁免疫磁珠的標準樣本，4?8°C低溫孵育15min，使超順磁免疫 磁珠與標準樣本中的稀有細胞發生免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀測定核磁 共振的弛豫時間T 2 ;
[0050] 取上述加入核磁共振造影劑的待檢樣本，在4?8°C低溫下孵育15min，使超順磁 免疫磁珠與待檢樣本中的稀有細胞發生免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀進行 弛豫時間測定，得弛豫時間值T 2'。所述I\&T2'需分別測量三遍并取平均值。
[0051] 計算標準樣本的弛豫時間改變量ΛΤ2,所述ΛΤ2 = T2-I\，以弛豫時間改變量 (ΔΤ2)為縱坐標，以標準樣本中目標稀有細胞含量為橫坐標，繪制成標準曲線。
[0052] 上述步驟中使用低場核磁共振分析儀（1. 5T)進行核磁共振檢測弛豫時間的儀器 參數如下：磁場強度20. 18MHz，磁體溫度35°C，重復時間5s，每次數據測量3次后取平均 值。
[0053] 計算待檢樣本的弛豫時間改變量Λ T2test，所述Λ T2test = T2' -T/，Λ T2test不為 ο，則表明待檢樣本中含有目標稀有細胞，同時依據上述標準曲線得出待檢樣本中目標稀有 細胞的含量。
[0054] 系列標準樣本中循環稀有細胞定量和鑒定結果統計表：
[0055]
【權利要求】
1. 一種基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方法，其特征在于，包 含以下步驟： (1) 樣本制備 將純培養的目標稀有細胞的細胞系，以緩沖液進行不同梯度稀釋，制得系列濃度的稀 有細胞懸浮液標準樣本； 對待測生物體液樣本進行Ficoll密度梯度離心獲取候選混合細胞群，遞經洗滌高心 重懸，制得稀有細胞懸浮液待檢樣本； (2) 親和富集前核磁共振弛豫時間檢測 取上述標準樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混合均 勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值?\ ; 取上述待檢樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混合均 勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值Τ/ ; (3) 親和富集后核磁共振弛豫時間檢測 取上述加入核磁共振造影劑的標準樣本，在4?8°C溫度下孵育10?15min，使核磁共 振造影劑與標準樣本中的稀有細胞發生免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀進行 弛豫時間測定，得弛豫時間值T2 ; 取上述加入核磁共振造影劑的待檢樣本，在4?8°C溫度下孵育10?15min，使核磁共 振造影劑與待檢樣本中的稀有細胞發生免疫反應富集后，再次用低場核磁共振分析儀進行 弛豫時間測定，得弛豫時間值T2' ； (4) 標準曲線制作與結果得出 計算標準樣本的弛豫時間改變量ΔΤ2,所述ΔΤ2 = ?^-?^，以ΔΤ2為縱坐標，以標準樣 本中的目標稀有細胞含量為橫坐標，繪制成標準曲線； 計算待檢樣本的弛豫時間改變量AT2test，所述AT2test = T2' -T/，AT2test不為0,則 表明待檢樣本中含有目標稀有細胞，同時依據上述標準曲線得出待檢樣本中目標稀有細胞 的含量。
2. 根據權利要求1所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，步驟（2)中所使用的核磁共振造影劑優選為順磁性納米磁珠或超順磁性 納米磁珠。
3. 根據權利要求2所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，所述順磁性或超順磁性納米磁珠優選為抗EpCAM免疫納米磁珠、抗CD45免 疫納米磁珠、鏈霉親和素納米磁珠、葉酸修飾的磁性脂質體中的一種或幾種。
4. 根據權利要求1所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，所述步驟（2)中，在加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造 影劑之前，還包括下述步驟：加入偶聯有抗CD45的核磁共振造影劑將非目標細胞進行磁性 標記，通過外加磁場方式將上述標記的非目標細胞除去。
5. 根據權利要求1所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，所述步驟（2)中，核磁共振造影劑加入量優選為：每200個目標稀有細胞中 加入1微升核磁共振造影劑。
6. 根據權利要求1所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，所述步驟（2)和步驟（3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場強度為20? 25MHz，磁體溫度為30?35°C，重復時間3?5s。
7. 根據權利要求6所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，所述步驟（2)和步驟（3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場強度優選為 20. 18MHz，磁體溫度優選為35°C，重復時間優選為5s。
8. 根據權利要求1所述的基于磁性微珠的樣品無轉移低場NMR稀有細胞快速檢測方 法，其特征在于，所述步驟（4)中，計算標準樣本的弛豫時間改變量ΛΤ2和待檢樣本的弛豫 時間改變量ΛΤΙμ時，分別取多次測量弛豫時間的平均值進行計算。
【文檔編號】G01N24/08GK104155325SQ201410338660
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】張祥林 申請人:張祥林