高效細胞爬片免疫組化方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效細胞爬片免疫組化方法，將均已經過滅菌消毒處理的大面積載玻片和培養皿匹配使用，載玻片置于培養皿中，將細胞接種于培養皿中進行細胞爬片，細胞培養結束后進行免疫細胞組織化學染色鑒定；所述免疫細胞組織化學染色鑒定包括用工具印章蘸取油墨，將載玻片的細胞爬片面覆蓋于工具印章拓印面，壓迫載玻片拓印出與工具印章拓印面相同一致大小的由油墨框條構成的細胞染色區，如有油墨缺失則用油墨涂畫筆填補。本發明可進行大規模，多樣本的醫學實驗科學研究。
【專利說明】高效細胞爬片免疫組化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種細胞爬片免疫組化方法。
【背景技術】
[0002] 細胞爬片免疫組織化學是用標記的特異性抗體對細胞標本中某些化學成分的 分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫細胞化學 (immunocytochemistry)技術。
[0003] 常規細胞爬片免疫組織化學檢測是對單張細胞爬片一片一片進行染色操作，一般 只能對單樣本做一種抗體，蛋白及基因的檢測，難以勝任大規模，多樣本及多組別的醫學實 驗科學研究。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種可進行大規模，多樣本多組別的醫學實驗科學研究的 高效細胞爬片免疫組化方法。
[0005] 本發明的技術解決方案是： 一種高效細胞爬片免疫組化方法，將均已經過滅菌消毒處理的大面積載玻片和培養皿 匹配使用，載玻片置于培養皿中，，將細胞接種于培養皿中進行細胞爬片，細胞培養結束后 進行免疫細胞組織化學染色鑒定；培養皿設有培養皿蓋，其特征是：所述培養皿設有多個 相同大小、可放置載玻片/蓋玻片的細胞培養槽，每個細胞培養槽中分別放置一片載玻片； 所述免疫細胞組織化學染色鑒定依次包括下列步驟： (1) 用冰丙酮固定15min或4%多聚甲醒固定； (2) 流水漂洗，用PBS清洗標本3次； (3) 用 0· 5 % Triton X-100 (PBS 配）孵育 lOmin ; (4) 0. 3% H202 孵育 lOmin ; (5) 用PBS清洗標本3次后，熱風充分干燥； (6) 用工具印章蘸取油墨，將載玻片的細胞爬片面覆蓋于工具印章拓印面，壓迫載玻片 拓印出與工具印章拓印面相同一致大小的由油墨框條構成的細胞染色區，揭取載玻片并查 看，如有油墨缺失則用油墨涂畫筆填補； (7) 空氣充分干燥； (8) 用正常二抗血清封閉孵育10min ; (9) 在各細胞染色區分別滴加小鼠或兔抗第一抗體孵育30?60min ; (10) 吸除各細胞染色區液體并用PBS清洗標本3次； (11) 滴加酶聯小鼠或兔第二抗體工作液孵育30?60min ; (12) PBS清洗標本3次； (13) DAB顯色，避光，鏡下觀察； (14) 蒸餾水洗； (15) 蘇木素襯染； (16) 鹽酸酒精分化，自來水洗； (17) 梯度酒席脫水，二甲苯透明； (18) 中性樹|父封片。
[0006] 所述工具印章包括印章基座，印章基座的底部設置多個方框凸起，方框凸起內為 凹區。
[0007] 所述油墨由下列重量百分比的組分組成： 石蠟 15?20% 松香 2?3% 松節油 4?6% 汽油 20?26% 異丙醚 2?3% 二硫化碳 12?16% 二氯甲烷 2?5% 石油釀 2?3% 乙二醇丁醚 0. 8?1. 2% 乙醚 6?10% 丙酮 3?6% 環已麗 6?10% 四氯化碳 5?8% 微晶蠟 2?3% 蜂蠟 2?3%。 上述各組分用量之和為100%。
