一種快速檢測維生素d的試紙條的制作方法

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一種快速檢測維生素d的試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測維生素D的試紙條，包括不吸水的支撐板，所述支撐板上依次設置有樣品墊、結合墊、層析膜和吸收墊，所述結合墊上包被有標記物標記的維生素D與載體蛋白的偶聯物，所述層析膜為硝酸纖維素膜，層析膜上設置有質控C線和檢測T線，所述檢測T線位于結合墊和質控C線之間，檢測T線上包被有維生素D特異性抗體，質控C線上包被有能夠與載體蛋白結合的特異性抗體。本發明的試紙條使用方便，操作簡單，檢測速度快，容易普及到基層醫療單位使用，滿足市場需求，能夠填補國內外市場空白，試紙條結果判斷容易，用符號表示，擺脫了維生素D檢測對設備、儀器以及人員的特殊要求。
【專利說明】-種快速檢測維生素 D的試紙條

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測【技術領域】，具體涉及一種快速檢測維生素 D的試紙條。

【背景技術】
[0002] 維生素 D在調節人體內鈣代謝、維持肌肉骨骼和免疫系統的健康和穩定、預防部分惡性腫瘤發生有著不可或缺的作用。聯合國衛生組織統計數據顯示，全球大約90%人口患有維生素 D不足之癥。由于維生素 D的分子特性（高度親脂性）使其分離提純難度增力口，檢測條件要求高，限制了維生素 D檢測在臨床的推廣應用，也限制了我們獲得更多的有關維生素 D的信息。到目前為止，已經報道并被臨床接受的人血清維生素 D檢測方法有試劑盒檢測以及儀器檢測兩類。
[0003] 一、儀器檢測。1)直接檢測法（Direct Detection Methodology)。這類方法中最著名的是液相色譜分析法（HPLC)以及后來改進了的液相色譜-質譜聯用分析法（LC/MS)。 2)自動分析檢測儀（Automated Instrumentation Methodology)。儀器檢測其優點是精確度高，缺點是儀器投資大，樣品必須有機溶劑提取并純化，分析人員需要經過專業培訓，并且分析過程中有機溶劑消耗大，不利于環境保護。目前直接分析法多局限于研究型實驗室使用。
[0004] 美國的 Nichols Institute Diagnostics 公司，DiaSorin 公司以及德國 Roche Diagnostics公司分別宣布其研發出血清維生素 D自動檢測儀器。應用此類自動分析儀，血清樣品不需要任何前期處理即可直接進行檢測。此類儀器檢測的原理是化學熒光分析技術。其優點是儀器自動完成樣品的分離，提取，檢測，數據整理，結果判斷等步驟。樣品的檢測周期約一個半小時。其缺點是自動分析儀價格尤其昂貴，限制了其的推廣使用。
[0005] 二、試劑盒檢測，按作用原理又分為以下幾種：
[0006] 1)競爭性蛋白結合分析法（CPBA)
[0007] 2)放射免疫分析法（RIA)
[0008] 3)酶聯免疫吸附法（ELISA)
[0009] 目前已有的試劑盒檢測分析方法基本上均使用免疫反應板，通過直接或間接酶聯免疫反應檢測樣品中維生素 D含量。在這些檢測方法中，絕大多數需要進行樣品的有機溶劑提取，一些方法中反應物有同位素標記，易造成環境有機溶劑以及放射性物質污染，且檢測必須由專業人員在實驗室通過儀器操作完成。平均檢測過程在100分鐘左右。
[0010] 由上述分析可以看出，目前已有的維生素 D檢測方法，無論儀器檢測或酶聯免疫反應板檢測，其均存在著儀器設備投資高，檢測人員要求高，檢測過程中有機溶劑或放射性物質污染等問題，使得維生素 D檢測普及受到限制，這也造成臨床用藥缺少檢驗指標支持，用藥帶有極大的盲目性，甚至給患者身體帶來更多的危害。為此，開發一種操作簡便、快速、價格低、適合基層推廣使用的血清維生素 D檢測方法是未來的發展趨勢，也是臨床工作者和廣大患者的迫切要求。
[0011] 側向層流免疫分析技術興起在上世紀90年代，在近10年有了長足的發展，已經被廣泛應用于快速檢測診斷領域。而維生素 D的檢測由于樣品提純過程復雜，樣品不穩定，標準參照物難得等等原因，一直未能在臨床廣泛開展。

【發明內容】

[0012] 本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種快速檢測維生素 D的試紙條。該試紙條是基于競爭性免疫結合原理，采用側向層析法檢測維生素 D濃度，其檢測方法簡單、結果易于判斷、檢測成本低廉，適合在基層醫院、診所以及體檢中心等單位使用，對于降低維生素 D檢測成本、普及人體維生素 D檢測、減少臨床盲目用藥具有重要意義。
[0013] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種快速檢測維生素 D的試紙條，包括不吸水的支撐板，所述支撐板上依次設置有樣品墊、結合墊、層析膜和吸收墊，其特征在于，所述結合墊上包被有標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物，所述層析膜為硝酸纖維素膜，層析膜上設置有質控C線和檢測T線，所述檢測T線位于結合墊和質控C線之間，檢測T線上包被有維生素 D特異性抗體，質控C線上包被有能夠與載體蛋白結合的特異性抗體。
[0014] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述標記物為膠體金顆粒。
