用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療效果監測的試劑盒及其用途
【專利摘要】本發明公開了一種用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療效果監測的試劑盒。本發明提供的試劑盒包括特異性抗體：IP-10抗體和/或CD14抗體；抗原刺激物；以及陽性對照刺激劑。本發明所述試劑盒可用于診斷活動性結核病人或結核潛伏感染者而不受接種BCG(卡介苗)的影響。本試劑盒用于活動性結核病人診斷的敏感性和特異性均高于T-SPOT.TB商用試劑盒，均達到100％。抗結核治療1個月后，80％以上的臨床結核病人的檢出率轉為陰性，表明本試劑盒可用于檢測臨床抗結核治療效果。
【專利說明】用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療效果監測的試劑盒及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學檢驗領域，具體涉及一種用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療效果監測的試劑盒。
【背景技術】
[0002]結核病主要由結核分枝桿菌感染引起，2013年世界衛生組織(WHO)報道指出全球約有1200萬結核病患者，其中2012年結核新發病例為860萬，死亡病例為130萬。結核病給人類健康造成嚴重威脅。我國是結核病五大高負擔國之一，結核病嚴重阻礙我國經濟和社會發展。
[0003]結核病防控的難點之一是缺乏快速準確的診斷方法。傳統的結核病診斷方法有結核菌素皮試試驗(TST)、結核菌痰涂片抗酸染色、結核菌痰培養以及放射性X光片等。近年來新發展的診斷方法有分子生物學方法(PCR法)和免疫學方法等。傳統的診斷方法都存在敏感性或特異性低的缺陷，而PCR方法假陽性較高。新型免疫學方法中的Y-干擾素(IFN-Y)釋放實驗(interferon-gamma release assay, IGRA)是現階段檢測結核分枝桿菌感染準確性較高的方法， 現有的商用試劑盒有T-SP0T.TB和QuantiFERON-TB GoldIn-Tube(QFT-1T)，這兩個試劑盒的敏感性和特異性分別為80%到90%之間，尚有待改進。
[0004]人體感染結核分枝桿菌后，體內會產生免疫記憶。當用相同的抗原再次刺激人體免疫細胞時，活化的免疫細胞會分泌大量細胞因子或趨化因子，并具有抗原特異性，即疾病特異性，因而這些免疫細胞分泌的細胞因子或趨化因子具有良好的結核病診斷潛力。
[0005]在臨床抗結核治療過程中，結核病人體內的結核分枝桿菌荷載量隨著有效治療的進行而降低，從而導致體內結核抗原特異性免疫細胞數量下降。因而抗原特異性誘導的細胞因子或趨化因子含量也隨之下降，因此可見，這些細胞因子或趨化因子能較好地反映臨床治療的有效性，即臨床預后價值。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種新的用于檢測結核分枝桿菌感染和臨床抗結核治療效果監測的試劑盒及其用途。
[0007]在本發明的一方面，提供一種用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療效果監測的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0008]a)以下特異性抗體:IP-10抗體和/或⑶14抗體；
[0009]b)抗原刺激物；
[0010]c)陽性對照刺激劑。
[0011]所述抗原刺激物為蛋白質或多肽。所述抗原刺激物優選為結核分枝桿菌ESAT-6抗原和/或結核分枝桿菌CFP-10抗原中的一條或多條多肽或其類似物。所述的多肽由20個氨基酸組成，所述其類似物為與其同源性在75%以上的多肽或多肽修飾物。所述結核分枝桿菌ESAT-6抗原具體可為SEQ ID NO: 1-SEQ ID N0:9所示序列的多肽中的至少一種；所述結核分枝桿菌CFP-1O抗原具體可為序列表的SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 18所示序列的多肽中的至少一種。所述抗原刺激物為SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 18所示序列中的一條或多條多肽。
