一種cd7納米抗體、其編碼序列及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種人CD7納米抗體的VHH鏈，包括框架區FR和互補決定區CDR，框架區FR選自的FR1～FR4的氨基酸序列，互補決定區CDR選自的CDR1～CDR3的氨基酸序列，本發明還公開了一種人CD7納米抗體，還公開了一種DNA分子，它編碼本發明所述的人CD7納米抗體的VHH鏈，或人CD7納米抗體，還公開了一種宿主細胞，它能表達針對人CD7的納米抗體，還公開了該抗體用于檢測人CD7分子、流式檢測和細胞免疫熒光實驗的用途。通過本發明所公布的納米抗體基因序列和宿主細胞，該納米抗體能夠在大腸桿菌內高效表達，應用于CD7分子檢測試劑的研發。
【專利說明】一種CD7納米抗體、其編碼序列及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學或生物制藥【技術領域】，涉及一種針對于人CD7分子的納米抗體、其編碼序列及應用。
【背景技術】
[0002]1993年，Hamers-Casterman和他的同事在駱5它科動物體內發現了一種特殊類型的抗體，即天然缺失輕鏈的重鏈抗體(Heavy chain antibodies, HCAbs),克隆其可變區得到只由一個重鏈可變區組成的單域抗體(single domain antibody, sdAb),其晶體結構呈橢圓形，直徑2.5nm,高度4nm,所以又被稱為納米抗體(Nanobodies, Nb ;15kDa),它是現階段最小的功能性抗原結合片段。納米抗體和常規抗體相比具有許多獨特的性質:I)納米抗體編碼的序列與人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性弱；2)納米抗體分子量小，僅15kDa左右，結構簡單，很容易在微生物中大量表達，易于純化；3)納米抗體可以識別大量的抗原表位，包括一些藏在分子裂縫中的表位都能識別；4)由于納米抗體分子量小，使得它們易于穿透組織，到達常規抗體難以到達的部位；5)在變性或者高溫環境下納米抗體具有高可溶性和穩點性。
[0003]人CD7分子是一個分子量約40kDa細胞表面糖蛋白屬于免疫球蛋白超家族中的一員。⑶7分子主要表達在大多數的胸腺細胞表面，85%以上的外周血T淋巴細胞表面以及自然殺傷細胞表面。盡管目前的研究表明CD7分子的具體功能還不太清楚，但實驗顯示CD7缺陷的鼠T淋巴細胞對刺激反應正常以及當抗體與人T淋巴細胞上的CD7分子結合后對細胞的生長和增殖并沒有影響。同時，CD7分子的一個重要性質是當它和它的抗體結合后會快速的發生內吞作用。在這個重要性質的基礎上，已經有幾項研究通過在⑶7分子上偶聯免疫毒素來靶向遞送到人白血病以及淋巴癌細胞，從而達到治療疾病的目的以及偶聯免疫毒素來治療急性移植物抗宿主病。這些實驗都已進行臨床實驗階段。同時有研究通過在⑶7分子上偶聯蛋白來靶向遞送siRNA到T淋巴細胞內，來治療HIV感染。但是這些實驗都是在常規抗體中分離出來的單鏈抗體(scFv;30kDa)上進行的。由于單鏈抗體相對納米抗體分子量較大，導致其侵入組織和細胞中困難，而納米抗體由于分子量很小同時單鏈抗體在原核表達系統中很難可溶表達出來，而納米抗體在原核表達系統中易可溶表達且易復性。所以制備人CD7納米抗體來進行疾病治療研究可能是更加有效的且研究成本較低的備選方案之一。
[0004]目前，也沒有針對人CD7抗原表位為靶標的特異性納米抗體的研究報道。
【發明內容】
[0005]發明目的:本發明所要解決的技術問題是提供一種針對人CD7分子的納米抗體，同時提供該納米抗體的編碼序列及該納米抗體在制備檢測的應用。
[0006]技術方案:為實現上述目的，本發明的第一方面，一種人⑶7納米抗體的VHH鏈，包括框架區FR和互補決定區⑶R，所述框架區FR選自以下的FRl~FR4的氨基酸序列:[0007]SEQ ID N0.1 所示的 FRl，SEQ ID N0.2 所示的 FR2，SEQ ID N0.3 所示的 FR3，SEQ IDN0.4所示的FR4 ；
[0008]或SEQ ID N0.5 所示的 FRl，SEQIDN0.6 所示的 FR2，SEQIDN0.7 所示的 FR3，SEQ IDN0.8所示的FR4 ；
[0009]或SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列FRl，SEQ ID N0.9所示的FR2，SEQ ID N0.3所示的 FR3, SEQ ID N0.4 所示的 FR4 ；
[0010]SEQ ID N0.5 所示的 FRl，SEQ ID N0.10 所示的 FR2, SEQ ID N0.11 所示的 FR3, SEQID N0.12 所示的 FR4 ；
