酶標儀定量檢測多樣本中β-葡萄糖醛酸苷酶的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種酶標儀定量檢測多樣本中β-葡萄糖醛酸苷酶的方法和試劑盒。試劑盒中包括β-葡萄糖醛酸酶標準品及工作液、酚酞葡萄糖醛酸反應液、終止反應試劑、pH計等。本發明具有如下優點：可同時檢測多樣本中的β-葡萄糖醛酸酶濃度，檢測耗時較短；靈敏度高，檢測限低至39.0625U/mL；方法線性范圍廣，檢測濃度范圍為39.0625U/mL～12500U/mL，跨越3個數量級；準確度高；試劑和樣本使用量較少；本試劑盒操作方便：不用分多次加樣，一次加樣即可；并且不需要清洗步驟既，減少操作步驟，又不會造成交叉污染而導致結果不可信；而且可以保存好檢測樣本，以備重復檢測所用。
【專利說明】酶標儀定量檢測多樣本中β-葡萄糖醛酸苷酶的方法和試劑盒
【技術領域】:
[0001]本發明屬于生化分析領域，具體涉及用酶標儀定量同時檢測多個樣本中β -葡萄糖醛酸苷酶的方法和檢測試劑盒。
【背景技術】:
[0002]葡萄糖苷醛酸酶是一種溶酶體酶，它促進體內許多葡萄糖苷脂類β-D-糖苷鍵水解。
[0003]現在技術方法中，檢測糞便中葡萄糖醛酸酶的方法局限于紫外分光光度計和全自動生化儀。
[0004]這兩種方法共同存在以下缺點:
[0005]1、試劑使用量較大
[0006]2、需要較多量的樣本
[0007]另外，紫外分光光度計和全自動生化儀檢測時，需要較多量的樣本，如果樣本量不夠，不能進行檢測。
[0008]3、耗時較長
[0009]當需要同時檢測多份樣本時，用紫外分光光度計和全自動生化儀需要一份份樣本分別檢測，耗時較長，造成實際操作中的工作效率降低。
[0010]紫外分光光度計法的檢測過程是將每一個樣本反應后形成的絡合物，經過透光度和吸光度的換算得出的數值，每一次讀數均需有空白對照和測定樣本讀數，將兩者做差，求得相應的吸光度值，再將吸光度值和標準品的濃度一一對應后，繪制標準曲線。此過程需要時間較長，每一個樣本檢測平均需要2分鐘。
[0011]全自動生化儀檢測除與紫外分光光度計的耗時長導致的結果不準確外，還有可能導致樣本或標準品的交叉污染的可能。
[0012]4、需要清洗步驟
[0013]紫外分光光度計檢測需要清洗比色皿，全自動生化儀需要清洗劑清洗加樣針。
[0014]5、結果不準確
[0015]紫外分光光度計法檢測誤差較大。由于繪制標準曲線(一般為五點)的吸光度不是同時讀取的，檢測酶活的時間不同步，時間延長會使得檢測到的酶活有所降低，故此得出的標準曲線會有差異，而且是不可避免的系統誤差。此外每次樣本的取樣檢測都是人工操作，也會有操作的誤差。
[0016]全自動生化儀對樣本的檢測比紫外分光光度計在檢測時會好一些，主要表現在加樣的準確性，但是，每一樣本的檢測時長并沒有縮短，并且全自動生化儀操作還有一個不可缺少的步驟就是清洗加樣針，這樣，一旦清洗不夠徹底，就會造成交叉污染，從而導致結果不可信。
[0017]6、不利于原始樣本的保存[0018]紫外分光光度計檢測所需樣本量較大(即便是用最小量的比色皿，由于方法的限制，樣本用量也要ImL)，檢測過后，因多個樣本使用的是同一組(2個?3個)比色皿，所以，回收檢測后的樣本與原始樣本相比，從理論上講和實際操作均有污染的可能，不利于樣本保存。
[0019]全自動生化儀檢測樣本所需的樣本量雖較紫外分光光度計少些(200yL?500 μ L)，但每次檢測后的樣本都因檢測方法的原因也無法保存。
[0020]因此，目前急需要建立一種新的檢測糞便中葡萄糖醛酸苷酶的方法和檢測試劑盒。
【發明內容】
:
[0021]本發明的目的是提供一種β -葡萄糖醛酸酶濃度定量檢測方法和檢測試劑盒，可同時檢測多份樣本，使用試劑量較少，且用較少量標本也能進行檢測。
[0022]本發明提供了一種多樣本同時定量檢測β_葡萄糖醛酸苷酶的方法，其特征為用酶標儀進行檢測，且操作方法是:
[0023]I)繪制“吸光度值一 葡萄糖醛酸苷酶濃度”標準曲線；
[0024]2)將待測標本與酚酞葡萄糖醛酸反應液混合進行反應，測定生成的反應產物醌類化
[0025]合物的吸光度值；
[0026]3)根據所繪制標準曲線計算待測樣品的β -葡萄糖醛酸酶濃度；
[0027]所述吸光度值是用酶標儀讀取的吸光度值，設置酶標儀波長為540_550nm。