[0012]序列1MTEQQWNFAG IEAAASAIQG,如 SEQ ID NO:1 所示；
[0013]序列2IEAAASAIQG NVTSIHSLLD,如 SEQ ID NO: 2 所示；
[0014]序列3NVTSIHSLLD EGKQSLTKLA,如 SEQ ID NO: 3 所示；
[0015]序列4EGKQSLTKLA AAffGGSGSEA,如 SEQ ID NO: 4 所示；
[0016]序列5AAWGGSGSEA YQGVQQKffDA,如 SEQ ID NO: 5 所示；
[0017]序列6YQGVQQKWDA TATELNNALQ,如 SEQ ID NO: 6 所示；
[0018]序列7TATELNNALQ NLARTISEAG,如 SEQ ID NO: 7 所示；
[0019]序列8NLARTISEAG QAMASTEGNV,如 SEQ ID NO: 8 所示；
[0020]序列9Q AMASTEGNV TGMFA,如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0021]序列10MAEMKTDAAT LAQEAGNFER,如 SEQ ID NO: 10 所示；
[0022]序列11LAQEAGNFER IS⑶LKTQID，如 SEQ ID NO: 11 所示；
[0023]序列12IS⑶LKTQID QVESTAGSLQ,如 SEQ ID NO: 12 所示；
[0024]序列13QVESTAGSLQ GQffRGAAGTA,如 SEQ ID NO: 13 所示；
[0025]序列14GQWRGAAGTA AQAAVVRFQE,如 SEQ ID NO: 14 所示；
[0026]序列15AQAAVVRFQE AANKQKQELD,如 SEQ ID NO: 15 所示；
[0027]序列16AANKQKQELD EISTNIRQAG,如 SEQ ID NO: 16 所示；
[0028]序列17EISTNIRQAG VQYSRADEEQ,如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0029]序列18VQYSRADEEQ QQALSSQMGF,如 SEQ ID NO: 18 所示。
[0030]本發明所述特異性抗體包括捕獲抗體和檢測抗體組成；所述捕獲抗體包括抗IP-?ο包被抗體；所述檢測抗體包括生物素標記的抗IP-10抗體、熒光素標記的抗IP-?ο抗體和/或抗⑶14抗體。
[0031]此外，本發明試劑盒還可以包括鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶(HRP)。
[0032]所述陽性對照刺激劑指能非特異性刺激細胞產生IP-10的物質。優選為植物血凝素或乙酸肉豆蘧佛波醇。
[0033]本發明所述試劑盒診斷原理如下:受檢樣本可來自于全血、血液分離獲得物、胸水、肺泡灌洗液、淋巴結和腦脊液，如PBMC (外周血單個核細胞)分為三份，其中一份為無刺激物的陰性對照，另一份用抗原刺激以產生應答樣品，第三份用PHA(植物血球凝集素，或簡稱植物血凝素)或或乙酸肉豆蘧佛波醇(PMA)等刺激以作為陽性對照。用抗原刺激應答樣品所得的ip-?ο的值減去陰性對照以確定樣本的抗原特異性免疫應答水平，并與受試者工作特征曲線(ROC)分析獲得的參考值進行對比。如果大于或等于參考值，則表明該受試樣本為陽性。同時，陽性對照值要求大于或等于參考值的2倍。
[0034]本發明所述檢測方法包括但不限于:胞內細胞因子染色法(ICS)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、酶聯免疫斑點法(ELISP0T)、Luminex、PCR/RT — PCR法、免疫熒光法、放射性免疫檢定、免疫學干燥棒、免疫色譜法、免疫雜交、免疫印記、細胞增殖和酶擴增免疫測定技術等。[0035]在本發明的另一方面，提供該試劑盒的用途，包括該試劑盒在制備輔助診斷活動性結核或結核潛伏感染的試劑盒中的應用；該試劑盒在制備評價臨床抗結核治療效果的試劑盒中的應用。
[0036]由于本發明所用抗原為結核分枝桿菌特有抗原，因而可區分結核分枝桿菌感染和BCG疫苗接種者。
[0037]本發明所述結核分枝桿菌感染人群包括有臨床癥狀的活動性結核病人和無癥狀的潛伏感染者。此處臨床癥狀包括但不限于咳嗽，發熱，胸片異常，胸痛，咳血等。
