猴頭菌絲體標準特征圖譜的構建方法及基于標準特征圖譜的猴頭菌絲體質量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種猴頭菌絲體標準特征圖譜的構建方法及基于標準特征圖譜的猴頭菌絲體質量檢測方法。方法包括：(1)對照品溶液的制備；(2)供試品溶液的制備；(3)色譜條件：色譜分離柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；采用梯度洗脫，流動相為甲醇與質量百分比濃度為1％冰乙酸溶液組成的梯度洗脫液；柱溫為30—40℃；流速為0.8—1.2ml/min；檢測波長為250—260nm；(4)測定：高效液相色譜法的特征圖譜。
【專利說明】猴頭菌絲體標準特征圖譜的構建方法及基于標準特征圖譜 的猴頭菌絲體質量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及猴頭菌絲體標準特征圖譜的構建方法及基于標準特征圖譜的猴頭菌 絲體質量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 藥用真菌是指能治療疾病，具有藥用價值的一類真菌，即在菌絲體、子實體、菌核 或孢子中能產生諸如氨基酸、蛋白質、維生素、多糖及糖蛋白、甙類、生物堿、留醇類、蒽醌 類、黃酮類等多類物質，對人體有保健作用，對疾病有預防抑制或治療作用的真菌。真菌作 為藥用在我國已有2000多年的歷史，早在《神農本草經》中就記載了茯苓、豬苓等真菌藥 物，《本草綱目》中也收載了 20多種生物藥用菌，目前我國傳統作為藥用及試驗證實具有藥 效的真菌已超過400種，主要集中在擔菌亞門和子囊菌亞門。然而日常廣泛應用于臨床的 卻僅有20余種，《中國藥典》2010年版明確收錄了 7種，這說明對生物藥用菌的研究還很不 完善，開發空間較大。現有的研究主要集中于靈芝、蟲草等少數幾個品種，并且主要針對真 菌多糖作為劑型的研究及開發應用。
[0003] 隨著生物科學的發展，真菌、粘菌、地衣等已從植物界中分離出來，單獨成立菌物 界。除目前久負盛名的靈芝、茯苓、蟲草、槐耳種類外，該界入選中藥的品種還較少，但其中 高等真菌數千種，今后無疑將會出現更多此類菌物藥，潛力巨大，將會大大豐富中藥寶庫。 此外，以藥用真菌為主體的菌物藥，除傳統應用子實體外，現代已發展到采用液體（深層） 發酵（應用菌球與發酵液）、固體發酵（應用菌質）等生產工藝。固體發酵產生的普通菌質 其主要藥用部位仍只是它所含的菌絲體及其次生物質，但值得注意的是藥用菌子實體除可 自身入藥外，還可用以進行中藥生物工程研究，以研制新藥。而發酵工程，尤其是我國特有 的固體發酵工程，它存在的時間已有2000多年歷史，通過長時間的固體發酵，產生了生物 代謝產物包括生物酶類物質，其生成的藥用菌質比液體發酵藥效好。但固體發酵存在缺陷， 容易雜菌污染，現固體發酵技術研究是國內研究熱點，主要研究的方向是無菌培養、二次培 養、雜菌抑制、中藥材作為營養基實施雙向固體發酵技術，突破固體發酵技術的瓶頸，實現 生物藥用菌的大規模產業化。
[0004] 猴頭菌是一種猴頭菌科蘑菇（真菌），在中藥用于治療胃腸道疾病已經有2000年 的歷史了，含有的一系列小分子化合物如erinacines，被認為具有神經再生，并且可以透 過血腦屏障修復受損神經組織，猴頭菌還有抗潰瘍，抗炎，和抗微生物，免疫調節，提高肝功 能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心臟輸出、改善備注循環等作用，包含 猴頭菌的醫用制劑在中國已廣泛使用。
[0005] 猴頭菌菌絲體的活性物質中最重要的是多糖及糖蛋白，目前國內外對猴頭多糖的 研究表明，猴頭菌多糖具有多種生物活性和藥理作用，能增強巨噬細胞的吞噬功能，促進溶 血素的形成，抗白細胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突變和抗衰老等。因此，猴頭菌多糖 備受人們關注，成為近年來分子生物學、醫藥、食品科學等領域研究和開發應用的熱點。《湖 南省中藥材標準》2009年版，122-123頁記載了猴頭菌培養物，本發明所述的猴頭菌絲體是 該標準記載的猴頭菌培養物。
[0006] 《湖南省中藥材標準》2009年版現有質量標準中，僅有顯微鑒別、薄層鑒別（5種氨 基酸）、浸出物及含量測定，含量測定只檢測多糖及總氮，不能控制產品質量，不能保證產品 療效。
[0007] 中藥品種包括藥用菌絲體的鑒定和真偽鑒別常規的方法是根據藥材的生藥學特 征和理化特性進行，但對外觀性狀、組織構造以及有機化學成分、理化鑒別相似的品種如 藥用真菌一類藥材的鑒別、用常規方法就難以區別清楚。從現有的猴頭菌內在質量控制現 狀來看，還存在很多問題需逐步解決。其中，最突出的問題之一就是整體化學特征的表征。 因此建立準確有效的猴頭菌絲體特征圖譜，對于長期以來，缺乏系統的整理和歸類，導致 猴頭菌絲體商品混亂，同名異物、同物異名的現象屢有發生，甚至出現有以假充真，以次 充好的情況具有重要意義。
