一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及應用，首先在96孔板上修飾膠體金，利用金-硫鍵的結合把一端含巰基另外一端含生物素的肽連接到膠體金-96孔板上。再制備出鏈霉親和素-蔗糖轉化酶-膠體金探針(streptavidin-轉化酶-AuNPs)。通過生物素和親和素的特異性結合，從而得到streptavidin-轉化酶-AuNPs-肽修飾的96孔板(基質金屬蛋白酶-2生物傳感器)。MMP-2可以把含特異性序列PLGVR的肽切割成兩部分，streptavidin-轉化酶-AuNPs在上清液中，吸出上清液加入果糖溶液，根據血糖儀讀數，從而實現MMP-2濃度的測定。本發明的傳感器具有很高的選擇性和檢測靈敏度。
【專利說明】—種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學與生物傳感器領域，具體為一種檢測基質金屬蛋白酶-2生物傳感器的制備方法及其應用。另外，本發明還涉及所述的生物傳感器檢測基質金屬蛋白酶-2的方法。
【背景技術】
[0002]腫瘤浸潤轉移的過程是腫瘤細胞與宿主相互作用的多環節過程。腫瘤細胞分泌產生多種蛋白水解酶參與降解細胞外基質。基質金屬蛋白酶是其中的主要酶類，基質金屬蛋白酶是一個大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)除可以降解IV型膠原外，還能降解V、YD型膠原及明膠，與腫瘤侵襲轉移的關系最為密切。近年來，MMP-2的結構和功能得到了廣泛、深入的研究。很多研究結果表明，MMP-2在多種疾病的病理進程中發揮著關鍵的作用。一些研究者根據實驗結果指出，通過檢測MMP-2可以估計這些疾病的病理進程，也就是MMP-2可以作為這些疾病的預后指標。據此，研制準確、靈敏、快速測定MMP-2、MMP-7活性的方法具有極高的醫學應用價值。
[0003]基質金屬蛋白酶常用測定方法有酶聯免疫吸附法(Patel, S.； Sumitra, G.；Koner, B.C.；Saxena, A.Clin.Biochem.2011, 44, 869-872);表面等離子共振法(Pieper-Fiirst, U.；Kleuser, U.； StocMeiE5 ff.F.M.；ffarsinke, A.；Scheller, F.ff.Anal.Biochem.2004, 332, 160-167)；凝膠電泳法(Barbosa, F Jr.；Gerlach, R.F.；Tanus-Santos,J.E.Basic Clin.Pharmaco1.Toxicol.2006,98,559-564.Yamane, T.；Mitsumata, M.；Yamaguchi, N.；Nakazawa, T.；Mochizuki, K.；Kondo, T.；Kawasaki, T.；Murata, S.；Yoshida, Y.;Katoh, R.Cell Tissue Res.2010，340，471-479)；突光法(Lefkowitz, R.B.; Schmi d_ Schonbein, G.ff.；He 11 er, M.J.Ana 1.Chem.2010，82，8251-8258);酶切割超磁性法(Zhao, M.Josephson, L.;Tang, Y.；ffeissleder, R.Angew.Chem., Int.Ed.2003, 42, 1375-1378);磁共振成像法(Harris, T.J.；von Maltzahn, G.；Derfus, A.M.；Ruoslahti, E.；Bhatia, S.N.Angew.Chem., Int.Ed.2006，45，3161-3165)和熒光共振能量轉移法(Wang, Y.H.；Shen, P.；Li, C.Y.；ffang, Y.Y.；Liu, Z.H.Anal.Chem.2012, 84, 1466-1473)等。這些方法各有其優點，能不同程度的滿足對基質金屬蛋白酶-2的檢測要求，但方法復雜，需要貴重的儀器，檢測成本高。所以必須發展一種方法簡單、成本低廉的新型檢測方法。
【發明內容】
[0004]鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及應用，以及提供一種采用所述的生物傳感器檢測基質金屬蛋白酶-2的方法。[0005]本發明的目的是這樣實現的:
