基于dna快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法

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基于dna快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法；通過在小粒徑納米金表面快速組裝DNA序列和小分子后，繼續在納米金核表面再生成一定厚度的金殼，并由于此結構的特殊性而得到高效的SERS信號。該探針相較于其他方法組裝快速，拉曼小分子存在于納米金核殼之間固定尺寸的間隙中，從而每個分子所在的區域即“熱點”區域產生的SERS信號基本一致，且有著很好的重復性，可用于生物傳感器、生物分子檢測及細胞成像等領域。
【專利說明】基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于納米材料的功能化及應用領域，涉及一種基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法。

【背景技術】
[0002] 表面增強拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)效應是指位于粗糙金屬表面的小分子本身的拉曼信號得到增強的現象。這種現象已在表面科學、分析科學和生物科學等領域得到廣泛的應用，為深入表征各種表面（界面）的結構和過程提供分子上水平的信息，如鑒別分子或離子在表面上的鍵合、構型和取向以及材料的表面結構。關于SERS的增強機制，目前較為認可的是電磁場增強機理，該機理中涉及到的"熱點"（hot pot) -般是指在一些納米粒子組成的聚集體中，相鄰納米粒子之間的空隙處區域，此區域的SERS效應最強。但在金、銀、銅等具有強SERS效應金屬需要表面粗糙化處理后才具有高 SERS活性，這就要求所用金屬基底的高重復性和均一性。
[0003] 納米金顆粒可與氨基發生非共價的靜電吸附，或與巰基形成強的Au-S共價鍵，從而使得膠體金能夠與生物活性分子相互結合，以形成生物體系檢測的探針，目前被廣泛應用于免疫組織染色的電鏡觀察研究。然而在膠體金溶液的應用過程中，還存在著納米金溶膠穩定性受環境因素影響嚴重的問題，在電解質溶液中易形成不可逆聚集，影響其后續使用。研究表明，DNA修飾的金溶膠可以穩定地存在于離子緩沖溶液中，將在鹽離子存在的核酸分子變性、復性、雜交等實驗研究中有極好的應用前景。
[0004] 關于DNA修飾的核殼納米金生物探針及制備的專利已有報道，通過對現有文獻的檢索發現，中國發明專利CN103048306A公開了一種具有高SERS效應的核殼納米金生物探針及制備和應用；但這種制備方法中，參考了美國西北大學的Mirkin等將SH-DNA組裝到納米金表面的技術，具體為：將SH-DNA加于納米金溶液中，室溫過夜后，逐次滴加磷酸鹽緩沖液，并使鹽的終濃度在〇. 15M左右；結束后，再次室溫過夜，通過長時間的鹽老化步驟來實現SH-DNA在納米金顆粒表面的組裝；組裝過程較為繁瑣（滴加次數至少6次，時間間隔至少30min)耗時較長（需要約48h)。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，提供一種基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法；除了本身具有納米材料的一切特性，具備高的SERS效應夕卜，還能夠實現探針的快速制備，應用于生物分子檢測及細胞成像等領域。具體而言，在本發明中，通過酸溶液調節納米金溶液的pH，催化等量SH-DNA在納米金表面的吸附反應，實現DNA在納米金表面的組裝只需約30min，組裝快速，操作簡單；這將大大提高核殼拉曼探針制備效率。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0007] 本發明公開了一種基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，在小粒徑納米金核表面快速組裝DNA后，修飾一層小分子，再繼續在表面生成一層金殼，即得所述核殼拉曼探針；所述核殼之間縫隙間存在具有拉曼信號的小分子。
[0008] 優選的，所述核殼拉曼探針的制備包括如下步驟：
[0009] A、納米金核表面組裝DNA ;
[0010] B、調節pH催化吸附反應；
[0011] C、離心洗滌后得溶液I;
[0012] D、納米金核表面吸附小分子；
[0013] E、離心洗滌得溶液II;
[0014] F、納米金核表面進行金殼的生長；
[0015] G、金殼結構離心洗滌。
[0016] 優選的，所述納米金核為粒徑為5?15nm的納米金粒子。使用納米金核過小，可能導致其表面組裝拉曼小分子量少以及制備核殼拉曼探針尺寸較小，從而影響探針的SERS 效率；使用納米金核過大時，則導致所制備核殼拉曼探針過大，而造成聚集現象或是影響后期應用（如應用于生物檢測系統）等。
[0017] 優選的，所述組裝DNA具體為：在納米金核溶液（溶劑為磷酸緩沖液；納米金核的濃度為1〇ηΜ)中加入SH-PolyA DNA，至SH-PolyA DNA的終濃度為0. 1?5 μ M，混合溶液中 DNA與納米金核的摩爾比約為300:1 ;室溫下輕微震蕩。DNA濃度過低時，不足以形成核殼探針中間的縫隙，直接影響探針的SERS效率；DNA濃度過高則造成不必要的浪費。
[0018] 優選的，步驟Β具體為：邊震蕩邊緩慢滴加0. 1?2Μ HC1溶液，調節步驟Α所得溶液pH至2?4。更優選調節pH至2. 5?4。適合的pH值促進DNA的高效率組裝，過低或過高可能引起組裝過程中納米金的聚集。
[0019] 優選的，步驟C中，所述離心洗漆條件為：4°C，12000?15000rpm/min，20min，一次，洗滌液為PH7. 4的10mM磷酸鹽緩沖液（PB)溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS)重懸浮。轉速過低造成探針的損失，過高可能會引起探針的聚集。
[0020] 優選的，步驟D具體為：每5 μ L?5mL溶液I中加入1?100 μ L，0. 1?1M小分子溶液，吸附室溫過夜；所述小分子是具有明顯特征峰的小分子，選自5, 5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB)、酞嗪（PL)、2, 3-二氮雜萘（ΡΗΤΗ)、花青類燃料、聯二吡啶、熒光素異硫氰酸酯（FITC)中的一種或幾種。
[0021] 優選的，步驟Ε中，所述離心洗漆條件為：25°C，12000?15000rpm/min，20min，三次，洗滌液為PH7. 4的10mM的PB溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS)重懸浮。
[0022] 優選的，步驟F具體為：溶液II中依次加入0. 1?5%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液 (PVP)，0. 1?1M的鹽酸羥胺水溶液（ΝΗ20Η ·Η(：1)，邊震蕩邊加入0. 01?1 %的氯金酸水溶液（HAuC14)，混勻震蕩lmin ;所述溶液II、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、鹽酸羥胺水溶液、氯金酸水溶液的體積比為10:5:2:2。