【發明內容】
[0008] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供猴頭菌絲體特征圖譜的構建方法，該方法 構建的猴頭菌絲體特征圖譜可以防偽，因此可應用于鑒別猴頭菌絲體。
[0009] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0010] 所述猴頭菌絲體特征圖譜的構建方法包括如下步驟：
[0011] ⑴參照物溶液的制備：用甲醇將麥角甾醇配制成每ImL含0.02-0. IOmg麥角甾 醇的參照物溶液；
[0012] (2)供試品溶液的制備：用甲醇將猴頭菌絲體供試品配制成每ImL含0. 02-0. IOg 供試品的供試品溶液；
[0013] (3)高效液相色譜分析：分別精密吸取等量的參照物溶液和供試品溶液，注入液 相色譜儀，測定，記錄35- 40min的色譜圖，即得猴頭菌絲體特征圖譜；
[0014] 所述高效液相色譜分析中，色譜分離柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相 A為甲醇，流動相B為質量百分比濃度為1%冰乙酸溶液；采用梯度洗脫方式（見表1):
[0015] 表 1
[0016]
【權利要求】
1. 一種猴頭菌絲體標準特征圖譜的構建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 參照物溶液的制備：用甲醇將麥角甾醇配制成每ImL含0. 02-0. IOmg麥角甾醇的 參照物溶液； (2) 供試品溶液的制備：用甲醇將猴頭菌絲體供試品配制成每ImL含0. 02 - 0. IOg供 試品的供試品溶液； (3) 高效液相色譜分析：分別精密吸取等量的參照物溶液和供試品溶液，注入液相色 譜儀，測定，記錄35- 40min的色譜圖，得猴頭菌絲體特征圖譜； 其中，步驟（3)所述的高效液相色譜分析中，色譜分離柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合 硅膠；流動相A為甲醇，流動相B為質量百分比濃度為1 %冰乙酸溶液；采用梯度洗脫方式： 時間（min) 流動相A (% ) 流動相B (% ) 0 ?20 90 - 100 10 - 0 20 ?35 100 0 柱溫為30-40°C ;流速為0. 8-I. 2ml/min ;檢測波長為250-260nm，理論板數按麥角 甾醇峰計算> 5000 ; 對多批次猴頭菌絲體建立特征圖譜，通過分析比較，確定出4個共有特征峰，以與麥 角甾醇參照物對應的峰為參照峰，4個特征峰的相對保留時間分別為：0. 48、0. 81、1. 00和 1. 14,偏差為±10%以內，其中相對保留時間為1.00的峰是與麥角甾醇參照物對應的峰； 特征峰相對峰寬為30,閾值為50,最小相對峰面積為1000,最小相對峰高為100 ;這些共有 特征峰構成了猴頭菌絲體的特征，作為猴頭菌絲體的標準特征圖譜。
2. -種猴頭菌絲體的質量檢測方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 參照物溶液的制備：用甲醇將麥角甾醇配制成每ImL含0. 02-0. IOmg麥角甾醇的 參照物溶液； (2) 供試品溶液的制備：用甲醇將猴頭菌絲體供試品配制成每ImL含0. 02 - 0. IOg供 試品的供試品溶液； (3) 高效液相色譜分析：分別精密吸取等量的參照物溶液和供試品溶液，注入液相色 譜儀，測定，記錄35- 40min的色譜圖，即得猴頭菌絲體特征圖譜； 所述高效液相色譜分析中，色譜分離柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相A為 甲醇，流動相B為質量百分比濃度為1 %冰乙酸溶液；采用梯度洗脫方式： 時間（min 流動相A (% 流動相B (% ) 0 ?2 90 - 10 10 - 0 20 ?3 10 0 柱溫為30-40°C ;流速為0. 8-I. 2ml/min ;檢測波長為250-260nm，理論板數按麥角 甾醇峰計算> 5000 ; (4) 將猴頭菌絲體特征圖譜與猴頭菌絲體標準特征圖譜相比對，鑒別猴頭菌絲體有效 成分以及判別猴頭菌絲體的真偽。
【文檔編號】G01N30/02GK104316603SQ201410275434
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】何述金, 周代俊, 常耀臺 申請人:湖南新匯制藥股份有限公司