[0006]一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)將100 μ L0.1?10 μ M肽溶液加到膠體金修飾的96孔板中，37°C反應12?60h，用Tris-HCl溶液沖洗各孔，得肽修飾膠體金_96孔板；
[0008](2)加10 μ L0.1?2mg/mL鏈霉親和素溶液于轉化酶-AuNPs (轉化酶修飾膠體金)溶液中，置于恒溫振蕩器上震蕩4?32h。然后以8000?14000轉速下離心，將沉淀加ImLTris-HCl溶液分散,得鏈霉親和素修飾轉化酶膠體金(streptavidin-轉化酶-AuNPs)；
[0009](3)取streptavidin-轉化酶-AuNPs溶液加到肽修飾膠體金_96孔板中反應,之后用Tris-HCl溶液沖洗各孔，從而得基質金屬蛋白酶-2生物傳感器；
[0010]其中:所述的膠體金修飾的96孔板按如下的方法制備而成:96孔板用無水乙醇和水依次超聲處理3次，然后在37°C下干燥。將100 μ L膠體金溶液滴涂在處理好的96孔板中，在室溫條件下使溶劑自然揮發，即得膠體金修飾96孔板(膠體金-96孔板)；
[0011]所述的轉化酶修飾膠體金按如下的方法制備而成:用NaOH溶液將膠體金溶液pH調至7.0，取0.2?2mL膠體金溶液于離心管中，然后加入500 μ L0.1?2mg/mL轉化酶溶液，4°C反應2?12h，8000?14000轉速下離心，并用PBS洗滌后分散于磷酸緩沖溶液中，即得；
[0012]所述的肽的部分序列為CGHHYYGPLGVRGC-biotin。
[0013]優選的，上述的生物傳感器的制備方法，其中所述的金納米粒子按如下方法制備而成:在圓底燒瓶中加入100mL、0.01 %的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰，然后快速加入1.8mL、I %的Na3C6H5O7,再加熱、攪拌10分鐘，冷卻至室溫，即得。
[0014]一種利用上述方法制備的生物傳感器檢測基質金屬蛋白酶-2含量的方法，使用不同濃度的基質金屬蛋白酶-2加入基質金屬蛋白酶-2生物傳感器中，然后取出上清液于
0.5mL小離心管中，準確加入100μ L、0.5mM蔗糖溶液，37°C下反應30?180分鐘，用血糖儀檢測生成葡萄糖含量，以血糖儀讀數(Glucosemeters signal (mg/dL))為分析信號,進行基質金屬蛋白酶-2的測定。
[0015]由于上述方法制備的生物傳感器可以檢測基質金屬蛋白酶_2，因此，本發明提供了上述的生物傳感器在檢測基質金屬蛋白酶-2含量中的應用。
[0016]與現有技術相比，本發明涉及的生物傳感器具有如下優點和顯著地進步:金納米粒子提供相對大的比表面積用于負載轉化酶，使得本發明設計的生物傳感器具有高靈敏度。另外，根據實驗血糖儀讀數(圖6)可以看出，當本發明的生物傳感器用于檢測MMP-1，MMP-2, BSA和IgG時，其血糖儀讀數遠遠低于檢測基質金屬蛋白酶-2的血糖儀讀數，這說明該生物傳感器具有很高的選擇性來檢測基質金屬蛋白酶_2。以膠體金修飾的96孔板為基質，通過肽鏈上的巰基和膠體金易于固定肽鏈，操作簡單。其次，以血糖儀為檢測儀器，操作簡單、能夠及時快速的提供定量的結果，檢測儀器體積小、價格便宜，可便攜。再者，以市場上價格便宜的96孔板為載體可以節約測定成本。因此，本發明涉及的生物傳感器在構建檢測蛋白質的研究方法中體現出良好的發展前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1檢測基質金屬蛋白酶-2的原理圖。[0018]圖2為肽切割溶液酸度對血糖儀讀數的影響。
[0019]圖3為切割時間對血糖儀讀數的影響。
[0020]圖4為探針的用量對血糖儀讀數的影響。
[0021 ] 圖5為MMP-2標準曲線。橫坐標為MMP-2濃度(C_p_2 (pg/mL))。
[0022]圖6方法選擇性圖。本發明的生物傳感器檢測不同物質(Sample)MMP-7，MMP-1,BSA, IgG和MMP-2的血糖儀讀數。
【具體實施方式】
[0023]以下是本發明涉及的具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的描述，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。
