一種飼料中微量植酸酶活性的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測飼料中微量植酸酶活性的方法。本方法在現有方法的基礎上，通過增加稱樣量和反應體系中的酶液量，能顯著提高飼料中植酸酶的檢測靈敏度，使線性檢測限降低到0.1U/g。當飼料中植酸酶酶活為0.18U/g時，利用本發明所述方法檢測的酶活回收率高達98.92％，變異系數僅為0.5％(n＝6)，兩次實驗的誤差小，從而說明本發明提供的方法其準確性和精確度均超過國標GB/T18634-2009《飼用植酸酶活性的測定——分光光度法》的要求，取得意料不到的技術效果。
【專利說明】一種飼料中微量植酸酶活性的檢測方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及酶制劑檢測【技術領域】，具體涉及一種飼料中微量植酸酶活性的檢測方法。【背景技術】
[0002]植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶。植酸酶具有特殊的空間結構，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸(鹽)降解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸(鹽)結合的其它營養物質。
[0003]由于植酸酶可將底物植酸鈉水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中與釩鑰酸銨生成黃色的復合物，因此，在波長415nm下進行比色，可測定植酸酶活性。目前已形成國標GB/T18634— 2009《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》。
[0004]但是，飼料中植酸酶活性的測定卻存在以下問題:①由于植酸酶在飼料中的添加量較低，現有方法不能將飼料中的植酸酶完全浸提出來；②飼料中存在大量物質可在酸性條件下與釩鑰酸銨發生顯色反應，干擾415nm波長下的比色反應，從而影響酶活測定。
[0005]國標GB/T18634— 2009《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》用于測定植酸酶樣品，相對較為準確，但是，用于測定添加在飼料中的植酸酶，該方法的檢測下限為2.0U/g飼料，而實際飼料中的植酸酶酶活約為0.5U/g飼料，遠遠低于該方法的檢測下限。另外，飼料中無機磷含量遠高于反應生成的無機磷量，影響植酸酶與底物的反應。樣品空白吸光值超出測定范圍。因此，目前急需開發一種準確檢測飼料中微量植酸酶含量的方法。
【發明內容】
[0006]本發明為解決現有技術問題提供了一種能夠檢測飼料中微量植酸酶活性的方法，具體是通過增加稱樣量和反應體系中的酶液量，有效提高檢測的靈敏度。
[0007]本發明所采用的技術方案是:本發明所述測定飼料中微量植酸酶活性的方法，其步驟如下:
[0008](I)試劑和溶液的配制
[0009]本方法中所有試劑，在沒有注明其它要求時，均指分析純試劑和符合GB/T6682中規定的三級水。清洗實驗用容器不要用含磷清洗劑。
[0010](1.1)0.25mol/L 乙酸緩沖液(I ):稱取 34.02g 三水乙酸鈉(CH3COONa.3Η20)于IOOOml容量瓶中，加入900ml水用鹽酸調節pH至5.0 ± 0.0I，并用蒸餾水定容至IOOOml，室
溫下存放兩個月有效。
[0011](1.2)0.25mol/L 乙酸緩沖液(II ):稱取 34.02g 三水乙酸鈉(CH3COONa.3H20)，
0.5g Trion X — 100，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于IOOOml容量瓶中，加入900ml水用鹽酸調節pH至5.0 ± 0.01，并用蒸餾水定容至1000ml，室溫下存放兩個月有效。
[0012](1.3) 7.5mmol/L 植酸鈉溶液:稱取 0.6929g 肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于 IOOml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸緩沖液(I )溶解并定容至刻度，用鹽酸調pH值到5.0，現用現配(實際反應液中的最終濃度為5.0mmol/L)。[0013](1.4)硝酸溶液:I體積硝酸與2體積水混合均勻。
[0014](1.5) 100g/L 鑰酸銨溶液:稱取 IOg 鑰酸銨[(NH4) 6Μο7024.4H20]于 100mL 容量瓶中，加入1.0ml氨水(25% )用水溶解定容至刻度。
[0015](1.6) 2.35g/L釩酸銨溶液:稱取0.235g釩酸銨(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
[0016](1.7)顏色終止液:移取2份硝酸溶液(1.4)，1份鑰酸銨溶液(1.5)，1份釩酸銨溶液(1.6)混合使用，現用現配。
