一種基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法
【專利摘要】本發明屬于生物分析與檢測【技術領域】，具體為一種基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法。本發明利用一鍋法合成包有長鏈聚乙二醇的磁球Fe3O4@PEG，再在PEG的末端羥基上接上三氟乙磺酰基或者將其氧化為醛基。這些活性基團稀疏地分布在磁性材料的表面，與膜蛋白上不同位點的游離氨基發生高效反應，從而將膜蛋白牢固地鍵合到材料表面。因此，膜蛋白的增溶劑以及磷脂等干擾物便可通過洗滌以及磁性分離的方法被輕松除去，從而達到理想的鑒定效果。實驗表明，利用該磁性材料固定膜蛋白具有反應效率高、非特異性吸附小等優點，并成功運用到膜蛋白組的鑒定上。本發明新穎便捷，實用高效，重復性好，穩定性高，具有巨大的推廣應用潛力。
【專利說明】一種基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物分析與檢測【技術領域】，具體為一種膜蛋白共價固定方法。 技術背景
[0002] 膜蛋白是一類具有特殊結構的蛋白質，執行著細胞內外物質交換、細胞識別與免 疫應答、信號傳導和調控，以及能量傳遞等重要功能。人類基因組編碼的蛋白質中有30%以 上為膜蛋白，而且在已經發現的藥物靶標中，大約有70%為膜蛋白。然而，到目前為止，被成 功鑒定的膜蛋白數量還很有限。
[0003] 膜蛋白組的研究面臨的挑戰主要是膜蛋白中低豐度蛋白以及疏水性蛋白的提取、 酶解以及分離等方面。目前廣泛利用基于Shot-gun方法的電泳技術來解決膜蛋白分離與 酶解的問題。但是，眾所周知電泳技術存在通量小、樣品損失大以及耗時耗力等弱點，這對 于體系復雜的膜蛋白來說是遠遠不夠的。因此，目前膜蛋白組學的研究真正需要的是一種 操作簡便，樣品損失率低，酶解效果好的方法。
[0004] 結合這一目標，本發明設計了一種利用新型磁性材料來共價固定膜蛋白，從而鑒 定膜蛋白的方法。這種方法，不僅能夠在不損失樣品的前提下，有效去除增溶劑等干擾物， 而且能夠增強膜蛋白的酶解效率，對于人Hela細胞膜蛋白得到了令人滿意的鑒定結果。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提出一種操作簡便，樣品損失率低，酶解效果好的膜蛋白共價 固定方法。
[0006] 本發明提出的膜蛋白共價固定方法，是基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法。本 發明利用長鏈PEG末端羥基數目少的特點，通過一鍋法合成新型磁核材料Fe 304@PEG，作為 核心，在磁核表面稀疏地修飾上能夠與蛋白游離氨基、羧基或巰基反應的活性基團。該新型 磁性材料可以隨機地與膜蛋白上不同位點的氨基、羧基或巰基反應，從而將膜蛋白牢固捕 獲在磁性材料表面。由于PEG具有很好的親水性和遷移性，磁球表面的長鏈PEG猶如章魚 觸須般能夠與膜蛋白表面甚至內部的氨基接觸，從而增加了末端活性基團與膜蛋白的反應 機會。同樣的，在酶解過程中，PEG的親水性可以增加其末端鍵合上的膜蛋白與蛋白水解酶 的碰撞幾率。