[0024]本發明涉及的一種檢測基質金屬蛋白酶-2生物傳感器，先在96孔板上修飾膠體金，利用金-硫鍵的結合把一端含巰基一端含生物素的肽連接到膠體金-96孔板上。再制備出鏈霉親和素-蔗糖轉化酶-膠體金探針(str印tavidin-轉化酶-AuNPs)。通過生物素和親和素的特異性結合，從而得到streptavidin-轉化酶-AuNPs-肽修飾的96孔板(基質金屬蛋白酶-2生物傳感器)。MMP-2可以把含特異性序列PLGVR的肽切割成兩部分，streptavidin-轉化酶-AuNPs在上清液中，吸出上清液加入鹿糖溶液，根據血糖儀讀數，從而實現MMP-2濃度的測定。
[0025]本發明是通過以下措施來實現的:一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0026](I)利用膠體金溶液滴涂在處理好的96孔板中，得膠體金修飾96孔板；
[0027](2)將肽溶液加到膠體金修飾96孔板中，得肽修飾膠體金-96孔板；
[0028](3)利用NaOH溶液調節膠體金溶液pH，與轉化酶溶液反應，得轉化酶修飾膠體金;
[0029](4)利用鏈霉親和素溶液和轉化酶-AuNPs溶液，制備鏈霉親和素修飾轉化酶膠體金(streptavidin-轉化酶-AuNPs)；
[0030](5)構建基質金屬蛋白酶-2生物傳感器:
[0031]所述基質金屬蛋白酶-2生物傳感器的制備包括如下步驟:
[0032](1)96孔板用無水乙醇和水依次超聲處理3次，每次超聲時間約15分鐘，然后在37°C下干燥。將100 μ L直徑為20±3nm膠體金溶液滴涂在處理好的96孔板中，在室溫條件下使溶劑自然揮發，得膠體金修飾96孔板(膠體金-96孔板)。
[0033](2)將100 μ LlO μ M肽溶液加到膠體金修飾的96孔板中，37 °C反應48h，用pH8.0Tris-HCl溶液洗滌各孔三次，得肽修飾膠體金_96孔板。
[0034](3)為了制備轉化酶修飾膠體金，用NaOH溶液將膠體金溶液pH調至7.0。取ImL膠體金溶液于離心管中，然后加入500 μ Llmg/mL轉化酶溶液，4°C反應6h，得轉化酶修飾膠體金(轉化酶-AuNPs)，4°C儲存備用。
[0035](4)加10 μ Llmg/mL鏈霉親和素溶液于轉化酶-AuNPs溶液中，置于恒溫振蕩器上震蕩16h。然后以12000r/min的轉速離心30min，將沉淀加ImL pH8.0Tris-HCl溶液分散，得探針，即鏈霉親和素修飾轉化酶膠體金(streptavidin-轉化酶-AuNPs)，4°C儲存備用。[0036](5)將100 μ L streptavidin-轉化酶-AuNPs溶液加到肽修飾膠體金-96孔板中反應2h。用50 μ L pH8.0TriS-HCl溶液洗滌各孔三次，得基質金屬蛋白酶_2生物傳感器。
[0037]—種利用上述方法制備的生物傳感器檢測基質金屬蛋白酶-2含量的方法，使用100 μ L不同濃度的基質金屬蛋白酶-2加入基質金屬蛋白酶-2生物傳感器中，然后取出上清液于1.5mL小離心管中，準確加入100μ L、0.5mM蔗糖溶液，37°C下反應30?180分鐘，用血糖儀檢測生成葡萄糖含量，以血糖儀讀數為分析信號，進行基質金屬蛋白酶-2的測定。
[0038]本發明檢測條件，具體特征如下:
[0039](I)酸度的影響由于MMP-2是一種蛋白酶，因此肽切割反應溶液酸度的控制對于分析檢測的靈敏度起著重要的作用。考察了 PH在6.3?8.5范圍內溶液酸度對檢測MMP-2的影響。隨著PH的增加，血糖儀讀數有所增大，隨后又有所下降，當pH為7.4時達到最佳(圖2)。故選擇pH7.4為最佳條件。
[0040](2)切割時間對信號強度的影響實驗表明，MMP-2加入傳感器中進行肽切割時間(Cleavage time (min))對血糖儀讀數有很大的影響。如圖3所示,在5?15min范圍內，血糖儀讀數很小，20min后血糖儀讀數迅速增加,直到35min時達到最大值,大于35min之后變化不大(圖3)。因此實驗確定切割時間最佳時間為35min。
[0041](3)探針的用量對血糖儀讀數的影響為了獲得高靈敏度，我們考察了探針用量(Dose of NDA2-1nvertase-AuNPs ( μ L))對血糖儀讀數的影響。固定 ΜΜΡ-2 濃度為 7.0pg/mL,當探針用量從50到200 μ L變化時，血糖儀讀數逐漸變大，隨后再增大探針用量，血糖儀讀數基本不變(圖4)，故分析測定過程中，探針用量選擇為200 μ L。
[0042]3.4分析參數及工作曲線
