利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法
【專利摘要】本發明一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法，將篩選單克隆抗體雜交瘤細胞所需的靶抗原或靶抗原類似物點樣固定于基片上，將制備好的抗原芯片浸于封閉液中進行封閉處理，再將抗原芯片浸于單克隆抗體制備前期所獲得的陽性雜交瘤細胞產生的細胞上清液中，再將抗原芯片浸于酶標二抗中，再將抗原芯片浸于顯色液中，進行顯色反應，如果在樣點處有褐色、或者藍黑色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于此處的靶抗原或靶抗原類似物存在特異性的免疫反應；若在樣點處沒有斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于此處的抗原或抗原類似物不存在特異性的反應。本發明縮短了單克隆抗體雜交瘤細胞的篩選周期，降低了生產成本。
【專利說明】利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，尤其涉及一種篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法，具 體來說是一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 生物芯片技術是上世紀90年代初發展起來的一種高通量、大規模并行分析檢測 技術，曾被Science雜志兩度評為年度十大科技突破之一，它是利用分子間特異相互作用 的原理，將多種技術（如生物化學、微加工、微電子、計算機等）融為一體的一項分析檢測技 術。與傳統分析檢測方法所不同的是，它形成的微陣列使生化分析反應過程高度集成于某 一載體之上，高通量地分析檢測成百上千種DNA、RNA、多肽、蛋白質等分子。目前常見的生 物芯片有：基因芯片、蛋白質芯片、糖芯片以及其他小分子生物芯片。
[0003] 蛋白質芯片是將各種蛋白質（如抗原、抗體）、多肽以及受體、配體等有序固定于 某一載體（如多孔膜、凝膠、玻片、納米微珠和微孔板）之上，以分析檢測樣品中能與之特 異相互作用的成分。雖然蛋白質芯片是在蛋白質組學的研究背景下產生的，但其應用不僅 僅只局限于蛋白質組學。凡是有關抗體一抗原、蛋白質一蛋白質、蛋白質一核酸、蛋白質一 脂類、蛋白質一小分子以及酶與底物相互作用的研究中，蛋白質芯片技術均有其獨特的用 途。目前主要應用于蛋白質組學、食品檢驗、疾病診斷、藥物篩選、農林畜牧業、司法鑒定等 領域。
[0004] 單克隆抗體技術，是指將某種抗原誘導產生的特異性B淋巴細胞和骨髓瘤細胞經 融合，形成雜交瘤細胞，并分離篩選出單個雜交瘤細胞，再將其擴增，最終分離純化制得單 克隆抗體。雜交瘤細胞具有雙重特性，既能如骨髓瘤細胞般持續繁殖，又能如B淋巴細胞般 分泌針對單一抗原決定簇的特異性抗體，即單克隆抗體。盡管單克隆抗體越來越廣泛地應 用于各個研究領域，但是自1975年問世以來，制備單克隆抗體一直沿用傳統方法，成為這 一經典技術發展的瓶頸。制備單克隆抗體包括抗原制備、動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞 的篩選、亞克隆、凍存復蘇、雜交瘤細胞及單克隆抗體特性的鑒定以及單克隆抗體的大量生 產等一系列復雜步驟，一般要花費6個月以上的時間。其中雜交瘤細胞的篩選這一步驟最 為耗時。
[0005] 目前篩選單克隆抗體雜交瘤細胞，都是采用間接酶聯免疫法（間接ELISA法）篩 選出無交叉反應、高親和力的雜交瘤細胞，即把靶抗原以及不能有交叉反應的靶抗原類似 物包被在96孔酶標板上，逐一用融合后的陽性雜交瘤細胞去篩選每種抗原，選擇那些只針 對靶抗原有陽性反應，而放棄那些和靶抗原反應弱，或者和靶抗原類似物有交叉反應的雜 交瘤細胞。而且要獲得特異性高、親和力高、穩定性好的雜交瘤細胞通常需要3、4輪的篩 選，這種逐一篩選的方法篩選周期長、成本高，需要酶標儀、洗板機等專業設備，而且實驗人 員需要豐富的經驗。例如，就食源性致病菌單克隆抗體的制備來說，在雜交瘤細胞制備過程 中，通常一次融合，一般會有1000多孔雜交瘤細胞，融合較好的時候100%的孔里都有雜交 瘤細胞生長，但是最終只有不到10%的孔里面含有目標雜交瘤細胞，所以要從如此多的雜 交瘤細胞中篩選出目標雜交瘤細胞，其篩選量是非常巨大的。一輪篩選通常需要進行幾十 次間接ELISA實驗，花費數周時間，這大大增加了單克隆抗體的制備周期，也增加了生產成 本。就雜交瘤細胞特異性篩選這一試驗，通常需要對實驗前期所獲得的幾十株陽性雜交瘤 細胞的幾十種靶抗原以及不能有交叉反應的靶抗原類似物進行交叉反應的試驗。最終，限 制了單克隆抗體制備技術的發展以及相關免疫學鑒定技術體系的建立與發展。