[0028]所述“酚酞葡萄糖醛酸反應液”，是將酚酞葡萄糖醛酸與去離子水和磷酸鹽緩沖液混合，攪拌溶解得到。每10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸需加入2_4mL去離子水和l_3mL的磷酸鹽緩沖液。
[0029]所述標準曲線的繪制方法是將不同濃度的β -葡萄糖醛酸苷酶標準品溶液分別與酚酞葡萄糖醛酸混合后，分別用酶標儀測定吸光度值；然后以每種葡萄糖醛酸苷酶標準品濃度為橫坐標，以相應的吸光度值為縱坐標，繪制“吸光度值一 β -葡萄糖醛酸苷酶濃度”標準曲線。所述β-葡萄糖醛酸苷酶標準品溶液是將葡萄糖醛酸苷酶標準品溶于工作液中，所述工作液是含0.3%?I %小牛血清的磷酸鹽緩沖液，其pH為6.8-7.0。
[0030]工作液中優選含有0.5%小牛血清。
[0031 ] 上述步驟2)中，為控制反應進程，可加入終止反應試劑，為酸或堿，可選用無機酸或堿或有機酸或堿。如堿性甘氨酸、硫酸、30%?40%濃度氫氧化鈉等，優選用甘氨酸與堿的水溶液；
[0032]對每種樣品分別進行上述步驟2)的操作，并將多個待測標本轉移至同一個96孔酶標板上，可以對多種樣本同時進行測定。
[0033]當需要檢測糞便樣本中的β_葡萄糖醛酸苷酶時，待測便標本需進行前處理，按如下方式進行:將樣本從樣本保存液中取出，用離心機離心，然后計算樣本的濕重濃度；再渦旋混勻后，置于上述工作液中，再離心，取上清。
[0034]如果是溶液樣本，如血液等體液的檢測可以直接進行。
[0035]以下是本發明一種較為優選的操作過程的具體操作步驟:[0036]I)制備符合試驗標準要求的便標本
[0037]先將樣本從樣本保存液中取出3mL，于常溫離心機內離心，3000轉/分，離心20分鐘，計算濃度；將計算好濃度的樣本，渦旋混勻后，取出10yL至上述工作液中，混勻后，于高速離心機內離心，9000g/分，離心8-10分；取上清至新的標記好的1.5mL離心管內
[0038]2)制備酚酞葡萄糖醛酸反應液，標記為試劑A
[0039]稱量10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸放入10mL燒杯中，加入3.6mL去離子水和2.0mL的磷酸鹽緩沖液。攪拌直到完全溶解。此試劑現用現配。
[0040]3)制備終止反應試劑，標記為試劑B
[0041]稱量0.75g甘氨酸至含有25mL去離子水的10mL燒杯中，攪拌直到完全溶解。使用pH計、IN氫氧化鈉調節pH值至10左右。轉移至25mL容量瓶內，標記好并于2_8°C穩定一周。
[0042]4)制備不同濃度的標準品檢測液
[0043]用工作液對標準品進行梯度稀釋，得到10個濃度的稀釋液；
[0044]如濃度為12500U/mL、10000U/mL、5000U/mL、2500U/mL、1250U/mL、625U/mL ;312.5U/mL、156.25U/mL、78.125U/mL、39.0625U/mL
[0045]取每一種濃度的標準品稀釋液10 μ L分別與90 μ L步驟2)得到的試劑A混勻；
[0046]5)制備待測物檢測稀釋液
[0047]取稀釋好的樣品10 μ L與90 μ L步驟2)得到的試劑A混勻；
[0048]6)終止反應
[0049]于反應孔內加入等體積的試劑B混勻，待測；
[0050]7)測定不同濃度標準品的吸光度值，繪制濃度一吸光度標準曲線
[0051]A將上述不同濃度的標準品檢測稀釋液轉移至同一個96孔酶標板上，利用酶標儀分別讀取每種濃度標準品的吸光度值；設置酶標儀激發波長540-550nm。
[0052]B以標準品每種β -葡萄糖醛酸苷酶濃度為橫坐標，以相應的吸光度值為縱坐標繪制“吸光度值一 β -葡萄糖醛酸苷酶濃度”標準曲線；
[0053]8)測定待測物吸光度值
[0054]方法同步驟7) A ;
[0055]9)計算待測樣品濃度
[0056]將待測樣品吸光度值代入步驟7)Β得到的標準曲線，得出待測樣品的濃度。
[0057]本發明用終點法經酶標儀檢測的方法驗證了本方法的準確度(見實施例3)。
[0058]用本發明的酶標儀法與紫外分光光度計的方法相比，酶標儀檢測結果更準確，且重復性好(見實施例3中“三、試驗結果”)。
[0059]本方法的創新點是:
[0060]1、首次采用標準β -葡萄糖醛酸酶濃度作為酶標法中的β -葡萄糖醛酸酶標準對便樣品進行定量；