[0043]當基質金屬蛋白酶-2存在，發生水解作用將肽鏈切斷，隨著ΜΜΡ-2濃度的增加，血糖儀讀數增大。依本實驗方法，根據ΜΜΡ-2濃度和血糖儀讀數，繪制標準工作曲線，如圖5所示。ΜΜΡ-2在0.8?540pg/mL范圍內與血糖儀讀數呈線性關系，線性回歸方程為y=-0.003x2+2.542x+2.968 (y，血糖儀讀數；x，MMP-2 濃度，單位為 pg/mL)。檢出限為 0.2pg/mL。
[0044]實施例:
[0045]1.實驗部分
[0046]1.1儀器與試劑
[0047]Z-82A氣浴恒溫振蕩器(全壇市醫療儀器廠);Anke-TGL-16C飛翁牌高速離心機(上海市安亭科學儀器廠)；透明96孔聚苯乙烯微孔板(96孔板)(Corning公司)、怡成血糖儀(北京怡成生物電子技術有限公司)。
[0048]三(2-羧乙基)膦(TCEP)購于天津市廣成化學試劑有限公司；氯金酸(HAuC14)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)購于國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖、檸檬酸鈉購于天津市紅巖化學試劑廠；基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)購自吉泰生物科技有限公司；蔗糖轉化酶(簡稱轉化酶)購于Sigma ;肽:CGHHYYGPLGVRGC-b it ion由上海楚肽生物科技有限公司合成。
[0049]Tris-HCl溶液pH為8.0的配置方法:稱量12L Ig Tris置于2L燒杯中，加入約SOOmL的去離子水，充分攪拌溶解，加入濃鹽酸調節所需要的pH為8.0，即得。
[0050]1.2實驗步驟[0051 ] 1.2.1膠體金修飾96孔板制備
[0052]96孔板用無水乙醇和水依次超聲處理3次，每次超聲時間約15分鐘，然后在37°C下干燥。將100 μ L直徑為20±3nm膠體金溶液滴涂在處理好的96孔板中，在室溫條件下使溶劑自然揮發，得膠體金修飾96孔板(膠體金-96孔板)。
[0053]1.2.2肽修飾膠體金-96孔板制備
[0054]將100 μ LlO μ M肽溶液加到膠體金修飾的96孔板中，37 °C反應48h，用pH8.0Tris-HCl溶液洗滌各孔三次，得肽修飾膠體金_96孔板。
[0055]1.2.3轉化酶修飾膠體金制備
[0056]為了制備轉化酶修飾膠體金，用NaOH溶液將膠體金溶液pH調至7.0。取ImL膠體金溶液于離心管中，然后加入500 μ Llmg/mL轉化酶溶液，4°C反應6h，得轉化酶修飾膠體金(轉化酶-AuNPs)，4°C儲存備用。
[0057]1.2.4鏈霉親和素修飾轉化酶膠體金制備
[0058]加10 μ Llmg/mL鏈霉親和素溶液于轉化酶-AuNPs溶液中，置于恒溫振蕩器上震蕩16h。然后以12000r/min的轉速離心30min，將沉淀加ImL pH8.0Tris-HCl溶液分散，得探針，即鏈霉親和素修飾轉化酶膠體金(streptavidin-轉化酶-AuNPs)，4°C儲存備用。
[0059]1.2.5基質金屬蛋白酶-2生物傳感器的制備
[0060]將100 μ L streptavidin-轉化酶-AuNPs溶液加到肽修飾膠體金-96孔板中反應2h。用50 μ L pH8.0TriS-HCl溶液洗滌各孔三次，得基質金屬蛋白酶_2生物傳感器。
[0061]1.2.6基質金屬蛋白酶-2預處理
[0062]將膠原酶潛酶激活劑加入待測的ΜΜΡ-2溶液中，使得APMA終濃度為ImM，37°C孵育Ih0
[0063]1.2.7標準曲線繪制
[0064]將100 μ L預處理后的ΜΜΡ-2 —系列一定濃度的溶液加入上述基質金屬蛋白酶_2生物傳感器中，37°C下反應0.5h。取出上清液于0.5mL小離心管中，并加入100 μ L0.5mM蔗糖溶液，37°C下反應2h，用血糖儀檢測生成葡萄糖含量，根據血糖儀讀數和基質金屬蛋白酶-2濃度關系得標準曲線。
[0065]1.2.8樣品中基質金屬蛋白酶-2含量測定
[0066]為了測定血清樣品中基質金屬蛋白酶-2含量，在200 μ L新鮮血清樣品加入膠原酶潛酶激活劑(APMA) 37°C孵育lh，然后取100 μ L加入基質金屬蛋白酶-2生物傳感器中，37°C下反應0.5h。取出上清液于0.5mL小離心管中，并加入100 μ L0.5mM蔗糖溶液，37°C下反應2h，用血糖儀檢測生成葡萄糖含量，根據血糖儀讀數和標準曲線計算樣品中基質金屬蛋白酶-2含量。