[0007] 本發明提出的基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法，具體步驟如下： (1) 磁性材料的合成：把二茂鐵和PEG-20000按照1:6-1:5的質量比均勻溶解在丙酮 中；逐滴加入30%過氧化氫（2%-4% (v/v))，然后轉移到不銹鋼反應釜中200-230° C反應 24-48 h，得到Fe304@PEG ;分別用丙酮和乙醇洗滌以去除多余的原料和未包裹的Fe304 ; (2) 將合成好的Fe304@PEG分散在二氯甲烷與吡啶中，逐滴加入三氟乙磺酰氯（100-200 yL/50 mg模板材料)，在室溫下氮氣氛圍中不斷攪拌18-24 h，制得Fe304@PEG-Tresyl材 料；或者將Fe30 4@PEG分散在醋酐與二甲基亞楓的混合液中，在室溫下氬氣氛圍中30-36 h， 制得 Fe304@PEG-Formyl 材料； (3)磁性材料共價固定膜蛋白并除去表面活性劑：使用4% (w/v) SDS溶液（pH 7.0-9.0)提取膜蛋白；將膜蛋白通過共價鍵合反應固定在步驟（1)制得的Fe304@ PEG-Tresyl或者Fe304@PEG-F〇rmyl材料表面上；然后通過水洗以或磁性分離的方法，去 除高濃度的SDS以及其他干擾物。
[0008] 本發明提出的基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法，可用于人Hela細胞膜蛋白 鑒定，具體地是使用4% SDS提取Hela細胞膜組分中的膜蛋白；隨即在膜蛋白溶液中加入 "類似章魚觸須"磁性材料以及反應所需緩沖溶液，反應2小時后，95%以上的膜蛋白被固定 在材料表面，并且每個膜蛋白上都有盡可能少的氨基參與反應。通過水洗以及磁性分離后， 高濃度的SDS、緩沖鹽以及磷脂等干擾物則可被徹底清除。未反應的三氟乙磺酰基團則通過 加入含有氨基的物質進行封閉，避免其捕獲酶解產生的肽段。
[0009] 使用Lys-C與Trypsin先后在10%的乙腈溶液中對被"章魚觸須"磁性材料捕獲 的膜蛋白進行酶解。由于膜蛋白的疏水部分在乙腈溶液中更容易舒展開，暴露出更多的酶 切位點，因此可以達到更好的酶解效果。然而乙腈濃度太高則會影響蛋白水解酶的酶解活 性，因此選擇10%濃度的乙腈可以平衡上述兩個因素。
[0010] 如圖2所示，通過本發明方法（即SDS-PAGE方法)，比較反應前后膜蛋白量的變化， 以及與標準蛋白BSA的條帶進行比較，可以證明本發明中所設計的"類似章魚觸須"磁性材 料共價固定膜蛋白的反應效率達到95%以上。不僅如此，該反應柱對膜蛋白的負載量也很 大，通過固定膜蛋白的量而改變材料的用量，可以得出負載量約為15 Pg/mg。另外，如圖3 所示，在高濃度SDS去除前的上清溶液中標準肽段pK-10的質譜峰很弱，背景信號也很復 雜，而經過三次水洗后，其上清溶液中可以看到明顯的質譜峰，并且背景信號非常干凈，由 此可以證明通過水洗以及磁性分離的方法能夠有效地去除高濃度SDS。利用該方法對人 Hela細胞中提取的膜蛋白進行固定，通過一維分離鑒定出822種膜蛋白，其中350種膜蛋白 含有跨膜結構。實驗結果充分證明，本發明制得的膜蛋白在線鑒定系統達到了實際應用的 要求，因而具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1 "類似章魚觸須"磁性材料的合成流程圖。
[0012] 圖2 "類似章魚觸須"磁性材料固定膜蛋白反應效率的SDS-PAGE膠照片。
[0013] 圖3標準肽段pK-10在高濃度SDS去除前（A)與三次水洗后（B)上清溶液中的質 譜圖。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 :表面修飾三氟乙磺酰基的"類似章魚觸須"磁性材料合成 二茂鐵和PEG-20000均勻溶解在丙酮中。逐滴加入過氧化氫后，轉移到不銹鋼反應釜 中230° C反應36 h。得到的Fe304@PEG模板分別用丙酮和乙醇洗滌以去除多余的原料和 未包裹的Fe 304。將合成好的Fe304@PEG分散在二氯甲烷與吡啶中，逐滴加入三氟乙磺酰氯， 在室溫下氮氣氛圍中不斷攪拌18 h。最后，用酸化乙醇洗滌材料并在真空干燥箱中干燥備 用。
