一種液相色譜-酶電極聯用裝置及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種液相色譜-酶電極聯用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機溶劑去除單元、活性評價單元和計算機，色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐、色譜泵、進樣閥和液相色譜柱，液相色譜柱通過管路連接所述的檢測器；有機溶劑去除單元用于去除樣品中的有機溶劑，有機溶劑去除單元的前端連接檢測器；活性評價單元包括混合器、緩沖液儲罐和酶電極，混合器與有機溶劑去除單元的后端相連接，緩沖液儲罐連接至混合器，混合器連接至酶電極；計算機分別電連接所述的檢測器與酶電極。本發明能夠在線、實時提供分析樣品中各成分的生物活性，實現分析待測樣品中的成分組成并在線評價各組分對應的生物活性。
【專利說明】—種液相色譜-酶電極聯用裝置及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種屬于藥物領域，尤其涉及一種液相色譜-酶電極聯用裝置及中藥成分-活性在線分析應用。
【背景技術】
[0002]隨著中藥產業規模的擴大及中藥研究成果的發展，中藥分析技術取得了極大進展，中藥分析的對象更集中于針對中醫藥現代化研究中的關鍵科學問題；同時中藥分析需要將各種新方法、新技術整合使之成為解決關鍵科學問題的新體系，而不再局限于分析中藥的物質組成，更注重解決的是物質的組成及其功能的相關性。整體系統生物學(GlobalSystems Biology)的發展,系統揭示化學物質組的變化與生物系統應答的時空響應的相關性；以及基于代謝組學的方藥指紋-藥代標示物-藥效靶標三維模式的中藥復方代謝的研究設想，均體現了改進現有中藥分析新技術，整合分析方法應用的發展趨勢。
[0003]中藥成分分析技術在以往的液相色譜、氣相色譜、薄層色譜的基礎上，發展了氣相-質譜聯用、液相-質譜聯用乃至色譜-核磁聯用等技術，在對中藥復雜成分進行分離分析的同時提供了豐富的結構信息，實現了中藥中已知或未知成分的定性定量分析，極大地推進了中藥成分化學研究，但是現有的分析技術均以化學成分研究為目的，無法在線反應或評價成分的生物活性。因此，選擇與中藥功效相關的酶蛋白分子，通過物理化學交聯作用固定化做成固定化酶膜，然后與電化學傳感器結合構成酶電極(enzyme electrode),利用酶反應的專一性、穩定性以及電化學分析的快速、靈敏，在線、實時提供分析樣品中各成分的生物活性。酶電極聯合液相分析，能夠突破現有分析技術中成分活性信息的缺失，為建立新的中藥質量評價模式提供思路和技術方案。
[0004]電極分析法(包括酶電極)作為一種電化學檢測手段，已經成功實現與離子色譜的在線聯用。但由于液相色譜流動相中有機溶劑的存在，限制了酶電極與液相色譜的聯用。若將有機溶劑去除裝置連接于液相色譜和酶電極之間，將流動相中有機溶劑去除，則可實現液相色譜與酶電極的聯用。
[0005]在色譜分析中，濃縮富集是樣品的常規前處理手段，即在樣品進色譜柱分離之前進行濃縮富集。也有柱后濃縮富集的，比如液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)及液相色譜-蒸發光散射法(LC-ELSD)，但它們都是質量型檢測器而非濃度型檢測器。若在常規濃度型檢測器之后連接一個溶劑去除裝置，采用具有多孔性和疏水性的多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜作為滲透膜，允許有機溶劑滲透，能夠實現溶劑去除，并達到樣品組分的濃縮目的，為進一步的活性評價提供基礎。有機溶劑去除裝置設計:流動相通過多孔滲透膜管時，在管壁外圍流過已加熱的干燥氣體(比如空氣或氮氣)，有機溶劑受熱揮發為氣態，透過滲透膜去除。
[0006]中藥成分組成復雜，常規的分析技術在中藥的定性、定量分析中發揮了中藥作用，但目前尚未見能夠同時提供中藥成分組成與組分一一對應的活性信息的分析方法。本發明專利以小型化固定化酶電極為活性評價靶標，通過色譜分離-檢測器-在線溶劑去除-酶電極檢測各部件的整合，形成中藥在線成分-活性評價實驗裝置，并利用該裝置，開展白術的中藥成分-活性在線評價應用。分析結果將同時提供中藥成分組成信息以及與酶電極作用的活性信息，該在線分析結果，結合化學成分鑒定結果，將全面提供白術成分-活性信息，能夠為闡述白術藥效作用機制提供新的技術方法。同時該技術能夠推廣應用至其他中藥，能夠進一步加強與中醫理論相結合的有效成分研究，最終建立一種新的以成分、活性為綜合指標的中藥質量評價體系，通過加強質控，提高中藥材質量，促進中藥產業發展。