[0067]1.3結果與討論
[0068]根據發明的方法對血液樣品中MMP-2含量進行了測定，并采用標準加入法對方法進行了評價，測定結果見表1，樣品測定回收率為98.9 - 102.2%，本發明的方法在MMP-2檢測中具有精密度高的特點。
[0069]我們通過MMP-2特異性切割PLGVR肽序列，用便攜式血糖儀實現MMP-2的測定。用血糖儀檢測MMP-2，發現MMP-2濃度在0.8?540pg/mL范圍內與血糖儀讀數呈線性關系，檢出限為0.2pg/mL，快速簡便，易于檢測和推廣。[0070]本發明是基于基質金屬蛋白酶-2切割肽，生物素-鏈霉親和素特異性識別和轉化酶標記納米金技術機制研制了一種高靈敏檢測基質金屬蛋白酶-2的新型生物傳感器。研制的傳感器具有如下優勢:金納米提供相對大的比表面積用于負載酶水解試劑-轉化酶；設計的生物傳感器具有高靈敏度；用血糖儀作為檢測儀器檢測MMP-2，快速簡便，易于檢測和推廣。因此，所設計的生物傳感器在構建檢測蛋白質、酶以及生物分子的研究方法中體現出良好的發展前景。
[0071]表1.樣品分析測定結果
[0072]
【權利要求】
1.一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及其應用，包括以下步驟: (1)將100μ L的0.1?10 μ M肽溶液加到膠體金修飾的96孔板中，37 °C反應12?60h，用Tris-HCl溶液沖洗各孔，得肽修飾膠體金_96孔板； (2)加10μ L的0.1?2mg/mL鏈霉親和素溶液于轉化酶-AuNPs (轉化酶修飾膠體金)溶液中，置于恒溫振蕩器上震蕩4?32h ;然后以8000?14000轉速下離心，將沉淀加ImLTris-HCl溶液分散,得鏈霉親和素修飾轉化酶膠體金(streptavidin-轉化酶-AuNPs)； (3)取streptavidin-轉化酶-AuNPs溶液加到肽修飾膠體金_96孔板中反應,之后用Tris-HCl溶液沖洗各孔，從而得基質金屬蛋白酶-2生物傳感器； 其中:所述的膠體金修飾的96孔板按如下的方法制備而成:96孔板用無水乙醇和水依次超聲處理3次，然后在37°C下干燥；將100 μ L膠體金溶液滴涂在處理好的96孔板中，在室溫條件下使溶劑自然揮發，即得膠體金修飾96孔板(膠體金-96孔板)； 所述的轉化酶修飾膠體金按如下的方法制備而成:用NaOH溶液將膠體金溶液pH調至7.0，取0.2?2mL膠體金溶液于離心管中，然后加入500 μ L0.1?2mg/mL轉化酶溶液，4°C反應2?12h，8000?14000轉速下離心，并用PBS洗滌后分散于磷酸緩沖溶液中，即得。
2.根據權利要求1的一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及其應用，其特征在于所述的肽的部分如下: 所述的肽的部分序列為CGHHYYGPLGVRGC-biotin。
3.根據權利要求1的一種檢測基質金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及其應用，其中所述的金納米粒子按如下方法制備而成:在圓底燒瓶中加入100mL、0.01%的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰，然后快速加入1.8mL、I %的Na3C6H5O7,再加熱、攪拌10分鐘，冷卻至室溫，即得。
4.根據權利要求1的一種利用上述方法制備的生物傳感器檢測基質金屬蛋白酶-2含量的方法，使用不同濃度的基質金屬蛋白酶-2加入基質金屬蛋白酶-2生物傳感器中，然后取出上清液于0.5mL小離心管中，準確加入100 μ L的0.5mM蔗糖溶液，37°C下反應30?180分鐘，用血糖儀檢測生成葡萄糖含量，以血糖儀讀數為分析信號，進行基質金屬蛋白酶-2的測定。
5.根據權利要求1所述的生物傳感器在檢測基質金屬蛋白酶-2含量中的應用。
6.根據權利要求1所述的Tris-HCl溶液的配制方法為:稱量121.1g Tris置于2L燒杯中，加入約SOOmL的去離子水，充分攪拌溶解，加入濃鹽酸調節所需要的pH為8.0,即得。
【文檔編號】G01N33/68GK104007268SQ201410248075
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】混旭, 柏莉, 徐亞瓊 申請人:青島科技大學