[0015] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述載體蛋白為牛血清白蛋白，能夠與載體蛋白結合的特異性抗體為BSA免疫球蛋白。
[0016] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述載體蛋白為雞卵清白蛋白，能夠與載體蛋白結合的特異性抗體為兔抗雞卵清白蛋白。
[0017] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述維生素 D為25-羥基維生素 D3或 25-羥基維生素 D2。
[0018] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述檢測T線和質控C線之間的距離為 lcm〇
[0019] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述維生素 D特異性抗體為鼠抗維生素 D單克隆抗體，維生素 D特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為0. 25mg/mL?5mg/mL。
[0020] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述能夠與載體蛋白結合的特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為0· lmg/mL?1. Omg/mL。
[0021] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，所述標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物的制備方法包括以下步驟：
[0022] 步驟一、將lmg?10mg維生素 D溶解于100 μ L有機溶劑中，然后在攪拌條件下向10mL濃度為0. lmg/mL?5mg/mL的載體蛋白溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為1 %? 3%，攪拌5min?20min后移至4°C下攪拌反應16h?18h，反應后的反應液用PBS緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用 0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯物，-20°C保存備用；
[0023] 步驟二、向標記物溶液中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯物至溶液中維生素 D的終濃度為10 μ g/mL?1000 μ g/mL，攪拌5min后加入BSA溶液至BSA的質量體積百分濃度為〇. 1 %?1 %，在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的質量體積百分濃度為0. 1 %?1 %，繼續反應5min后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物。
[0024] 上述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，步驟一中所述有機溶劑為正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環。
[0025] 本發明與現有技術相比具有以下優點：
[0026] 1、本發明的快速檢測維生素 D的試紙條是基于競爭性免疫結合原理，采用側向層析法檢測維生素 D濃度，其檢測方法簡單、結果易于判斷、檢測成本低廉，適合在基層醫院、診所以及體檢中心等單位使用，對于降低維生素 D檢測成本、普及人體維生素 D檢測、減少臨床盲目用藥具有重要意義。
[0027] 2、本發明的試紙條使用方便，操作簡單，檢測速度快，容易普及到基層醫療單位使用，滿足市場需求，能夠填補國內外市場空白。
[0028] 3、本發明的試紙條結果判斷容易，用符號表示，擺脫了維生素 D檢測對設備、儀器以及人員的特殊要求。
[0029] 4、本發明的試紙條不僅可采用膠體金顆粒作為標記物，還可采用熒光化學物質、染色劑、乳膠顆粒、酶或磁性顆粒作為標記物，按照常規方法進行維生素 D與載體蛋白的偶聯物的標記。
[0030] 下面結合附圖和實施例，對本發明的技術方案作進一步的詳細描述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明試紙條的結構示意圖。
[0032] 附圖標記說明：
[0033] 1-支撐板；2-樣品墊；3-結合墊；
[0034] 4一層析膜；5-檢測T線；6-質控C線；
[0035] 7-吸收墊。

【具體實施方式】
[0036] 實施例1標記物標記的維生素 D (25-羥基維生素 D3)與載體蛋白的偶聯物的制備
[0037] 步驟一、將 lmg 維生素 D (25〇HD33_HS，購于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解于100 μ L有機溶劑（正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環）中，然后在攪拌條件下向10mL濃度為0. lmg/mL的載體蛋白（牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為1%，攪拌5min后移至4°C下攪拌反應16h，反應后的反應液用 PBS緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用〇. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯物，-20°C保存備用；