[0061]2、靈敏度高:可檢測低至39.0625U/mL的β -葡萄糖醛酸酶濃度；
[0062]3、方法線性范圍廣:可檢測39.0625U/mL?12500U/mL的β -葡萄糖醛酸酶濃度，跨越3個數量級；
[0063]4、準確度高:首次采用高準確度的酶標法對標準質粒進行定量，得到的量值不確定度低，準確度高。
[0064]5、試劑使用量較少，不需要較多量的樣本
[0065]6、耗時較短:酶標儀不用分多次加樣，一次即可。并且可同時檢測多樣本
[0066]7、不需要清洗步驟:不用清洗板孔，既減少操作步驟，又不會造成交叉污染而導致結果不可信。
[0067]8、可以保存好檢測樣本，以備重復檢測所用
[0068]酶標儀檢測后的樣本可以用保鮮膜封好，保存兩周，以供樣本的復查。而紫外法和全自動生化儀則做不到。
[0069]本發明還提供了一種標儀法定量檢測β -葡萄糖醛酸酶酶試劑盒，試劑盒中包括β-葡萄糖醛酸酶標準品、酚酞葡萄糖醛酸反應液、終止反應試劑、pH計，且所述終止反應試劑是無機或有機酸或堿，其特征是:
[0070]3)試劑盒中包括酶標板；
[0071]4)配制標準品檢測液的工作液中含有0.5%小牛血清。
[0072]所述終止反應試劑優選是甘氨酸與堿的水溶液，優選配方是0.75g甘氨酸、25mL去離子水、IN氫氧化鈉；
[0073]所述配制β -葡萄糖醛酸酶標準品的工作液優選是:ρΗ = 6.8的PBS，包含磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉及含有0.3%?I %小牛血清。
[0074]所述酚酞葡萄糖醛酸反應液優選是:每10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸需加入2_4mL去離子水和l_3mL的磷酸鹽緩沖液。
[0075]所述酶標板優選96孔酶標板。
[0076]試劑盒中還具有制備便標本用的pH7.0的磷酸鹽緩沖液。
[0077]本試劑盒的優點是:
[0078]1、彌補了現有酶類檢測試劑盒中不能對糞便中β -葡萄糖醛酸酶進行定量檢測的缺點；
[0079]2、靈敏度高:可檢測β -葡萄糖醛酸酶的酶活低至312.5U/mL ；
[0080]3、檢測范圍廣:可檢測312.5U/mL?10000U/mL的酶活，跨越3個數量級；
[0081]4、操作簡便、需要的檢測儀器設備常規；
[0082]5、標準品準確度高。
[0083]而酶標儀檢測不需要清洗檢測所需的96孔板。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0084]圖1為酶標儀法檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶濃度(312.5U/mL?10000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關系
[0085]圖2為酶標儀法檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶濃度(39.0625U/mL?125000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關系；及酶標儀法對葡萄糖醛酸酶定量的線性范圍；
[0086]圖3和圖4是本方法與現有技術方法(即酶標儀法與紫外分光光度計法)測定結果比較。其中:
[0087]圖3是酶標儀檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶(156.25U/mL?10000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關系；
[0088]圖4是紫外分光光度計法檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶(156.25U/mL?10000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關系。
【具體實施方式】
[0089]實施例1 β -葡萄糖醛酸酶濃度與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關系