[0023] 優選的，步驟G中，所述離心洗漆條件為：20°C，3000?10000rpm/min，6min，三次，洗滌液為Milli-Q水（超純水），后用10?1000 μ L Milli-Q水重懸浮。
[0024] 本發明還涉及一種前述的方法制備得到的具有高SERS效應的核殼拉曼探針，所述核殼拉曼探針粒徑為40?50nm，濃度為0. 1?InM。
[0025] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明通過在小粒徑納米金表面快速組裝一段DNA序列及拉曼小分子，通過還原法在金核表面生成一定厚度的金殼，核殼之間存在一定尺寸的間隙，拉曼小分子就存在于此間隙中，并由于此結構的特殊性而得到高效的SERS信號。此外，本發明組裝快速，拉曼小分子存在于納米金核殼之間固定尺寸（約 lnm)的間隙中，從而每個分子所在的區域即"熱點"區域產生的SERS信號基本一致，且有著很好的重復性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：
[0027] 圖1為納米金核殼探針結構的TEM圖片；
[0028] 圖2為制得的納米金核殼拉曼探針的高效SERE效果示意圖。

【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0030] 實施例1
[0031] 10(^1^、1011]\1的粒徑為1311111的納米金溶液中加入4 4 1^，10(^]\^!11〇17六0嫩，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為2. 5 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ LO. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH20H.HC1，邊震蕩邊加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震蕩lmin后，2(TC，4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液為 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備DTNB高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0032] 圖1為本實施例制得的納米金核殼探針結構的TEM圖片，由圖1知，通過該方法有效制備了納米金的核殼結構，且可在核殼之間觀察到明顯的縫隙結構，此縫隙尺寸約為 lnm ;拉曼小分子DTNB，組裝在納米金核表面即位于核殼探針的縫隙處；DTNB所在的位置為 "熱點"，從而引發高效的SERS效應。
[0033] 圖2為本實施例制得的納米金核殼拉曼探針的高效SERS結果，圖中所出現的峰位與DTNB的特征峰相吻合。
[0034] 實施例2
[0035] 100yL、10nM 的粒徑為 13nm 的納米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為3 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB (10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH2OH.HCl，邊震蕩邊加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震蕩lmin后，2(TC，4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液為 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備DTNB高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0036] 實施例3
[0037] 100 μ L、10nM的粒徑為13nm的納米金溶液中加入4 μ L，100 μ M SH-polyA DNA，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為3. 5 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB (10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH20H.HC1，邊震蕩邊加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震蕩lmin后，2(TC，4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液為 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Mi 11 i-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備DTNB高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0038] 實施例4
[0039] 100yL、10nM 的粒徑為 13nm 的納米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為4 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB (10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH20H.HC1，邊震蕩邊加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震蕩lmin后，2(TC，4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液為 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Mi 11 i-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備DTNB高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0040] 實施例5
[0041] 100yL、10nM 的粒徑為 13nm 的納米金溶液中加入 4μ?，100μ M SH-polyA DNA，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為4 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB(10mM，pH7.4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取l〇〇yL上述溶液，加入100yLl%的PVP，25yL10mM的NH20H*HC1，邊震蕩邊加入 20 μ L0. 2%的HAuC14,混勻震蕩lmin后，20°C, 4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗滌液為Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Mi 11 i-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備DTNB高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0042] 實施例6