[0015] 實施例2 :表面修飾三氟乙磺酰基的"類似章魚觸須"磁性材料在人Hela細胞膜蛋 白鑒定實驗中的應用 按照密度梯度離心的方法提取Hela細胞膜組分，并用4% SDS溶液（pH 8.0)提取膜組 分中的膜蛋白。使用BCA的蛋白定量方法對膜蛋白溶液進行定量。用反應緩沖液（1 M PBS 與4 % SDS的混合溶液，pH 9.0)將膜蛋白稀釋至0.5 Pg/^L，加入8 mg合成好的材料，在 37 °C酶解儀中反應2 h。通過水洗以及磁性分離的方法將高濃度的SDS以及其他干擾物完 全去除。再加入Tris-HCl和NaCl的混合溶液（pH 8.0)來封閉未反應的三氟乙磺酸基 團。經過水洗后，先后加入10 mM二硫蘇糖醇（DTT)以及25 mM卩引哚-3-乙酸（IAA)進行 固定蛋白的還原烷基化。最后將固定有膜蛋白的"類似章魚觸須"磁性材料分散在含有10% 乙腈的25 mM碳酸氫胺溶液中，先后加入Lys-C和Trypsin兩種蛋白水解酶在37 °C酶解 儀中過夜酶解。
[0016] 實施例3 :表面修飾醛基的"類似章魚觸須"磁性材料合成 將合成好的Fe304@PEG分散在醋酐與二甲基亞楓的混合液中，在室溫下氬氣氛圍中 30h。最后，在冷凍的無水乙醚中沉析2次，取出抽濾，真空干燥，并保存在1%的戊二醛中。
[0017] 實施例4 :表面修飾醛基的"類似章魚觸須"磁性材料在人Hela細胞膜蛋白鑒定實 驗中的應用 用反應緩沖液（〇. 1 M PBS與4 % SDS的混合溶液，pH 8. 0)將膜蛋白稀釋至0. 5 Pg/ μ?，加入10 mg合成好的材料以及氰基硼氫化鈉，過夜反應。通過水洗以及磁性分離的方法 將高濃度的SDS以及其他干擾物完全去除。再加入Tris-HCl與氰基硼氫化鈉的混合溶 液（pH 8.0)來封閉未反應的醛基。經過水洗后，先后加入DTT)以及IAA進行固定蛋白的 還原烷基化。最后將固定有膜蛋白的"類似章魚觸須"磁性材料分散在含有10%乙腈的25 mM碳酸氫胺溶液中，先后加入Lys-C和Trypsin兩種蛋白水解酶在37 °C酶解儀中過夜酶 解。
【權利要求】
1. 一種基于磁性材料的膜蛋白共價固定方法，其特征在于具體步驟如下： (1) 磁性材料的合成：把二茂鐵和PEG-20000按照1:6-1:5的質量比均勻溶解在丙 酮中；逐滴加入30%的體積濃度為2%-4% (v/v)的過氧化氫，然后轉移到不銹鋼反應釜中 200-230° C反應24-48 h，得到Fe304@PEG;分別用丙酮和乙醇洗滌以去除多余的原料和未 包裹的Fe 304 ; (2) 將合成好的Fe304@PEG分散在二氯甲烷與吡啶中，逐滴加入100-200 yL/50 mg 模板材料三氟乙磺酰氯，在室溫下氮氣氛圍中不斷攪拌18-24 h，制得Fe304@PEG-TreSyl材 料；或者將Fe 304@PEG分散在醋酐與二甲基亞楓的混合液中，在室溫下氬氣氛圍中30-36 h， 制得 Fe304@PEG-Formyl 材料； (3) 磁性材料共價固定膜蛋白并除去表面活性劑：使用pH為7. 0-9. 0的4%(w/v) SDS 溶液提取膜蛋白；將膜蛋白通過共價鍵合反應固定在步驟（1)制得的Fe304@PEG-Tr eSyl或 者Fe304@PEG-F〇rmyl材料表面上；然后通過水洗以或磁性分離的方法，去除高濃度的SDS 以及其他干擾物。
2. 如權利要求1所述方法在各種細胞或組織膜蛋白鑒定中的應用。
【文檔編號】G01N30/06GK104090050SQ201410320891
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2014年7月8日
【發明者】張祥民, 劉一穎, 晏國全, 高明霞 申請人:復旦大學