用于檢測25-羥基維生素d的檢測劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測羥基維生素D的檢測劑及其制備方法，以及其在25-羥基維生素D免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用。該檢測劑包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯(lián)物，以及被所述偶聯(lián)物包被的磁球。通過對25-羥基維生素D抗原衍生物進(jìn)行上述修飾，所產(chǎn)生的檢測劑的穩(wěn)定性得到明顯改善，對25-羥基維生素D檢測的特異性和準(zhǔn)確性也得到提高。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含所述檢測劑的25-羥基維生素D檢測試劑盒，其穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)。
【專利說明】用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素D是一種脂溶性維生素。人體中的維生素D僅有小部分來源于食物(< 10%),體內(nèi)所需的維生素D的90%來源于陽光中紫外線照射皮膚產(chǎn)生。維生素D在體內(nèi)出現(xiàn)的主要形式是維生素D2 (麥角鈣化醇)和維生素D3 (膽鈣化醇)。維生素D2的營養(yǎng)來源主要是一些蔬菜、酵母和真菌類食物，維生素D3是由皮下的7-脫氫膽固醇在陽光的作用下轉(zhuǎn)化而成。
[0003]食物源和自身合成的維生素D2和維生素D3經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，在25-羥化酶作用下分別轉(zhuǎn)化為25-0H維生素D2和25-0H維生素D3，總稱為25-0H維生素D。血清或血漿中25-0H維生素D的含量能反映事物攝入和自身合成的維生素D總量，因此25-0H維生素D是衡量維生素D營養(yǎng)狀態(tài)的最佳指標(biāo)。
[0004]25-羥基維生素D是人體內(nèi)存儲(chǔ)維生素D的主要形式，是人體內(nèi)代謝活動(dòng)不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。除了具有傳統(tǒng)意義上的骨骼效應(yīng)，還具有影響自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、腫瘤等非骨骼效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏會(huì)直接影響人類基因的表達(dá)，這些基因與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病等眾多疾病有關(guān)。
[0005]目前，臨床上對維生素D的定量檢測已成為常規(guī)檢測項(xiàng)目和體檢項(xiàng)目。建立一種快速，簡便，靈敏，準(zhǔn)確可靠的檢測維生素D水平的方法尤為重要。25-羥基維生素D的定量檢測主要有理化檢驗(yàn)方法和免疫學(xué)方法。理化檢驗(yàn)方法采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)，由于存在儀器昂貴、樣本前處理復(fù)雜、過程繁瑣費(fèi)時(shí)等缺陷，該方法的應(yīng)用受到限制。免疫學(xué)方法具有靈敏、快速、特異和簡便等優(yōu)勢，現(xiàn)在成為維生素D測定的主流方法。在目前的市場上，用于測定25-羥基維生素D的主流產(chǎn)品是意大利Diasorin公司生產(chǎn)的檢測試劑盒，檢測方法是采用標(biāo)記ABEI (N- (4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾)的25-羥基維生素D抗原衍生物和樣本中的抗原與包被于磁性微球上的25-羥基維生素D抗體競爭結(jié)合，然后加入激發(fā)底物產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)25-羥基維生素D的定量檢測，圖1更形象地展示了其操作原理(具體操作步驟及實(shí)驗(yàn)條件可參考其DiaSorin-VD說明書)。在檢測過程中，標(biāo)記ABEI的25-羥基維生素D抗原衍生物的穩(wěn)定性是影響檢測穩(wěn)定性的最主要的因素，而25-羥基維生素D抗原衍生物是一種穩(wěn)定性差，遇光、遇熱等都會(huì)導(dǎo)致活性下降的物質(zhì)，因此上述檢測試劑盒中的試劑穩(wěn)定性差，活性易下降。
[0006]因此，免疫學(xué)競爭法測定所采用的25-羥基維生素D抗原衍生物的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了 25-羥基維生素D免疫學(xué)方法測定試劑不能長期穩(wěn)定地保存，從而影響其使用和檢測結(jié)果，且保存條件苛刻，不方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸，這成為目前此類方法大規(guī)模商品化應(yīng)用的瓶頸。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對以上缺陷，本發(fā)明提供一種用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑，其是將25-羥基維生素D抗原衍生物偶聯(lián)至載體蛋白后固定到磁性微球上，通過固定至磁性微球使得抗原衍生物的穩(wěn)定性得到顯著提高，同時(shí)該衍生物的特定結(jié)構(gòu)使得25-羥基維生素D的測定更加準(zhǔn)確。
[0008]本發(fā)明還提供了上述用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑的制備方法以及采用上述檢測劑對25-羥基維生素D進(jìn)行免疫學(xué)檢測的方法，還提供了包含所述25-羥基維生素D檢測劑的試劑盒。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑，其包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯(lián)物，以及被所述偶聯(lián)物包被的磁球。
[0010]在現(xiàn)有技術(shù)中，用于檢測25-羥基維生素D的25-羥基維生素D抗原衍生物被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記，而25-羥基維生素D抗體則包被磁球，其作用原理如圖1所示。然而，該產(chǎn)品存在穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)。因?yàn)?5-羥基維生素D抗原衍生物具有光敏性，且容易被氧化，用發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記25-羥基維生素D抗原衍生物的過程中容易造成其部分失活，而且發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的25-羥基維生素D抗原衍生物在溶液中的長期穩(wěn)定性不好，容易造成活性下降。因此，用于檢測25-羥基維生素D的這類檢測劑的保存條件較為苛刻，穩(wěn)定性較差，從而造成使用期限較短、使用效果較差。
[0011]本發(fā)明將25-羥基維生素D抗原衍生物包被在固相載體磁球上，一方面減少了25-羥基維生素D抗原衍生物分子的自由度，另一方面磁球的顏色屏蔽了部分光照對25-羥基維生素D抗原衍生物分子的影響，因此大大增強(qiáng)了 25-羥基維生素D抗原衍生物在溶液中的穩(wěn)定性，從而可以延長其有效使用期限以及提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0012]在本發(fā)明中，用于制備所述檢測劑的25-羥基維生素D抗原衍生物可以是本領(lǐng)域中常用的，例如在美國專利申請US20130059825A1中所描述的25-羥基維生素D抗原衍生物，該專利申請的內(nèi)容通過引用而并入本文中。