[0038]本發明所述釋放IP-10的細胞主要為但不限于⑶14+單核細胞。
[0039]本發明所述體外診斷活動性結核病人的方法，主要通過使用結核分枝桿菌特異性抗原或多肽體外刺激受檢樣本從而活化單個核細胞，并檢測IP-10釋放細胞的數量或培養上清中IP-?ο的表達量，確定結核分枝桿菌的感染情況。
[0040]本發明公開了一種體外評價臨床抗結核特異性治療效果的方法，主要通過使用結核分枝桿菌特異性抗原或多肽體外刺激治療不同時間結核病人單個核細胞，并檢測釋放IP-10細胞數量或培養上清中IP-?ο的分泌量，確定結核病人的臨床療效情況。
[0041]本發明所述從活動性結核病人、正常人群以及非結核對照人群等研究對象獲得的生物學樣本包含但不限 于:血液、肺泡灌洗液、胸水、淋巴液及其它含有單個核細胞的生物學樣本。此檢測方法中釋放IP-10的細胞包括但不限于⑶14+單核細胞、⑶14 一單核細胞和T細胞等。
[0042]本發明實施方案之一中，采用胞內細胞因子染色法(ICS)發現，結核分枝桿菌特異性抗原誘導的IP-10主要由CD14+單核細胞分泌，且ROC曲線分析表明其用于區分活動性結核病人和正常人群的敏感性和特異性都為100%。
[0043]本發明實施方案之二中，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)方法，檢測活動性結核病人PBMC體外經結核分枝桿菌特異性抗原刺激后IP-10的分泌，同樣，用ROC曲線分析表明其用于區分活動性結核病人和正常人群的敏感性和特異性都為100%。通過監測治療過程中活動性結核病人樣本經核分枝桿菌特異性抗原刺激后ip-?ο的分泌量，可反映治療的療效情況，即預后情況。
[0044]經實驗驗證，本發明所述試劑盒可用于診斷活動性結核病人或結核潛伏感染者而不受接種BCG(卡介苗)的影響。本試劑盒用于活動性結核病人診斷的敏感性和特異性均高于T-SP0T.TB商用試劑盒，均達到100%。抗結核治療I個月后，80%以上的臨床結核病人的檢出率轉為陰性，表明本試劑盒可用于檢測及有效評價臨床抗結核治療效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045]圖1為本發明實施例1中結核病人PBMC中結核分枝桿菌特異性抗原誘導的IP-10主要由CD14+單核細胞分泌的示意圖。圖1a為ICS檢測法代表圖，其中Blank代表未刺激樣本，Stimulant代表抗原刺激樣本，HC代表正常人樣本，TB代表結核病人樣本，細胞分析群為FSC/SSC中的單核細胞群。圖1b為ICS檢測法統計圖，其中，縱坐標代表1P-1O+細胞占單核細胞的比例，HC代表正常人樣本，TB代表結核病人樣本，Non-TB代表非結核疾病對照人群，統計分析采用Unpaired T test方法，*#:Ρ〈0.001。圖1c為ROC曲線分析ICS法檢測抗原特異性ip-?ο用于診斷結核病人的敏感性和特異性的示意圖。[0046]圖2為本發明實施例2中結核分枝桿菌特異性抗原誘導PBMC表達的IP — 10具有結核病特異性的示意圖。圖2a為ELISA檢測法統計圖，其中HC代表正常人樣本，TB代表結核病人樣本，Non-TB代表非結核疾病對照人群,統計分析采用Unpaired T test方法，***:P〈0.001。圖2b為ROC曲線分析ELISA法檢測抗原特異性IP — 10用于診斷結核病人的敏感性和特異性的示意圖。
[0047]圖3為本發明實施例1和2中結核分枝桿菌特異性抗原誘導PBMC表達的IP —10具有臨床預后價值的示意圖。圖3a為ICS法檢測抗原特異性IP — 10用于評價臨床抗結核治療療效代表圖，圖3a為二個不同治療階段樣本經抗原刺激(Stimulant)或無刺激陰性對照(Blank)，細胞分析群為FSC/SSC中的單核細胞群。圖3b為ICS法檢測抗原特異性IP - 10用于評價臨床抗結核治療療效統計圖，其中縱坐標代表1P-1O+細胞占單核細胞的比例。圖3c為ELISA法檢測抗原特異性IP — 10用于評價臨床抗結核治療療效示意圖，其中O — I代表治療I個月以內的結核病人樣本，1- 9代表治療I至9個月的結核病人樣本，統計分析采用 Unpaired T test 方法(***:Ρ〈0.001, **:Ρ〈0.01)。
【具體實施方式】