【發明內容】
[0006] 針對上述現有單克隆抗體雜交瘤細胞篩選技術中存在的缺陷，本發明所要解決的 技術問題是提供一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法，所述的這種 方法解決了現有單克隆抗體雜交瘤細胞篩選技術周期長、成本高的技術問題。
[0007] 本發明一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法，包括如下步 驟：
[0008] 1) -個制備用于篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的抗原芯片的步驟，在所述的制備抗 原芯片的步驟中，將篩選單克隆抗體雜交瘤細胞所需的靶抗原或者靶抗原類似物按陣列方 式點樣固定于基片上，制成抗原芯片；
[0009] 2)將制備好的抗原芯片浸于芯片封閉液中進行封閉處理；
[0010] 3)將封閉處理后的抗原芯片浸于單克隆抗體制備前期所獲得的陽性雜交瘤細胞 產生的細胞上清液中，進行免疫雜交反應；
[0011] 4)將上述處理好的抗原芯片浸于過氧化物酶、或者堿性磷酸酶標二抗中，進行免 疫雜父反應；
[0012] 5)將免疫雜交后的抗原芯片浸于二氨基聯苯胺、或者聯苯胺、或者氯化硝基四氮 唑蘭顯色液中，進行可視化顯色反應；
[0013] 6) -個結果判定的步驟，在所述的結果判定的步驟中，如果在樣點處有褐色、或者 藍黑色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于此處的靶抗原或者靶抗原類似物存在特 異性的免疫反應；若在樣點處沒有褐色、或者藍黑色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固 定于此處的靶抗原或者靶抗原類似物不存在特異性的反應。
[0014] 進一步的，所述的靶抗原及靶抗原類似物為細菌、或者病毒、或者小分子抗原、或 者蛋白質、或者重金屬抗原、或者支原體、或者衣原體。
[0015] 進一步的，所述的基片為硝酸纖維素膜、或者醋酸纖維素膜、或者PVDF膜、或者玻 片、或者硅片、或者凝膠、或者微孔板中的任意一種。
[0016] 進一步的，所述的靶抗原類似物不能有交叉反應。
[0017] 本發明將制備好的抗原芯片浸于芯片封閉液中進行封閉處理是為防止檢測結果 背景值偏高影響檢測結果的判斷。
[0018] 本發明所建立的篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法可以進行高通量的篩選，一次 可以篩選幾十個、上百個靶抗原及靶抗原類似物。本發明由于采用了過氧化物酶、或者堿 性磷酸酶與二氨基聯苯胺、或者聯苯胺、或者氯化硝基四氮唑蘭底物的顯色技術，采用這種 方法的結果的判定不需借助于任何設備，檢測結果肉眼可見，即可視化。如果在樣點處有褐 色、或者藍黑色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于此處的抗原存在特異性的免疫 反應；若在樣點處沒有褐色、或者藍黑色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于此處的 抗原不存在特異性的反應。依據此方法，即可從所得的結果中篩選出與其他抗原類似物無 明顯交叉反應，且親和力較高的雜交瘤細胞繼續亞克隆，最終篩選出特異性高、親和力高、 穩定性好的雜交瘤細胞。
