一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)樣品分類，分別剪成小段；(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；(3)dd水60℃清洗5min，吸干；(4)二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干；(5)dd水60℃清洗5min，吸干；(6)0.1M甲醇堿KOH，室溫30min，吸干；(7)dd水60℃清洗5min，吸干；(8)磨碎：用水浸濕，液氮研磨；(9)提取：200μL?of7M尿素，2M硫脲，50mM?Tris，and50mM?TCEP，pH4，室溫，過夜消化；.(10)純化步驟。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明屬于化學【技術領域】，涉及一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法。 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法
【背景技術】
[0002] 毛發蛋白主要是角蛋白組成，而角蛋白分子間主要是靠二硫鍵形成穩定的空間網 狀結構。溶解毛發中的蛋白主要是使二硫鍵（-s-s)斷裂，此外蛋白質分子間高密度的氫 鍵、鹽式鍵等也不能忽視。目前國內現有蛋白質提取技術時間相對較長，程序繁瑣，不利于 實驗室高通量大規模地應用，制備角蛋白主要有一下幾種方法：1)機械法，有高壓水解法、 膨化法、擠壓法和擠出法。主要是加熱（100?200°C )、加壓（0. 294?0. 98MPa)的方法使 角蛋白內部的二硫鍵斷裂水解，從而使其變為可溶、易消化的多肽混合物。2)化學法，有酸 堿法、還原法、氧化法和金屬鹽法。機械法不僅能夠讓二硫鍵發生斷裂，還能讓多肽鏈發生 斷裂，得率不高，不利于對蛋白質組成份分析。化學法中的酸堿法提取過程中會產生堿性廢 水和廢酸的蒸汽，污染環境，并對人體有害。近年人們更多地采用還原法制備可溶性角蛋白 研究蛋白質。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種快速提取純化檢測毛樣蛋 白方法。其具體技術方案為：
[0004] 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，包括以下步驟：
[0005] (1)樣品分類，分別剪成小段；
[0006] (2)0.15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚601：清洗201^11，吸干；
[0007] (3) dd 水 60°C 清洗 5min，吸干；
[0008] (4)二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干；
[0009] (5)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0010] (6) 0· 1M 甲醇堿 Κ0Η，室溫 30min，吸干；
[0011] (7)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0012] (8)磨碎：用水將毛絨浸濕后在液氮中研磨粉碎；
[0013] (9)提取：取粉末 200mg 加入 500yL of7M 尿素、2M硫脲、50mM Tris 和 50mM TCEP 溶液（pH4)，37°C，振蕩消化過夜；.
[0014] (10)純化步驟
[0015] 1).取0. 1ml消化液至2ml離心管，加入0. 4ml甲醇，渦旋混勻；
[0016] 2) ·再加入0· 2ml氯仿，渦旋混勻；
[0017] 3)再加入0. 3ml超純水，劇烈震蕩，10000g離心，lmin ;
[0018] 4).小心棄掉上清；
[0019] 5).加入0· 3ml甲醇，渦旋混勻，10000g，離心2min ;
[0020] 6).棄掉上清，倒置室溫干燥，備下一步使用；
[0021] 7). 50-100微升IX蛋白上樣緩沖液溶解，沸水浴5min，備SDS-PAGE跑膠使用。
[0022] 進一步優選，步驟（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的體積比為V/V2 : 1。
[0023] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0024] 本發明采用的"壬基酚聚氧乙烯（9)醚"非離子表面活性劑，能夠有效的清洗毛樣 表面污漬，再用二氯甲烷和乙醇祛除內部脂質，再用甲醇堿祛除結合脂肪酸。通過物理粉 碎，采用還原法，Tris (2_carboxyethyl)phosphine (TCEP)還原角蛋白二硫鍵，再利用利用 高濃度尿素和硫脲使其蛋白膨脹溶解，最終得到可溶性蛋白質，該方法反應活性溫和易溶、 毒性小，而更容易操作和應用后續蛋白質譜分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖1為SDS-PAGE檢測結果，其中：M為預染蛋白marker(14. 4-120KD) ;1為陜北白 絨山羊A的毛樣，2、3為陜北白絨山羊A的絨毛羊；4為陜北白絨山羊B的毛樣，5、6為陜北 白絨山羊B的絨毛羊。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0027] 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，包括以下步驟：
[0028] (1)樣品分類，分別剪成小段；
[0029] (2)0.15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚601：清洗201^11，吸干；
[0030] (3) dd 水 60°C清洗 5min，吸干；
[0031] (4)二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干；
[0032] (5)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0033] (6) 0· 1M 甲醇堿 Κ0Η，室溫 30min，吸干；
[0034] (7)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0035] (8)磨碎：用水將毛絨浸濕后在液氮中研磨粉碎；
[0036] (9)提取：取粉末 200mg 加入 500 μ L of7M 尿素、2M硫脲、50mM Tris 和 50mM TCEP 溶液（pH4)，37°C，振蕩消化過夜；.
[0037] (10)純化步驟
[0038] 1).取0. 1ml消化液至2ml離心管，加入0. 4ml甲醇，渦旋混勻；
[0039] 2).再加入0. 2ml氯仿，渦旋混勻；
[0040] 3)再加入0. 3ml超純水，劇烈震蕩，10000g離心，lmin ;
[0041] 4).小心棄掉上清；
[0042] 5) ·加入0· 3ml甲醇，渦旋混勻，10000g，離心2min ;
[0043] 6).棄掉上清，倒置室溫干燥，備下一步使用；
[0044] 7). 50-100微升IX蛋白上樣緩沖液溶解，沸水浴5min，備SDS-PAGE跑膠使用。
[0045] 步驟（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的體積比為V/V2 : 1。
[0046] 將得到的膠條送至華大公司測序得到如下結果：
[0047] 陜北白絨山羊A :毛樣檢測出205種毛蛋白，絨樣檢測出252種毛蛋白。
【權利要求】
1. 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品分類，分別剪成小段； (2) 0. 15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚60°C清洗20min，吸干； (3) 超純水6(TC清洗5min，吸干； (4) 二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干； (5) 超純水60°C清洗5min，吸干； (6) 0· 1M甲醇堿KOH，室溫30min，吸干； (7) 超純水60°C清洗5min，吸干； (8) 磨碎：用水浸濕，液氮研磨； (9) 提取：200yL of7M 尿素，2M 硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4,室溫，過夜消 化;· (10) 純化步驟 1) .向0. lml蛋白溶液中加入0.4ml甲醇，渦旋，瞬時離心，10s ; 2) .再加入0. 2ml氯仿，渦旋，瞬時離心，10s ; 3) 再加入0. 3ml ddH20,劇烈震蕩，瞬時離心，lmin ; 4) .小心棄掉上清，用槍吸； 5) .加入0.3ml甲醇，潤旋，瞬時離心，2min，沉淀； 6) .棄掉上清，倒置室溫干燥，干燥完成后保存備用； 7) . 50-100微升5 % SDS溶解蛋白，不容物可用蛋白上樣buffer溶解，備用，跑 SDS-PAGE。
2. 快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，其特征在于，步驟（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗 的體積比為V/V2 : 1。
【文檔編號】G01N1/28GK104101524SQ201410318956
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】王小龍, 陳玉林, 周光現, 牛怡源, 師丙波 申請人:西北農林科技大學