【發明內容】
[0007]為了解決上述的技術問題，本發明的一個目的是提供一種液相色譜-酶電極聯用裝置，通過該裝置可以得到待測樣品中的成分組成信息，并進一步明確各組分對應的酶結合活性，得到成分-活性在線評價結果。本發明的另外一個目的是提供采用上述的裝置進行中藥成分-活性在線分析的方法。
[0008]為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案:
一種液相色譜-酶電極聯用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機溶劑去除單元、活性評價單元和計算機，所述的色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐、色譜泵、進樣閥和液相色譜柱，液相色譜柱通過管路連接所述的檢測器；所述的有機溶劑去除單元用于去除樣品中的有機溶劑，有機溶劑去除單元的前端連接檢測器；所述的活性評價單元包括混合器、緩沖液儲罐和酶電極，混合器與有機溶劑去除單元的后端相連接，緩沖液儲罐連接至混合器，混合器連接至酶電極；所述的計算機分別電連接所述的檢測器與酶電極。
[0009]作為優選，所述的色譜分離單元采用高效液相色譜分離系統或超高壓液相色譜分尚系統。
[0010]作為優選，所述的檢測器選用單波長紫外檢測器、二極管整列檢測器或熒光檢測器。
[0011]作為優選，所述的有機溶劑去除單元包括氮氣鋼瓶、氮氣泵、加熱管和蒸發管，氮氣鋼瓶通過氮氣泵連接加熱管，所述的蒸發管包括上隔層和下隔層，下隔層為流動相管路，流動相管路的前端與檢測器相連接，上層為加熱氮氣管路，加熱氮氣管路與加熱管相連接，上隔層和下隔層之間為微孔滲透膜，流動相管路后端與混合器相連接。
[0012]作為再優選，所述的微孔滲透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜構成。
[0013]作為再優選，所述的氮氣鋼瓶采用常規的氮氣鋼瓶，氮氣泵流量控制范圍:0.1-2L/h，壓力:5-50 PSI，加熱管溫度控制范圍:50-100 °C。
[0014]為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案:
一種液相色譜-酶電極聯用中藥成分活性在線分析方法，該方法采用上述的液相色譜-酶電極聯用裝置進行包括以下步驟的操作:
1)流動相的配制
采用有機溶劑為有機相，以水或緩沖溶液為水相，經微孔濾膜濾過后，備用；
2)待測樣品的預處理
取待測樣品，經提取、溶劑萃取、濃縮、定容、微孔濾膜濾過等操作過程，制備成供試品溶液，備用；
3)活性評價單元緩沖液的配制 根據需要，選擇適宜的緩沖液體系，配制緩沖溶液，備用；
4)色譜分離條件設置
在已連接完整的液相色譜-酶電極聯用裝置上，開啟計算機，設置流動相流速，選擇梯度洗脫需要設置梯度洗脫程序；取步驟I)的流動相，開啟色譜泵驅動流動相，進入分離程序；
5)進樣
取步驟2)的供試品溶液，經進樣閥注入色譜分離系統；在步驟4)的分離條件進行成分分離；同時開啟檢測器電源，設置檢測器檢測參數；供試品溶液通過色譜分離柱，復雜成分實現柱分離；分離后的成分由檢測得到色譜信號，并流出檢測器成為分離成分溶液；
6)有機溶劑去除
色譜分離單元開啟的同時開啟有機溶劑去除單元，將步驟5)的純化成分溶液中的有機溶劑去除，純化成分保留在水相中成為純化成分水溶液；
7)酶電極安裝
購買市售小型酶電極，或選擇適宜的酶，自行制備固定化酶電極，安裝于活性評價單元，備用；
8)活性評價
步驟6)的純化水溶液流入混合器，同時取步驟2)的緩沖液，注入混合器中混合，混合流經步驟7)的酶電極，成分與酶結合反應，產生電流或電位等信號改變，計算機檢測信號得到電化學信號；
9)數據分析
根據步驟5)得到的色譜信號，以及步驟8)得到的電化學信號，通過數據分析，得到待測樣品中的成分組成信息，并進一步明確各組分對應的酶結合活性，得到成分-活性在線評價結果。