[0090]一、實驗目的:
[0091]探索糞便中葡萄糖醛酸酶濃度及其與酚酞葡萄糖醛酸化合物是否存在線性關系。
[0092]二、材料與方法:
[0093]1.β -葡萄糖醛酸酶檢測原理:通過提取糞便標本中β -葡萄糖醛酸酶，并將之與酚酞葡萄糖醛酸發生醛酸反應，用堿性溶液終止反應，得到顯色絡合物。
[0094]2.甘氨酸:購自sigma公司。用DDW按照0.75g:25mL進行配制,分裝保存,備用。
[0095]3.將β -葡萄糖醛酸酶配置成10000U/mL的保存濃度，然后用pH6.8PBS稀釋至5000U/mL、2500U/mL、1250U/mL、625U/mL、312.5/mL、156.25U/mL、78.125U/mL、39.0625U/mL。
[0096]4.取稀釋好的β -葡萄糖醛酸酶溶液0.0lmL與0.09mL的酚酞葡萄糖醛酸液混合，轉移至96孔酶標板。
[0097]5.將酶標板置于酶標儀上，選擇激發波長546nm，吸收波長620nm進行吸光度值的米集。
[0098]6.標準曲線的繪制:以β -葡萄糖醛酸酶濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標進行曲線繪制，所得到的標準曲線見圖1。
[0099]三、實驗結果:
[0100]由圖1可知，β -葡萄糖醛酸酶與酚酞葡萄糖醛酸液結合后，β -葡萄糖醛酸酶與吸光度成正比，線性相關系數為0.999。
[0101]四、實驗結論
[0102]β -葡萄糖醛酸酶濃度與吸光度具有線性關系，證明酚酞葡萄糖醛酸酶標儀法可以對β_葡萄糖醛酸酶進行定量。
[0103]實施例2酶標儀法對β -葡萄糖醛酸酶定量的線性范圍及定量限和檢測靈敏度的確定
[0104]一、材料與方法
[0105]1.將β -葡萄糖醛酸酶標準品配置成10000U/mL的保存濃度，然后用75mM PBS稀釋至 5000U/mL、2500U/mL、1250U/mL、625U/mL、312.5U/mL、156.25U/mL、78.125U/mL、39.0625U/mL等濃度進行保存。
[0106]2.取稀釋好的β -葡萄糖醛酸酶標準溶液0.0lmL與0.09mL的稀釋好的酚酞葡萄糖醛酸液混合，轉移至96孔酶標板。其它操作同實施實例I中的5和6。
[0107]二、實驗結果:
[0108]1.酶標儀法測定葡萄糖醛酸酶的線性范圍
[0109]為了測定酶標儀法測定葡萄糖醛酸酶定量的線性范圍，將葡萄糖醛酸酶進行了 9個不同濃度梯度的稀釋，所有β -葡萄糖醛酸酶濃度與吸光度的關系見圖2，由圖2可知，在實驗的范圍內吸光度輕度與β -葡萄糖醛酸酶濃度不完全成正比，當濃度超過10000U/mL或低于312.5U/mL時，吸光度與β -葡萄糖醛酸酶濃度已經不再是直線關系了。因此將濃度超過10000U/mL和濃度低于312.5U/mL的點去掉后所得到的即為吸光度對β -葡萄糖醛酸酶的定量線性范圍，即312.5U/mL~10000U/mL，見圖3。
[0110]2.酶標儀法測定β-葡萄糖醛酸酶的定量限
[0111]根據上述的線性范圍，最低定量濃度312.5U/mL，加樣量為0.lmL，因此可計算出酶標儀法測定β -葡萄糖醛酸酶的定量限為31.25U。
[0112]3.酶標儀法測定葡萄糖醛酸酶的檢測靈敏度
[0113]由于可檢測的最低信號值對應的濃度為39.0625U/mL，加樣量為0.1mL,因此可計算出酶標儀法法測定β -葡萄糖醛酸酶的檢測限為3.90U。
[0114]實施例3酶標儀法與紫外法測定β -葡萄糖醛酸酶比較
[0115]一、實驗目的
[0116]1.同時用本發明酶標儀法和紫外分光光度計對待測β_葡萄糖醛酸酶樣品進行測定比較，以證明本專利方法的可行性和準確性。
[0117]二、材料與方法 [0118]2.待測β -葡萄糖醛酸酶購于sigma公司。
[0119]3.采用標準曲線法對待側樣本中的葡萄糖醛酸酶進行定量
[0120](I)標準品處理:采用倍比稀釋法，將β_葡萄糖醛酸酶標準品稀釋8個濃度，與酚酞葡萄糖醛酸進行反應，加入堿性甘氨酸終止反應，讀取吸光度值。
[0121](2) β -葡萄糖醛酸酶標準溶液的配制