[0043] 100yL、10nM 的粒徑為 13nm 的納米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為4 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ LO. 1M的吡啶小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB(10mM，pH7.4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取l〇〇yL上述溶液，加入lOOyLl%的PVP，25yL10mM的NH20H*HC1，邊震蕩邊加入 20 μ L0. 2%的HAuC14,混勻震蕩lmin后，20°C, 4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗滌液為Milli-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備批陡高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0044] 實施例7
[0045] 100yL、10nM 的粒徑為 13nm 的納米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA，室溫輕微震蕩；后加入1M的HC1調節溶液pH，逐滴邊震蕩邊加入，直至溶液pH為4 ;4°C， 12000rpm/min，20min條件下進行離心洗漆一次，洗漆液為PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重懸浮；100 μ L0. 1M的ΡΗΤΗ小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室溫過夜；過夜溶液離心洗滌三次，所用洗滌液為PB(10mM，pH7.4)，后用lmlO. 1M的PBS重懸浮；取1〇〇μ L上述溶液，加入100μ L1%的PVP，25y LlOmM的ΝΗ20Η · HC1，邊震蕩邊加入 20 μ L0. 2%的HAuC14,混勻震蕩lmin后，20°C, 4000rpm/min，離心洗漆三次，每次6min，所用洗滌液為Milli-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重懸浮；該方式制備得到的金殼結構粒徑在40?50nm，濃度為InM，具備ΡΗΤΗ高增強特征峰的一種核殼納米金拉曼探針。
[0046] 以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。
【權利要求】
1. 一種基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，在小粒徑納米金核表面快速組裝DNA后，修飾一層小分子，再繼續在表面生成一層金殼，即得所述核殼拉曼探針；所述核殼之間縫隙間存在具有拉曼信號的小分子。
2. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，所述核殼拉曼探針的制備包括如下步驟： A、納米金核表面組裝DNA; B、調節pH催化吸附反應； C、離心洗滌后得溶液I ; D、納米金核表面吸附小分子； E、離心洗滌得溶液II ; F、納米金核表面進行金殼的生長； G、金殼結構離心洗滌。
3. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，所述納米金核為粒徑為5?15nm的納米金粒子。
4. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，所述組裝DNA具體為：在納米金核溶液中加入SH-PolyA DNA，至SH-PolyA DNA的終濃度為0. 1?5 μ M，混合溶液中DNA與納米金核的摩爾比約為300:1 ;室溫下輕微震蕩。
5. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，步驟Β具體為：邊震蕩邊緩慢滴加0. 1?2MHC1溶液，調節步驟Α所得溶液pH至2?4。
6. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述離心洗漆條件為：4°C，12000?15000rpm/min，20min，一次，洗漆液為 PH7. 4的10mM PB溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸鹽緩沖生理鹽水重懸浮。
7. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，步驟D具體為：每5 μ L?5mL溶液I中加入1?100 μ L，0. 1?1M小分子溶液，吸附室溫過夜；所述小分子是具有明顯特征峰的小分子，選自5,5' -二硫雙（2-硝基苯甲酸）、酞嗪、2, 3-二氮雜萘、花青類燃料、聯二吡啶、熒光素異硫氰酸酯中的一種或幾種。
8. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，步驟Ε中，所述離心洗滌條件為：25°C，12000?15000rpm/min，20min，三次，洗滌液為 pH7. 4的10mM的PB溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸鹽緩沖生理鹽水重懸浮。
9. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，步驟F具體為：溶液II中依次加入0. 1?5%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，0. 1?1M的鹽酸羥胺水溶液，邊震蕩邊加入0. 01?1 %的氯金酸水溶液，混勻震蕩lmin ;所述溶液II、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、鹽酸羥胺水溶液、氯金酸水溶液的體積比為10:5:2:2。
10. 如權利要求1所述的基于DNA快速組裝技術的核殼拉曼探針的制備方法，其特征在于，步驟G中，所述離心洗滌條件為：20°C，3000?10000rpm/min，6min，三次，洗滌液為 Mi 11 i-Q水，后用10?1000 μ L Milli-Q水重懸浮。
11. 一種如權利要求1?10中任意一項所述的方法制備得到的具有高SERS效應的核殼拉曼探針，所述核殼拉曼探針粒徑為40?50nm，濃度為0. 1?InM。
【文檔編號】G01N21/65GK104062276SQ201410251096
【公開日】2014年9月24日申請日期:2014年6月6日優先權日:2014年6月6日
【發明者】胡沖婭, 顏娟, 何丹農, 宋世平, 樊春海, 余震申請人:上海交通大學, 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司

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