[0015]作為優選，所述的步驟I)有機溶劑選用甲醇或乙腈。
[0016]本發明由于采用了上述的實驗裝置及應用步驟，具有以下的特點:
1、設計創新性
現有的分析技術均以化學成分研究為目的，無法提供即時的生物活性信息。本發明專利選擇與中藥功效相關的酶蛋白分子，制備酶電極，作為活性評價的靶標，能夠在線、實時提供分析樣品中各成分的生物活性，實現分析待測樣品中的成分組成并在線評價各組分對應的生物活性。酶電極聯合液相分析，能夠突破現有分析技術中成分活性信息的缺失，為建立新的中藥質量評價模式提供思路和技術方案。
[0017]2、應用前景及作用良好
該技術能夠推廣應用至其他中藥，能夠進一步加強與中醫理論相結合的有效成分研究，最終建立一種新的以成分、活性為綜合指標的中藥質量評價體系，通過加強質控，提高中藥材質量，促進中藥產業發展。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1本發明的裝置示意圖。
[0019]圖2成分-活性在線評價模式示意圖。[0020]圖3白術醇提物HPLC圖。
[0021]圖4白術成分酶電極檢測信號圖，a, b, C，d依次為白術內酯I1、111、I和蒼術酮。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
如圖1所示的一種液相色譜-酶電極聯用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機溶劑去除單元、活性評價單元和計算機12，色譜分離單元采用高效液相色譜分離系統或超高壓液相色譜分離系統，檢測器選用單波長紫外檢測器、二極管整列檢測器或熒光檢測器。所述的色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐1、色譜泵2、進樣閥3和液相色譜柱4，液相色譜柱4通過管路連接所述的檢測器5。所述的有機溶劑去除單元包括氮氣鋼瓶、氮氣泵7、加熱管8和蒸發管6，氮氣鋼瓶采用常規的氮氣鋼瓶，氮氣泵7流量控制范圍:0.1-2 L/h，壓力:5-50 PSI，加熱管8溫度控制范圍:50-100 °C。氮氣鋼瓶通過氮氣泵7連接加熱管8，所述的蒸發管6包括上隔層和下隔層，下隔層為流動相管路，流動相管路的前端與檢測器5相連接，上層為加熱氮氣管路，加熱氮氣管路與加熱管8相連接，上隔層和下隔層之間為微孔滲透膜，微孔滲透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜構成。所述的活性評價單元包括混合器9、緩沖液儲罐10和酶電極11，混合器9連接流動相管路的后端相連接，緩沖液儲罐10連接至混合器9，混合器9連接至酶電極11 ;所述的計算機12分別電連接所述的檢測器5與酶電極11。
[0023]實施例2
一種液相色譜-酶電極聯用中藥成分活性在線分析方法，該方法采用實施例1的液相色譜-酶電極聯用裝置進行包括以下步驟的操作:
I)流動相的配制
以水為水相，甲醇為有機相。取去離子純水和色譜甲醇，分別過0.45μ孔徑的微孔濾膜，濾液分別置于水相及有機相溶劑瓶中，備用。
[0024]2)待測樣品的預處理
取干燥白術藥材，粉碎，稱取0.6 g，置于25 mL容量瓶中，加20 mL甲醇，超聲提取20min，取出，放至室溫，加色譜甲醇至刻度，搖勻，提取液經0.22 μ微孔濾膜濾過，續濾液置于進樣瓶中，制備成供試品溶液，備用。
[0025]3)活性評價單元緩沖液的配制
選擇PH與人工腸液接近的緩沖液，稱取磷酸二氫鉀6.8 g，置于1000 mL容量瓶中，力口水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節PH值至6.8，加水至刻度，搖勻，即得緩沖液，備用。
[0026]4)色譜分離條件設置
液相色譜系統選用LC-20A-VP液相色譜儀(日本島津)，CAPCELL PAK C18分析色譜柱(250 mmX4.6 mm,5 μ m)，連接實驗裝置各部件；開啟計算機電源，設置流動相流速為1.0mL/min，梯度洗脫程序見表；取步驟I)的流動相，將色譜泵水相及有機相泵頭置于各自的溶劑瓶中，開啟色譜泵電源，以梯度洗脫程序起始比例驅動流動相，系統平衡20 min后運行梯度洗脫程序。
[0027]梯度洗脫程序
【權利要求】