[0011]或SEQ ID N0.13 所示的 FRl, SEQIDN0.14 所示的 FR2, SEQIDN0.15 所示的 FR3，SEQID N0.8 所示的 FR4 ；
[0012]或SEQ ID N0.5 所示的氨基酸序列 FRl，SEQ ID N0.14 所示的 FR2，SEQ ID N0.16 所示的 FR3, SEQ ID N0.8 所示的 FR4 ；
[0013]所述的互補決定區⑶R選自以下的⑶Rl~⑶R3的氨基酸序列:
[0014]SEQ ID N0.17 所示的 CDR1，SEQ ID N0.18 所示的 CDR2, SEQ ID N0.19 所示的 CDR3 ；
[0015]或SEQ ID N0.20 所示的 CDRl，SEQ ID N0.21 所示的 CDR2，SEQ ID N0.22 所示的CDR3 ；
[0016]或SEQ ID N0.17 所示的 CDRl，SEQ ID N0.23 所示的 CDR2, SEQ ID N0.24 所示的CDR3 ；
[0017]或SEQ ID N0.25 所示的 CDRl，SEQ ID N0.26 所示的 CDR2, SEQ ID N0.27 所示的CDR3 ；
[0018]或SEQ ID N0.28 所示的 CDRl，SEQ ID N0.29 所示的 CDR2, SEQ ID N0.22 所示的CDR3 ；
[0019]或SEQ ID N0.30 所示的 CDRl，SEQ ID N0.31 所示的 CDR2，SEQ ID N0.22 所示的 CDR3。
[0020]優選地，它具有SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ IDN0.36或SEQID N0.37所示的氨基酸序列。
[0021]本發明第二方面，一種人CD7納米抗體，它是針對人CD7分子表位的的納米抗體，包括具有 SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ ID N0.36 或 SEQ IDN0.37所示的氨基酸序列的VHH鏈。
[0022]本發明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質:權利要求1或2所示的人CD7納米抗體的VHH鏈，或權利要求3所示的人CD7納米抗體。
[0023]優選地，所述的DNA分子，它具有選自下組的DNA序列:SEQ ID N0.38、SEQ IDN0.39、SEQ ID N0.40、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42 或 SEQ ID N0.43。
[0024]本發明的第四方面，提供了一種表達載體，其特征在于，它含SEQ ID N0.38、SEQID N0.39、SEQ ID N0.40、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42 或 SEQ ID N0.43 所示的核苷酸序列。
[0025]本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，其特征在于，它表達針對人⑶7的納米抗體。
[0026]本發明的第六方面，提供了本發明所述的人CD7納米抗體用于檢測人CD7分子的用途。
[0027]本發明的第七方面，提供了本發明所述的人CD7納米抗體用于流式檢測和細胞免疫熒光實驗的用途。
[0028]有益效果:
[0029](I)本發明首先用流式檢測方法，選擇高表達人CD7分子的癌細胞系，經處理后使其具有免疫原性，然后用該細胞系免疫駱駝，取駱駝外周血提取淋巴細胞制備納米抗體免疫基因庫，最后在人腎上皮細胞系(293T cell line)上進行篩選⑶7納米抗體，從而獲得了人⑶7特異性的納米抗體基因。將此基因克隆至原核表達載體并轉化到大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0030](2)本發明使用高表達目的抗原的細胞免疫駱駝，獲得的免疫庫比較豐富，除了可以篩選目的抗原抗體，同時在所免疫細胞上的其它高表達分子同樣可以拿來被篩選，比用多肽或者蛋白作為抗原一次免疫只能產生一種類型的針對所選抗原的抗體更能夠節約成本、時間以及人力；
[0031](3)本發明使用細胞來對制備的納米抗體庫進行淘篩人CD7分子納米抗體，能夠獲得特異性識別天然活性的人CD7分子，這種特異性的納米抗體可以被拿來用于流式檢測和細胞免疫熒光實驗。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1是第一輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，切膠回收650~750bp片段；