[0013]在一些具體實(shí)施方案中，25-羥基維生素D抗原衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式(I):
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑，其包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯(lián)物，以及被所述偶聯(lián)物包被的磁球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測劑，其特征在于，所述25-羥基維生素D抗原衍生物的結(jié)構(gòu)式為:
其中，m 為 0、1、2 或 3，η 為 2、3、4、5 或 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測劑，其特征在于，所述蛋白載體選自牛血清白蛋白、陽離子牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛Y球蛋白和人Y球蛋白中的任一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測劑，其特征在于，所述磁球表面帶有環(huán)氧基、磺?；?、羧基、氨基、醛基、酰胺基、巰基和羥基中的一種或多種基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測劑，其特征在于，所述磁球的粒徑大小為0.8-3.0 μ mD
6.一種如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑的制備方法，包括使用所述25-羥基維生素D抗原衍生物和蛋白載體形成的偶聯(lián)物包被磁球。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在包被磁球之前，使用第一活化劑將磁球進(jìn)行活化處理，并將經(jīng)所述活化處理后的磁球分散于緩沖液中，并加入25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯(lián)物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)固液分離，清洗固體，得到所述檢測劑； 其中，所述第一活化劑為N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽中的至少一種或其與N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽中的至少一種的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯(lián)物的制備步驟，所述制備步驟包括使所述25-羥基維生素D抗原衍生物和所述蛋白載體在偶聯(lián)劑和溶劑的存在下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)生成所述偶聯(lián)物； 其中，所述偶聯(lián)劑選自戊二醛、N, N’ - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯中的至少一種；和/或所述溶劑選自二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮、氯仿中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯(lián)物的制備步驟，所述制備步驟包括: m)使25-羥基維生素D抗原衍生物帶有羧基，并使用第二活化劑進(jìn)行活化； η)將活化后的25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體在溶劑的存在下進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)分離得到所述偶聯(lián)物； 其中，所述第二活化劑為N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽中的至少一種和N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺、1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽中的至少一種的混合物；和/或所述溶劑選自二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮、氯仿中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體的摩爾比為10-20:1。
11.一種用于檢測25-羥基維生素D的免疫學(xué)方法，包括使結(jié)合標(biāo)記物的25-羥基維生素D抗體和如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的檢測劑與待測樣本中的25-羥基維生素D競爭結(jié)合 ?
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物選自熒光標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物、金標(biāo)記物或酶標(biāo)記物。
13.一種用于檢測25-羥基維生素D的發(fā)光免疫學(xué)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: a)將待測樣本與發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的25-羥基維生素D抗體進(jìn)行溫育； b)向步驟a)的混合物中加入如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的檢測劑，使所述發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的25-羥基維生素D抗體與所述檢測劑和待測樣本中的25-羥基維生素D競爭結(jié)合； c)磁分離，得到發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的25-羥基維生素D抗體與所述檢測劑的結(jié)合物； d)向步驟c)得到的結(jié)合物中加入激發(fā)底物，使其產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)； e)根據(jù)步驟d)測定的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算待測樣本中的25-羥基維生素D含量。
14.一種25-羥基維生素D免疫學(xué)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括結(jié)合標(biāo)記物的25-羥基維生素D抗體，以及如權(quán)利要求1-5中的任一項(xiàng)所述的用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記物選自熒光標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物、金標(biāo)記物或酶標(biāo)記物。
【文檔編號(hào)】G01N33/82GK104076155SQ201410328010
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】饒微, 李婷華, 杜凱, 袁錦云, 羅凱, 余慧玲 申請人:深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司