[0038] 步驟二、向40nm膠體金溶液（0D1. 0,購于上海杰一生物公司）中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯物至溶液中維生素 D的終濃度為10 μ g/mL，攪拌5min后加入 BSA溶液至BSA的終濃度（質量體積百分濃度）為0· 1 % (即100mL溶液中含0· lg BSA)，在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的終濃度（質量體積百分濃度）為0. 1% (S卩100mL溶液中含0. lg聚乙二醇），繼續反應5min后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到標記物膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物（含維生素 D30ng/mL? 40ng/mL)〇
[0039] 實施例2標記物標記的維生素 D (25-羥基維生素 D2)與載體蛋白的偶聯物的制備
[0040] 步驟一、將 5mg 維生素 D (25〇HD2,購于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解于100 μ L有機溶劑（正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環）中，然后在攪拌條件下向10mL濃度為2mg/mL的載體蛋白（牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為2%，攪拌10min后移至4°C下攪拌反應17h，反應后的反應液用PBS 緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯物，-20°C保存備用；
[0041] 步驟二、向40nm膠體金溶液（0D1. 0,購于上海杰一生物公司）中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯物至溶液中維生素 D的終濃度為100 μ g/mL，攪拌5min后加入BSA溶液至BSA的終濃度（質量體積百分濃度）為0. 5%，在4°C下避光攪拌反應30min 后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的終濃度（質量體積百分濃度）為0. 5%，繼續反應5min 后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到標記物膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物 (含維生素 D30ng/mL ?40ng/mL)。
[0042] 實施例3標記物標記的維生素 D (25-羥基維生素 D3)與載體蛋白的偶聯物的制備
[0043] 步驟一、將 10mg 維生素 D (25〇HD3,購于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解于100 μ L有機溶劑（正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環）中，然后在攪拌條件下向10mL濃度為5mg/mL的載體蛋白（牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為3%，攪拌20min后移至4°C下攪拌反應18h，反應后的反應液用PBS 緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯物，-20°C保存備用；
[0044] 步驟二、向40nm膠體金溶液（購于上海杰一生物公司）中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯物至溶液中維生素 D的終濃度為1000 μ g/mL，攪拌5min后加入 BSA溶液至BSA的終濃度（質量體積百分濃度）為1. 0%，在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的終濃度（質量體積百分濃度）為1. 0%，繼續反應5min后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物（含維生素 D30ng/mL ?40ng/mL)。
[0045] 實施例4維生素 D單克隆抗體的制備
[0046] 以實施例1、實施例2或實施例3的步驟一中制備的維生素 D與載體蛋白的偶聯物作為免疫原，按50 μ g/只?200 μ g/只的劑量免疫Balb/c小鼠，使其產生抗血清；約6-8 周后取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞；所得雜交瘤細胞應用25-輕基維生素 D3包被的免疫反應板，經過酶聯免疫反應篩選得到穩定分泌抗25-羥基維生素 D3的單克隆抗體的細胞株，篩選得到的細胞株經過克隆復選，復選采用25-羥基維生素 D2 包被的免疫反應板，得到穩定分泌抗25-羥基維生素 D的單克隆抗體的細胞株；在DMEM 培養液中擴增培養細胞，細胞培養上清液經過離心，濃縮，經G蛋白（GE Healthcare Life Sciences)層析柱純化，得到純化后的鼠抗維生素 D單克隆抗體，-20°C保存備用。