[0033]圖2是第二輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，切膠回收500bp左右的片段； [0034]圖3是SpeI和SacI雙酶切噬菌體載體pComb3XSS瓊脂糖凝膠電泳圖，切膠回收3200bp左右的載體片段；
[0035]圖4是隨機的選取24個克隆做菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0036]圖5是用噬菌體的酶聯免疫方法(ELISA)在細胞上篩選特異性單個陽性克隆結果;
[0037]圖6是納米抗體經過原核表達用鎳柱離子親和層析進行純化，對純化收集的4管納米抗體進行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色圖；
[0038]圖7是用商業化⑶7抗體和所獲高純度納米抗體同時對⑶7陽性細胞Jurkat染色，然后用流式細胞儀檢測分析后所得結果；
[0039]圖8是用商業化⑶7抗體和所獲高純度納米抗體同時對⑶7陰性細胞RPMI8226染色，然后用流式細胞儀檢測分析后所得結果；
[0040]圖9是轉染表達⑶7質粒pcDNA3.1-⑶7到⑶7陰性細胞系H460中，然后用商業化CD7抗體染色，流式細胞儀檢測分析后所得結果；
[0041]圖10是用所獲高純度納米抗體去染同一批轉染⑶7的H460細胞，用于細胞免疫熒光分析圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結合附圖對本發明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護范圍。
[0043]本發明首先用⑶7高表達細胞系Jurkat cells (5X IO6)免疫一只新疆雙峰駝，經過連續7次免疫之后提取該雙峰駝外周血淋巴細胞并構建了 CD7特異的單域重鏈抗體文庫。然后在293T-CD7 — (293T原始不表達CD7)和293T-CD7+(293T_CD7穩轉細胞株)細胞系上進行淘篩CD7特異性的納米抗體，從而最終獲得了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體菌株。
[0044]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0045]實施例1:針對于人⑶7的納米抗體文庫的構建:
[0046](I)用⑶7高表達細胞系免疫駱駝:5X IO6個⑶7高表達Jurkat細胞系(購自ATCC公司)免疫一只新疆雙峰駝(大眾養殖集團公司)，每周一次，共連續免疫7次，免疫過程中刺激B細胞表達抗原特異性的納米抗體；(2)7次免疫結束后，提取駱駝外周血淋巴細胞 50ml 并提取總 RNA(Trizol 法)；(3)按照 Thermo Scientfic K1621\K1622 試劑盒說明書，將提取的RNA反轉錄成cDNA，然后利用PCR方法擴增VHH鏈，第一輪PCR:
[0047]上游引物:GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG
[0048]下游引物:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTC [0049]擴增重鏈抗體引導肽和抗體CH2之間的片段，55°C退火，32個循環；瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收大小在650bp~750bp的DNA片段，如圖1所示。
[0050]第二輪PCR:
[0051]以第一輪PCR回收產物作為模板，
[0052]上游引物:CGAGCTCATGGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG
[0053]下游引物:GGACTAGTGATGGAGACGGTGACCTGGGT
[0054]擴增重鏈抗體FRl區和FR4區，61°C退火，35個循環，回收大小在500bp左右的目的片段，結果如圖2所示；(4)使用限制性的內切酶(購自NEB公司)Spe I及Sac I酶切10 μ g pComb3XS即遼菌體展示載體(購自Creative Biogene)如圖3所示，以及雙酶切10 μ gVHH,并用T4DNA連接酶(購自NEB公司)連接兩個酶切片段；(5)將連接產物純化后電轉化至電轉感受態細胞XLl-Blue(購自2ndLab?)中，構建⑶7的納米抗體噬菌體展示文庫并測定庫容，庫容的大小約為7.3X107 ;與此同時，通過菌落PCR檢測所建文庫的插入率檢測結果，圖4顯示菌落PCR結果，隨機的選取24顆克隆做菌落PCR，結果顯示插入率達到96%。