[0122]將β_葡萄糖醛酸酶標準物質按照使用說明置于電子天平精確稱量一定質量的β -葡萄糖醛酸酶，溶于一定體積的超純水(電阻為18.2 Ω )，配制成濃度為10000U/mL的β-葡萄糖醛酸酶標準儲備溶液(濃度計算時應考慮到標準物質的純度)。根據一般糞便β-葡萄糖醛酸酶樣品完全水解的大致濃度(由紫外分光光度法及酶標儀檢測得到)，取一定體積的β -葡萄糖醛酸酶標準物質儲備液，稀釋至所需濃度，同時配制工作標準溶液。
[0123](3)酶結合溶液的配制
[0124]將經過離心及工作液處理的β -葡萄糖醛酸酶的糞便樣品，稱取10 μ L樣品，向樣品中添加與標準溶液中加入的7-9倍量的酚酞葡萄糖醛酸液(Α液)，并加入等倍量的甘氨酸堿性緩沖液(試劑B)，形成顯紫色絡合物，即是終止反應。
[0125](4)酶標儀法測定糞便樣品的β -葡萄糖醛酸酶濃度
[0126]a.β -葡萄糖醛酸酶標準品的體積濃度計算
[0127]將經前處理的待測質粒樣品分為3組，每組3個平行待測樣，進行酶標儀測定，求得平均值，繪制標準曲線，見圖1
[0128]b.對待測糞便樣本中β_葡萄糖醛酸酶含量采用以下公式進行計算
[0129]
【權利要求】
1.一種酶標儀法定量檢測β-葡萄糖醛酸酶酶的試劑盒，試劑盒中包括β-葡萄糖醛酸酶標準品、工作液、酹酞葡萄糖醒酸反應液、pH計、終止反應試劑,且所述終止反應試劑是酸或堿；所述工作液用于配制β-葡萄糖醛酸酶標準品溶液和處理待檢標本； 其特征是: 1)試劑盒中具有酶標板； 2)所述工作液中含有小牛血清。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，所述工作液是含0.3%?1%小牛血清的磷酸鹽緩沖液，其 pH 為 6.8-7.0。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，所述小牛血清的含量是0.5%。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，所述終止反應試劑是甘氨酸與堿的水溶液；所述酶標板是96孔酶標板。
5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，配制所述終止反應試劑的配方是0.75g甘氨酸、25mL去離子水、IN氫氧化鈉。
6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，所述酚酞葡萄糖醛酸反應液成份是:每10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸加入2_4mL去離子水和l_3mL的磷酸鹽緩沖液。
7.一種多樣本同時定量檢測β_葡萄糖醛酸苷酶的方法，其特征為:用酶標儀進行檢測，且操作方法是: 1)繪制“吸光度值一葡萄糖醛酸苷酶濃度”標準曲線； 2)將待測標本與酚酞葡萄糖醛酸反應液混合進行反應，用酶標儀測定生成的反應產物醌類化合物的吸光度值； 3)根據所繪制標準曲線計算待測樣品的β_葡萄糖醛酸酶濃度； 所述吸光度值是用酶標儀讀取的吸光度值，設置酶標儀波長為540-550nm。
8.根據權利要求7所述的方法，所述酚酞葡萄糖醛酸反應液是酚酞葡萄糖醛酸、去離子水和磷酸鹽緩沖液混合得到的液體； 所述標準曲線的繪制方法是將不同濃度的β-葡萄糖醛酸苷酶標準品溶液分別與酚酞葡萄糖醛酸混合后，分別用酶標儀測定吸光度值；然后以每種葡萄糖醛酸苷酶標準品濃度為橫坐標，以相應的吸光度值為縱坐標，繪制“吸光度值一 β -葡萄糖醛酸苷酶濃度”標準曲線； 所述葡萄糖醛酸苷酶標準品溶液是將葡萄糖醛酸苷酶標準品溶于工作液中，所述工作液是含0.3%?I %小牛血清的磷酸鹽緩沖液，其pH為6.8-7.0。
9.根據權利要求7或8所述的方法，所述步驟2)中，加入控制反應進程的終止反應試齊U，所述終止反應試劑是無機或有機酸或堿。
10.根據權利要求7所述的方法，當需要檢測糞便樣本中的β-葡萄糖醛酸苷酶時，待測便標本需進行前處理，按如下方式進行:將樣本從樣本保存液中取出，用離心機離心，計算樣本的濕重濃度后，再渦旋混勻；然后置于所述工作液中，再離心，取上清。
【文檔編號】G01N33/573GK104034891SQ201410262183
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】侯艷艷 申請人:北京洛奇臨床檢驗所有限公司