[0048]以下通過 具體的實施例進行示例，其中所用試劑均可通過市場渠道購買，如有未盡之處，可以參考相應的分子克隆和細胞生物學等實驗手冊。本發明所述實施方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0049]實施例1:胞內細胞因子染色法檢測抗原特異性ΙΡ-10。
[0050]實驗步驟具體如下:
[0051]1.活動性結核病人外周血收集于抗凝管中，并用Ficoll密度梯度離心法，分離獲得 PBMCs。
[0052]2.PBMCs 經 5 — IOml PBS 或 RPMI1640 洗滌 2 次后，重懸于含 10% FBS 的 RPMI1640中，計算細胞數量，并調整至終濃度2.5 X 106/ml。
[0053]3.96孔細胞培養板中每孔加入100 μ I細胞懸液即0.25X IO6細胞。實驗孔中加入結核分枝桿菌特異性抗原或多肽，抗原或單條多肽終濃度為10μ g/ml，多肽庫中每條多肽終濃度為2 μ g/ml。陽性對照孔加入2.5 μ g/ml PHA,陰性孔加入相同體積的含10% FBS的RPMI1640培養基。各孔用含10% FBS的RPMI1640培養基補充至總體積200 μ I。
[0054]4.培養箱中培養2小時，37°〇，5%0)2，100%濕度。
[0055]5.每孔加入0.2μ I蛋白運輸阻斷劑(GoligStop，l:1000)，繼續培養6到12小時。
[0056]6.用 200 μ I PBS 或含 I % FBS 的 RPMI1640 洗滌 2 次。
[0057]7.PBS或RPMI1640-1% FBS配制表面染色抗體抗⑶14_PeCY7工作液，將細胞重懸于50 μ I表面抗體工作液中，于4°C避光染色30min。
[0058]8.用 200 μ I PBS 或含 I % FBS 的 RPMI1640 洗滌 2 次。
[0059]9.細胞重懸于100 μ I破膜和固定液中，于4°C避光孵育20min。
[0060]10.每孔加入200 μ I Perm/wash溶液洗漆2次。
[0061]11.用Perm/wash溶液配制胞內染色抗體IP_10_PE工作液，細胞重懸于50 μ I胞內抗體液中。于4°C避光孵育45min。[0062]12.每孔加入200 μ I Perm/wash溶液洗漆2次。
[0063]13.細胞重懸于100-200 μ I PBS或含有1-2% PFA的PBS中，并轉移到流式管中。于4°C避光保存至上機檢測，結果見圖1。由圖1a可知，結核分枝桿菌特異性抗原誘導的IP 一 10主要由⑶14+單核細胞分泌。結核病人PBMC分泌的抗原特異性IP — 10顯著高于正常對照人群(見圖lb)。胞內細胞因子染色法中，抗原特異性誘導的IP — 10用于活動性結核病人診斷的敏感性和特異性都為100% (見圖1C)。
[0064]實施例2 =ELISA檢測抗原特異性IP-10。
[0065]實驗步驟具體如下:
[0066]1.活動性結核病人、結核潛伏感染者、正常人以及非結核肺部疾病對照人群外周血收集于抗凝管中，并用Ficoll密度梯度離心法，分離獲得PBMCs。
[0067]2.PBMCs 用 5 — IOml PBS 或 RPMI1640 洗滌 2 次后重懸于含 10 % FBS 的 RPMI1640中，計算細胞數量，并調整至終濃度2.5 X 106/ml。
[0068]3.96孔細胞培養板中每孔加入100 μ I細胞懸液，即0.25 X IO6PBMC細胞。實驗孔中加入結核分枝桿菌特異性抗原或多肽，抗原或單條多肽終濃度為10μ g/ml，多肽庫中每條多肽終濃度為2 μ g/ml。陽性對照孔加入2.5 μ g/ml PHA,陰性孔加入相同體積的含10%FBS的RPMI1640培養基。各孔用含10% FBS的RPMI1640培養基補充至總體積200 μ I。
[0069]4.培養箱中培養20小時，371:，5%0)2，100%濕度。
[0070]5.收集細胞培養上清，凍于_80°C保存或直接用ELISA法檢測上清中IP-10濃度。
[0071]6.96孔ELISA板中每孔加入100 μ I抗人ΙΡ-10包被抗體，4°C孵育過夜。
[0072]7.每孔加入 300 μ I PBS-0.5% Tween20 (PBST)洗滌 5 次。
[0073]8.每孔加入200 μ I ELISA封閉液于室溫封閉lh。
[0074]9.每孔加入300 μ I PBST洗滌5次。
[0075]10.每孔加入100 μ I細胞培養上清或標準品，室溫孵育2h。