[0008] 培養皿的一個角呈斜面形式，方便方位標識；培養皿蓋的一個角呈與培養皿呈斜 面的角配合的斜面形式；培養皿蓋與培養皿吻合口周緣的交錯深度> l〇mm。
[0009] 本發明有利于免疫組化的染色，染色步驟與常規免疫組織化學相似，但樣本處理 的溫度，時間，試劑濃度等標準一致，標記的一抗種類多，可比性和可靠性均顯著提高！處 理的樣本數量多，高效快捷。PBS清洗、血清孵育、標記二抗，襯染(蘇木素)等不需要分隔的 染色可一同處理，方便快捷，實驗條件標準一致且易控制。采用大面積細胞爬片進行細胞培 養本處理的溫度，時間，試劑濃度等標準一致，使實驗結果的可比性和可靠性均顯著提高。 專用細胞培養皿培養孔的數量減少，操作方便，高效快捷。特定的油墨配方充分保證了工作 效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0011] 圖1是本發明培養皿的結構示意圖。
[0012] 圖2是培養皿蓋的結構示意圖。
[0013] 圖3是工具印章的結構示意圖。
[0014] 圖4是細胞爬片分隔分區示意圖。
[0015] 圖5是油墨涂畫筆的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0016] 一種高效細胞爬片免疫組化方法，將已經過滅菌消毒處理的載玻片置于培養皿 中，將細胞接種于培養皿中進行細胞爬片，細胞培養結束后進行免疫細胞組織化學染色 鑒定；所述培養皿是透明材料，設有多個相同大小、可放置載玻片的細胞培養槽，槽深度 > 20ml，每個細胞培養槽中分別可放置一片載玻片；培養皿的一個角呈斜面形式，方便方 位標識；培養皿蓋與培養皿的底口周緣有吻合堤互相交錯，交錯深度> 10 mm。
[0017] 細胞培養槽的規格為80X30/mm(放單張載玻片）；64X28/mm(放單張60X24的 蓋玻片）；54X28/mm(放單張50X24的蓋玻片）；38X28/mm(放單張34X24/mm的蓋玻 片）；所述免疫細胞組織化學染色鑒定依次包括下列步驟： (1) 用冰丙酮固定15min或4%多聚甲醒固定； (2) 流水漂洗，用PBS清洗標本3次； (3) 用 0· 5% Triton X-100 (PBS 配）孵育 lOmin ; (4) 0. 3% H202 孵育 lOmin ; (5) 用PBS清洗標本3次后，熱風充分干燥； (6) 用工具印章蘸取油墨，將載玻片的細胞爬片面覆蓋于工具印章的拓印面，壓迫載玻 片拓印出與工具印章拓印面相同一致大小的由油墨框條構成的細胞染色區，揭取載玻片并 查看，如有油墨缺失則用油墨涂畫筆填補； (7) 空氣充分干燥； (8) 用正常二抗血清封閉孵育lOmin ; (9) 在各細胞染色區分別滴加小鼠或兔抗第一抗體孵育30?60min ; (10) 吸除各細胞染色區液體并用PBS清洗標本3次； (11) 滴加酶聯小鼠或兔第二抗體工作液孵育30?60min ; (12) PBS清洗標本3次； (13) DAB顯色，避光，鏡下觀察； (14) 蒸餾水洗； (15) 蘇木素襯染； (16) 鹽酸酒精分化，自來水洗； (17) 梯度酒席脫水，二甲苯透明； (18) 中性樹|父封片。
[0018] 所述工具印章包括印章基座，印章基座的底部設置多個方框凸起，方框凸起內為 凹區。
[0019] 所述油墨涂畫筆包括筆筒，筆筒內設置筆芯，筆芯為包裹海綿樣的圓柱體，其內中 灌注有油墨，筆芯前端設置木質筆芯。