1.一種液相色譜-酶電極聯用裝置，該裝置包括色譜分離單元、檢測器、有機溶劑去除單元、活性評價單元和計算機(12)，其特征在于:色譜分離單元包括依次通過管路相互連接的流動相儲罐(I)、色譜泵(2)、進樣閥(3)和液相色譜柱(4)，液相色譜柱(4)通過管路連接所述的檢測器(5);所述的有機溶劑去除單元用于去除樣品中的有機溶劑，有機溶劑去除單元的前端連接檢測器(5);所述的活性評價單元包括混合器(9)、緩沖液儲罐(10)和酶電極(11)，混合器(9)連接與有機溶劑去除單元的后端相連接，緩沖液儲罐(10)連接至混合器(9)，混合器(9)連接至酶電極(11);所述的計算機(12)分別電連接所述的檢測器(5)與酶電極(11)。
2.根據權利要求1所述的一種液相色譜-酶電極聯用裝置，其特征在于:所述的色譜分離單元采用高效液相色譜分離系統或超高壓液相色譜分離系統。
3.根據權利要求1所述的一種液相色譜-酶電極聯用裝置，其特征在于:檢測器(5)選用單波長紫外檢測器(5 )、二極管整列檢測器(5 )或熒光檢測器(5 )。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種液相色譜-酶電極聯用裝置，其特征在于:所述的有機溶劑去除單元包括氮氣鋼瓶、氮氣泵(7)、加熱管(8)和蒸發管(6)，氮氣鋼瓶通過氮氣泵連接加熱管(8)，所述的蒸發管(6)包括上隔層和下隔層，下隔層為流動相管路，流動相管路的前端與檢測器(5)相連接，上層為加熱氮氣管路，加熱氮氣管路與加熱管(8)相連接，上隔層和下隔層之間為微孔滲透膜，流動相管路后端與混合器(9)相連接。
5.根據權利要求4所述的一種液相色譜-酶電極聯用裝置，其特征在于:微孔滲透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纖維膜構成。
6.根據權利要求4所述的一種液相色譜-酶電極聯用裝置，其特征在于:氮氣鋼瓶采用常規的氮氣鋼瓶，氮氣泵流量控制范圍:0.l_2L/h，壓力:5-50PSI，加熱管(8)溫度控制范圍:50-100°Co
7.一種液相色譜-酶電極聯用中藥成分活性在線分析方法，其特征在于:該方法采用權利要求廣6任意一項權利要求所述的液相色譜-酶電極聯用裝置進行包括以下步驟的操作: 1)流動相的配制 采用有機溶劑為有機相，以水或緩沖溶液為水相，經微孔濾膜濾過后，備用； 2)待測樣品的預處理 取待測樣品，經提取、溶劑萃取、濃縮、定容、微孔濾膜濾過等操作過程，制備成供試品溶液，備用； 3)活性評價單元緩沖液的配制 根據需要，選擇適宜的緩沖液體系，配制緩沖溶液，備用； 4)色譜分離條件設置 在已連接完整的液相色譜-酶電極聯用裝置上，開啟計算機，設置流動相流速，選擇梯度洗脫需要設置梯度洗脫程序；取步驟I)的流動相，開啟色譜泵驅動流動相，進入分離程序； 5)進樣 取步驟2)的供試品溶液，經進樣閥注入色譜分離系統；在步驟4)的分離條件進行成分分離；同時開啟檢測器(5)電源，設置檢測器(5)檢測參數；供試品溶液通過色譜分離柱，復雜成分實現柱分離；分離后的成分由檢測得到色譜信號，并流出檢測器(5)成為分離成分溶液； 6)有機溶劑去除 色譜分離單元開啟的同時開啟有機溶劑去除單元，將步驟5)的純化成分溶液中的有機溶劑去除，純化成分保留在水相中成為純化成分水溶液； 7)酶電極(11)安裝 購買市售小型酶電極(11)，或選擇適宜的酶，自行制備固定化酶電極(11)，安裝于活性評價單元，備用； 8)活性評價 步驟6)的純化水溶液流入混合器(9)，同時取步驟2)的緩沖液，注入混合器(9)中混合，混合流經步驟7)的酶電極(11 )，成分與酶結合反應，產生電流或電位等信號改變，計算機檢測信號得到電化學信號； 9)數據分析 根據步驟5)得到的色譜信號，以及步驟8)得到的電化學信號，通過數據分析，得到待測樣品中的成分組成信息，并進一步明確各組分對應的酶結合活性，得到成分-活性在線評價結果。
8.根據權利要求7所述的一種液相色譜-酶電極聯用中藥成分活性在線分析方法，其特征在于:步驟I)有機溶劑選用甲醇或乙腈。
【文檔編號】G01N30/88GK104007219SQ201410248217
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】壽旦, 王娜妮, 張揚, 董宇 申請人:浙江省中醫藥研究院