[0076]11.每孔加入300 μ I PBST洗滌5次。
[0077]12.每孔加入100μ I生物素標記檢測抗體及鏈親和素-辣根過氧化物酶(SAv-HRP)混合液，并于室溫孵育lh。
[0078]13.每孔加入300 μ I PBST洗滌7次。每次作用l_2min。
[0079]14.每孔加入100 μ I TMB底物，于室溫孵育30min。
[0080]15.每孔加入2N硫酸溶液100 μ 1，以終止反應。
[0081]16.全波長酶標儀于450nm處檢測吸光度(0D450)值。根據標準曲線計算出各樣本數值，結果見圖2。由圖2a可見，結核病人PBMC經結核分枝桿菌特異性抗原刺激后分泌的IP - 10水平顯著高于正常人或非結核肺部疾病對照人群(P〈0.001)。ROC曲線分析表明，抗原特異性誘導的IP - 10用于活動性結核病人診斷的敏感性和特異性都為100% (見圖2b)。圖3結果表明，經抗結核治療I個月后，結核分枝桿菌特異性抗原誘導PBMC分泌IP-10的水平顯著下降(P〈0.001)，其中83.3%轉為陰性水平，表明本發明試劑盒可用于檢測及有效評價臨床抗結核治療效果。
【權利要求】
1.一種用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療效果監測的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含: a)以下特異性抗體=IP-1O抗體和/或CD14抗體； b)抗原刺激物； c)陽性對照刺激劑。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述抗原刺激物為ESAT-6抗原和/或CFP-10抗原中的一條或多條多肽或其類似物。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述的多肽由20個氨基酸組成，所述其類似物為與其同源性在75%以上的多肽或多肽修飾物。
4.如權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于:所述抗原刺激物為SEQID NO: 1-SEQID NO: 18所示序列中的一條或多條多肽。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性抗體包括捕獲抗體和檢測抗體組成；所述捕獲抗體包括抗IP-10包被抗體；所述檢測抗體包括生物素標記的抗IP-10抗體、熒光素標記的抗IP-10抗體或抗⑶14抗體。
6.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，還包括鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶。
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照刺激劑為植物血凝素或乙酸肉豆蘧佛波醇。
8.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其檢測方法包括胞內細胞因子染色法、酶聯免疫吸附試驗、酶聯免疫斑點法、Luminex, PCR/RT 一 PCR法、免疫熒光法、放射性免疫檢定、免疫學干燥棒、免疫色譜法、免疫雜交、免疫印記、細胞增殖和酶擴增免疫測定技術。
9.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其檢測樣本來自于全血、血液分離獲得物、胸水、肺泡灌洗液、淋巴結和腦脊液，樣本分為三份:一份為無刺激物的陰性對照?’另一份用抗原刺激以產生應答樣品；第三份用植物血凝素刺激以作為陽性對照；用所述應答樣品所得的IP-10的值減去陰性對照以確定樣本的抗原特異性免疫應答水平，并與參考值進行對比。
10.如權利要求1-9任一項所述的試劑盒在制備輔助診斷活動性結核或結核潛伏感染的試劑盒中的應用。
11.如權利要求1-9任一項所述的試劑盒在制備評價臨床抗結核治療效果的試劑盒中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK104020297SQ201410255419
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】肖洋炯, 王穎, 沈浩 申請人:上海交通大學醫學院