[0047] 實施例5膠體金標記維生素 D結合墊的制備
[0048] 將玻纖膜（Ahlstrom8964)剪成5mm寬的長條，將剪好的玻纖膜置于平坦干凈的玻璃板上，將實施例1、實施例2或實施例3制備的膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物用稀釋液稀釋1. 5倍，然后按每試紙條20 μ L?50 μ L的量均勻地加在玻纖膜上，使玻纖膜均勻浸透，在37°C烘干（60分鐘），防潮避光保存備用，所述稀釋液為含有蔗糖、Tween-20 和PEG20000的四硼酸鈉溶液，稀釋液中四硼酸鈉的濃度為2mM?20mM，每100mL稀釋液中含有 0· 5g ?10g 蔗糖，0· lmL ?lmL Tween-20 和 0· 5g ?5g PEG20000。
[0049] 實施例6層析膜的制備
[0050] 層析膜選醋酸纖維素膜（millipore HF13502)，裁成30mm寬的條形；檢測T線5上包被鼠抗維生素 D單克隆抗體，包被濃度0· 25mg/mL?5mg/mL(優選0· 25mg/mL、0. 5mg/mL、 lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL)，按2 μ L/試紙條抗體量制備，當采用的載體蛋白為牛血清白蛋白時，質控C線6上包被BSA免疫球蛋白（購于上海瑞齊生物技術有限公司），包被濃度為〇· lmg/mL ?1. Omg/mL (優選 0· lmg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、0. 8mg/mL 或 1. Omg/mL)，按2 μ L/試紙條的抗體量制備，當采用的載體蛋白為雞卵清白蛋白時，質控C線 6 上包被兔抗 0VA，包被濃度為 0. lmg/mL ?1. 0mg/mL (優選 0. lmg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、 0. 8mg/mL或1. Omg/mL)，按2 μ L/試紙條的抗體量制備，將裁好的醋酸纖維素膜固定于干凈的有機玻璃板上，應用劃膜儀（上海杰一生物科技公司）制備檢測T線5以及質控C線6, 檢測T線5與質控C線6間距lcm ;將制備好的層析膜在室溫下真空干燥1小時，密封避光防潮保存。
[0051] 實施例7組裝試紙條
[0052] 試紙條支撐板1購于上海杰一生物科技公司，支撐板1長7. 8cm，寬5mm ;將實施例 6制備的層析膜裁成寬5mm，長3cm的層析膜4,使檢測T線位于層析膜4的中央；樣品墊2 尺寸5mmX2. 3cm，吸收墊7尺寸5mmX2. 0cm ;按圖1所示，將樣品墊2、結合墊3、層析膜4 和吸收墊7依次粘貼于支撐板1上，樣品墊2和結合墊3之間、結合墊3和層析膜4之間以及層析膜4和吸收墊7之間均有1_?2_的重疊，得到快速檢測維生素 D的試紙條，2°C? 8°C的環境中避光防潮儲存，有效期12個月。
[0053] 實施例8試紙條的應用
[0054] 標準濃度樣品制備：按照實施例1、實施例2或實施例3中步驟一的方法制備 25-羥基維生素 D與BSA的偶聯物；HPLC檢測偶聯物中25-羥基維生素 D的濃度；通過離心濃縮（Millipore Amicon centrifugal filter)得到標準樣品，并使用BSA濃度為lmg/mL 的PBS溶液稀釋標準樣品，得到維生素 D濃度分別為：0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、 30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、60ng/mL 和 80ng/mL 的標準濃度樣品，其中 0ng/mL 樣品為 BSA 濃度lmg/mL的PBS溶液。
[0055] 標準濃度樣品檢測：取20 μ L的標準濃度樣品加入樣品墊靠近結合墊的區域；將 150 μ L檢測劑逐滴加入樣品墊靠近試紙條末端的部位，10?15分鐘后觀察結果；所述檢測試劑為含有蔗糖、Tween-20和PEG20000的四硼酸鈉溶液，檢測試劑中四硼酸鈉的濃度為 2mM?20mM,每100mL檢測試劑中含有0. 5g?10g鹿糖，0. lmL?lmL Tween-20和0. 5g? 5gPEG20000〇
[0056] 本發明試紙條的檢測原理為：待檢測樣品與檢測試劑混合液由毛細管引力引導沿試紙條向反應膜擴散，混合液經過結合墊時，結合墊所包被的膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物被釋放并隨混合液沿反應膜擴散；待檢測樣品中的維生素 D與結合墊釋放的膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物競爭與檢測T線包被的維生素 D單克隆抗體結合；若待檢樣品中維生素 D的含量高于所設定的檢測閾值，則檢測T線包被的抗體的結合位點由樣品維生素 D完全封閉，阻止膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物與之結合，檢測T線不顯色，而膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物可與質控C線包被的能夠與載體蛋白結合的特異性抗體相結合，質控C線顯色；若待檢測樣品液中維生素 D含量低于所設檢測閾值，則檢測T線包被的抗體的結合位點不能被完全封閉，進而膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物與層析膜上維生素 D抗體結合，檢測T線顯色，同時質控C線抗體也可與膠體金標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物結合，質控C線顯色；若質控區不顯不，則試紙條失效。