[0019] 本發明的這種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法，因將大量 篩選所需的靶抗原及靶抗原類似物點樣集成于一張厘米見方的芯片上，利用所述的方法進 行單克隆抗體雜交瘤細胞的篩選，2. 5h即可完成幾十株雜交瘤細胞的篩選工作，這大大縮 短了單克隆抗體雜交瘤細胞的篩選周期，從而縮短了單克隆抗體的制備周期，降低了生產 成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為用于篩選志賀氏菌單克隆抗體雜交瘤細胞抗原芯片的點樣示意圖。
[0021] 圖2為用于篩選志賀氏菌單克隆抗體雜交瘤細胞抗原芯片的結果實物圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。
[0023] 實施例1志賀氏菌單克隆抗體雜交瘤細胞的篩選
[0024] 利用本發明提供的一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法 對志賀氏菌的17株單克隆抗體雜交瘤細胞進行篩選。具體方法如下：
[0025] (一）抗原芯片的制備
[0026] 結合圖1所示，將表1中39種志賀氏菌和其它致病菌（抗原類似物）（濃度為 108CFU/mL)以及陽性對照、陰性對照用生物芯片點樣儀在硝酸纖維素膜上進行點樣，后置 于4 °C儲存備用。
[0027] 所述基片大小為16mmX 16mm，所固定的樣點陣列如圖1所不，第一行依次為1-7號 致病菌；第二行依次為8-14號致病菌；第三行依次為15-21號致病菌；第四行依次為22-28 號致病菌；第五行依次為29-35號致病菌；第六行依次為36-39號致病菌，以及3個陰性對 照；第七行全部為陽性對照。
[0028] 表1固定于基片上的39種致病菌
[0029]
【權利要求】
1. 一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法，其特征在于包括如下 步驟： 1) 一個制備用于篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的抗原芯片的步驟，在所述的制備抗原芯 片的步驟中，將篩選單克隆抗體雜交瘤細胞所需的靶抗原或者靶抗原類似物按陣列方式點 樣固定于基片上，制成抗原芯片； 2) 將制備好的抗原芯片浸于芯片封閉液中進行封閉處理； 3) 將封閉處理后的抗原芯片浸于單克隆抗體制備前期所獲得的陽性雜交瘤細胞產生 的細胞上清液中，進行免疫雜交反應； 4) 將上述處理好的抗原芯片浸于過氧化物酶、或者堿性磷酸酶標二抗中，進行免疫雜 交反應； 5) 將免疫雜交后的抗原芯片浸于二氨基聯苯胺、或者聯苯胺、或者氯化硝基四氮唑蘭 顯色液中，進行顯色反應； 6) -個結果判定的步驟，在所述的結果判定的步驟中，如果在樣點處有褐色、或者藍黑 色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于此處的靶抗原或者靶抗原類似物存在特異性 的免疫反應；若在樣點處沒有褐色、或者藍黑色斑點顯出，則判斷該孔雜交瘤細胞與固定于 此處的靶抗原或者靶抗原類似物不存在特異性的反應。
2. 如權利要求1所述的一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法， 其特征在于：所述的靶抗原及靶抗原類似物為細菌、或者病毒、或者小分子抗原、或者蛋白 質、或者重金屬抗原、或者支原體、或者衣原體。
3. 如權利要求1所述的一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法， 其特征在于：所述的基片為硝酸纖維素膜、或者醋酸纖維素膜、或者PVDF膜、或者玻片、或 者硅片、或者凝膠、或者微孔板中的任意一種。
4. 如權利要求1所述的一種利用可視化抗原芯片篩選單克隆抗體雜交瘤細胞的方法， 其特征在于：所述的靶抗原類似物不能有交叉反應。
【文檔編號】G01N33/577GK104062431SQ201410310870
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月1日 優先權日:2014年7月1日
【發明者】劉箐, 邱實 申請人:上海理工大學