[0017](1.8)植酸酶標準品(標明準確活性單位和類型)
[0018](1.9)已知酶活的液體植酸酶
[0019](2)測定
[0020](2.1)標準曲線
[0021]稱取不含植酸酶的空白飼料試樣7份，每份10克，精確至0.0002克，分別加入150ml三角瓶中，加入一個磁力棒，加入一定體積已知酶活的液體植酸酶(1.9)，使每個三角瓶中植酸酶酶活分別約為0u、0.5u、lu、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸緩沖液(1.1)，使加入液體總體積為50ml，封口膜封口后在磁力攪拌器上，室溫攪拌提取30min。搖勻，取20ml在離心機上以7000Xg離心10min。取上清液過0.45u m濾膜，取4ml濾液加入已稱重(精確至0.0OOlmg)的超濾管，7000 Xg離心至殘留液體積為約0.4ml。將離心管放在分析天平上，加入乙酸緩沖液(1.2)，通過稱重(Iml緩沖液=1.00263g)定容至4ml，混合均勻，制成待反應樣液。
[0022]取IOml試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物(1.3)開始，向每只試管中加入的時間間隔要絕對一致，37°C水浴30min。
[0023]反應步驟及試劑、溶液用量見表1。
[0024]表1反應步驟及試劑、溶液用量
[0025]
【權利要求】
1.一種微量植酸酶活性的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)試劑 本方法中所有試劑，在沒有注明其它要求時，均指分析純試劑和符合GB/T6682中規定的三級水。消洗實驗用容器不要用含磷消洗劑。 (1.1)0.25mol/L 乙酸緩沖液(I):稱取 34.02g 三水乙酸鈉(CH3COONa.3H20)于 1000ml容量瓶中，加入900ml水用鹽酸調節pH至5.0±0.01，并用蒸餾水定容至1000ml，室溫下存放兩個月有效。 (1.2)0.25mol/L 乙酸緩沖液(II):稱取 34.02g 三水乙酸鈉.(CH3COONa.3H20)，.0.5gTrionx-100，0.5g牛血消白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用鹽酸調節pH至5.0 ± 0.01，并用蒸餾水定容至1000ml，室溫下存放兩個月有效。 (1.3)7.5mmol/L植酸鈉溶液:稱取0.6929g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用0.25mol/L乙酸緩沖液(I)溶解并定容至刻度，用鹽酸調pH值到5.0，現用現配(實際反應液中的最終濃度為5.0mmol/L)。 (1.4)硝酸溶液:1體積硝酸與2體積水混合均勻。 (1.5) 100g/L鑰酸銨溶液:稱取IOg鑰酸銨[(NH4) 6Μο7024.4H20]于100mL容量瓶中，加入1.0ml氨水(25% )用水溶解定容至刻度。 (1.6)2.35g/L釩酸銨溶液:稱取0.235g釩酸銨(NH4VO3)于.100mL棕色容量瓶中，加入.2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。 (1.7)顏色終止液:移取2份硝酸溶液(1.4)，1份鑰酸銨溶液(1.5)，1份釩酸銨溶液(1.6)混合使用，現用現配。 (1.8)植酸酶標準品(標明準確活性單位和類型) (1.9)已知酶活的液體植酸酶 ⑵測定 (2.1)標準曲線 稱取不含植酸酶的空白飼料試樣7份，每份10克，精確至0.0002克，分別加入150ml三角瓶中，加入一個磁力棒，加入一定體積已知酶活的液體植酸酶(1.9)，使每個三角瓶中植酸酶酶活分別約為0u、0.5u、lu、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸緩沖液(1.1)，使加入液體總體積為50ml，封口膜封口后在磁力攪拌器上，室溫攪拌提取.30min。搖勻，取20ml在離心機上以7000 Xg離心10min。取上消液過0.45um濾膜，取4ml濾液加入已稱重(精確至.0.0OOlmg)的超濾管，7000 Xg離心至殘留液體積為約0.4ml。將離心管放在分析天平上，加入乙酸緩沖液(1.2),通過稱重(Iml緩沖液=1.00263g)定溶至4ml,混合均勻，制成待反應樣液。 取10ml試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物(1.3)開始，向每只試管中加入的時間間隔要絕對一致，37°C水浴30min。 反應步驟及試劑、溶液用量見下表。__
【文檔編號】G01N21/78GK104007110SQ201410251271
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】王海, 馬向東, 周茜, 邵靜 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司