[0057] 結果判斷：
[0058] 陰性：檢測T線不顯色，質控C線顯出條帶，判斷為陰性，用表示，代表所檢樣品維生素 D含量超過所設檢測閾值（維生素 D含量充足）；
[0059] 陽性：檢測T線和質控C線均顯示出條帶，判斷為陽性，用" + "表示，代表所檢樣品中維生素 D含量低于所設檢測閾值（維生素 D含量不足）；
[0060] 無效：當質控C線不顯色，則判斷為無效試紙條。
[0061] 標準濃度樣品檢測結果見表1。
[0062] 表1標準濃度維生素 D樣品檢測結果
[0063]

【權利要求】
1. 一種快速檢測維生素 D的試紙條，包括不吸水的支撐板（1)，所述支撐板⑴上依次設置有樣品墊（2)、結合墊（3)、層析膜（4)和吸收墊（7)，其特征在于，所述結合墊（3)上包被有標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物，所述層析膜（4)為硝酸纖維素膜，層析膜 (4) 上設置有質控C線（6)和檢測T線（5)，所述檢測T線（5)位于結合墊（3)和質控C線 (6)之間，檢測T線（5)上包被有維生素 D特異性抗體，質控C線（6)上包被有能夠與載體蛋白結合的特異性抗體。
2. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述標記物為膠體金顆粒。
3. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋白，能夠與載體蛋白結合的特異性抗體為BSA免疫球蛋白。
4. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述載體蛋白為雞卵清白蛋白，能夠與載體蛋白結合的特異性抗體為兔抗雞卵清白蛋白。
5. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述維生素 D 為25-輕基維生素 D3或25-輕基維生素 D2。
6. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述檢測T線 (5) 和質控C線（6)之間的距離為lcm。
7. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述維生素 D 特異性抗體為鼠抗維生素 D單克隆抗體，維生素 D特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為 0· 25mg/mL ?5mg/mL〇
8. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述能夠與載體蛋白結合的特異性抗體的包被量為2 μ L，包被濃度為0. lmg/mL?1. Omg/mL。
9. 根據權利要求1所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，所述標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物的制備方法包括以下步驟：步驟一、將lmg?10mg維生素 D溶解于100 μ L有機溶劑中，然后在攪拌條件下向10mL 濃度為〇. lmg/mL?5mg/mL的載體蛋白溶液中逐滴加入溶解后的維生素 D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為1%?3%，攪拌 5min?20min后移至4°C下攪拌反應16h?18h，反應后的反應液用PBS緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，得到維生素 D與載體蛋白的偶聯物，-20°C保存備用；步驟二、向標記物溶液中加入步驟一中所述維生素 D與載體蛋白的偶聯物至溶液中維生素 D的終濃度為10 μ g/mL?1000 μ g/mL，攪拌5min后加入BSA溶液至BSA的質量體積百分濃度為〇. 1%?1%，在4°C下避光攪拌反應30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的質量體積百分濃度為〇. 1 %?1 %，繼續反應5min后離心，棄去上清，將沉淀復溶后得到標記物標記的維生素 D與載體蛋白的偶聯物。
10. 根據權利要求9所述的一種快速檢測維生素 D的試紙條，其特征在于，步驟一中所述有機溶劑為正己烷、乙腈、二甲基亞砜或1，4-二氧六環。
【文檔編號】G01N33/531GK104062440SQ201410308883
【公開日】2014年9月24日申請日期:2014年6月30日優先權日:2014年6月30日
【發明者】韓雅君申請人:韓雅君

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