[0020] 所述油墨由下列重量百分比的組分組成： 石蠟 15 ?20% (例 15%、18%、20%) 松香 2 ?3% (例 2%、2. 5%、3%) 松節油 4?6% (例4%、5%、6%) 汽油 20 ?26% (例 20%、23%、26%) 異丙醚 2?3% (例2%、2. 5%、3%) 二硫化碳 12 ?16% (例 12%、14%、16%) 二氯甲烷 2?5% (例2%、4%、5%) 石油醚 2?3% (例2%、2. 5%、3%) 乙二醇丁醚 0· 8 ?1. 2% (例 0· 8%、1%、1. 2%) 乙醚 6 ?10% (例 6%、8%、10%) 丙酮 3 ?6% (例 3%、4%、6%) 環已酮 6?10% (例6%、8%、10%) 四氯化碳 5?8% (例5%、6%、8%) 微晶蠟 2?3% (例2%、2. 5%、3%) 蜂蠟 2 ?3% (例 2%、2. 5%、3%)。 上述各組分用量之和為100%。
【權利要求】
1. 一種高效細胞爬片免疫組化方法，將已經過滅菌消毒處理的載玻片置于培養皿中， 將細胞接種于培養皿中進行細胞爬片，細胞培養結束后進行免疫細胞組織化學染色鑒定； 培養皿設有培養皿蓋，其特征是：所述培養皿設有多個相同大小、可放置載玻片的細胞培養 槽，每個細胞培養槽中分別放置一片載玻片；所述免疫細胞組織化學染色鑒定依次包括下 列步驟： (1) 用冰丙酮固定15min或4%多聚甲醒固定； (2) 流水漂洗，用PBS清洗標本3次； (3) 用 0· 5% Triton X-100 (PBS 配）孵育 lOmin ; (4) 0. 3% H202 孵育 lOmin ; (5) 用PBS清洗標本3次后，熱風充分干燥； (6) 用工具印章蘸取油墨，將載玻片的細胞爬片面覆蓋于工具印章拓印面，壓迫載玻片 拓印出與工具印章拓印面相同一致大小的由油墨框條構成的細胞染色區，揭取載玻片并查 看，如有油墨缺失則用油墨涂畫筆填補； (7) 空氣充分干燥； (8) 用正常二抗血清封閉孵育lOmin ; (9) 在各細胞染色區分別滴加小鼠或兔抗第一抗體孵育30?60min ; (10) 吸除各細胞染色區液體并用PBS清洗標本3次； (11) 滴加酶聯小鼠或兔第二抗體工作液孵育30?60min ; (12) PBS清洗標本3次； (13) DAB顯色，避光，鏡下觀察； (14) 蒸餾水洗； (15) 蘇木素襯染； (16) 鹽酸酒精分化，自來水洗； (17) 梯度酒席脫水，二甲苯透明； (18) 中性樹|父封片。
2. 根據權利要求1所述的高效細胞爬片免疫組化方法，其特征是：所述工具印章包括 印章基座，印章基座的底部設置多個方框凸起，方框凸起內為凹區。
3. 根據權利要求1或2所述的高效細胞爬片免疫組化方法，其特征是： 所述油墨由下列重量百分比的組分組成： 石蠟 15?20% 松香 2?3% 松節油 4?6% 汽油 20?26% 異丙醚 2?3% 二硫化碳 12?16% 二氯甲烷 2?5% 石油釀 2?3% 乙二醇丁醚 0. 8?1. 2% 乙醚 6?10% 丙酮 3?6% 環已麗 6?10% 四氯化碳 5?8% 微晶蠟 2?3% 蜂蠟 2?3%。 上述各組分用量之和為100%。
4.根據權利要求1或2所述的高效細胞爬片免疫組化方法，其特征是：培養皿的一個 角呈斜面形式，方便方位標識；培養皿蓋的一個角呈與培養皿本體呈斜面的角配合的斜面 形式；培養皿蓋與培養皿吻合口周緣的交錯深度> l〇mm。
【文檔編號】G01N33/532GK104101701SQ201410335507
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】鄂裘愷, 胡義揚, 郭紹文, 王敏燕, 韓志宏 申請人:上海中醫藥大學附屬曙光醫院