[0055]實施例2:針對⑶7的納米抗體篩選過程:
[0056](I)向293T細胞中加入3%BSA\PBS，室溫孵育30min，去除3% BSA\PBS，并用PBS洗兩遍后，立即加入新鮮制備的噬菌體納米抗體懸液，37°C培養lh，并同時微搖培養皿；
(2)向293T-CD7+細胞中加3%BSA\PBS，室溫孵育30min ;去除3% BSA\PBS，并用PBS洗兩遍后，立即加入從(I)中吸取的上清懸液，37°C孵育lh，并同時微搖培養皿；(3)去上清，洗下細胞，并用PBS\TWeen-20洗細胞3遍，然后加入甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液(pH2.2)，37°C孵育30min，按比例加入Tris\HCl緩沖液(pH7.4)，中和pH值，離心，去細胞，上清中含有噬菌體懸液；(4)上一步中的噬菌體懸液進一步感染對數生長期的XLl-Blue大腸桿菌，產生并純化噬菌體進行下一輪細胞篩選，反復進行3輪，噬菌體逐步得到淘篩。
[0057]實施例3:用噬菌體的酶聯免疫方法(ELISA)篩選特異性單個陽性克隆(全細胞ELISA 法):
[0058]1.在微量滴定板中表達噬菌體抗體
[0059](I)用無菌牙簽挑取32個單個克隆，分別置于每孔含100μ 12XTY/amp/glu的96孔微量滴定板板孔中，振蕩(300r/min)培養過夜，放在微量滴定板架上；(2)每孔加入50 μ 12XTY/amp/glu/gly并儲存于_70°C ； (3)使用96孔無菌轉移設備或移液器，從主板每孔中吸取2 μ 1，接種到一塊每孔含150μ 12XTY/amp/glu的96孔板中，37°C振蕩，直到A600值接近0.5 (2.5小時)；(4)每孔加入50 μ I含2X109pfu/ml輔助噬菌體(在儲存料中稀釋)的2XTY/amp/glu，噬菌體與細菌的比例接近20:1，37°C下孵育孔板30分鐘；(5)以2700r/min離心孔板10分鐘，用多道移液器或吸取設備移除上清液；(6)用150 μ 12 X TY/amp/kan重懸每孔的細菌沉淀,讓曬菌體納米抗體表達,37°C振蕩(300r/min)培養孔板過夜；(7)次日，以2700r/min離心孔板10分鐘；每孔取50 μ I上清液用來進行噬菌體ELISA。
[0060]2.全細胞 ELISA
[0061](I)在96孔板中分別加入293T-CD7+細胞(5 X IO5個)和293T-CD7—細胞(5 X IO5個)，每個克隆各取出50 μ I噬菌體懸液加入到96孔板中，并對應編號；室溫孵育lh，離心96孔板，去除上清液，每孔細胞用PBS洗兩遍；(2)向每孔中加入HRP標記的抗HA-Tag抗體，室溫孵育lh，離心去除上清液，PBS洗細胞3遍，去盡上清，用TMB顯色法進行顯色；(3)用酶標儀在450nm處讀板，并保存數據；(5)處理數據，分析實驗結果；(6)當樣品孔OD值大于對照孔OD值2.5倍以上時，判為陽性克隆孔，結果如圖5所示；(7)將對應的陽性克隆孔的菌轉搖在含有3毫升的LB液體中以便提取質粒并進行測序分析。
[0062]根據序列比對軟件DNAMAN分析各個克隆株的基因序列，把⑶Rl，⑶R2，⑶R3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，最終共有6株不同的抗體。
[0063]實施例4:納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化
[0064](I)將前面測序分析所獲得6種納米抗體亞克隆至表達載體PET27b(+)中，并將測序鑒定正確的重組質粒轉化到表達型宿主菌BL (DE3)中，將其涂布在含有50 μ g\ml卡那霉素的LB固體培養基平板上，37°C過夜；(2)挑選單個菌落接種在3毫升含有卡那霉素的LB培養液中，37 °C搖床培養過夜；(3)接種Iml的過夜菌種至250mlLB培養基中，37 °C搖床培養，培養到OD值達到0.6~I時，加入IPTG，37°C搖床培養過夜；(4)第二天，離心收菌；(5)將菌體破碎以獲得抗體粗提液；(6)經鎳柱離子親和層析純化抗體蛋白，獲得高純度的納米抗體，如圖6所示，為其中一種納米抗體純化后收集的連續4管納米抗體，經過SDS-PAGE后，考馬斯亮藍染色圖。
[0065]實施例5:用流式細胞儀檢測所獲得的納米抗體活性
[0066]用高純度的納米抗體在CD7陽性的細胞系Jurkat細胞上進行流式細胞分析，并用商業化⑶7抗體做對比。實驗步驟如下:常溫孵育I小時后用PBS洗3遍，加入抗HA-tag抗體(兔抗)常溫孵育I小時，PBS洗3遍,加入抗兔Alexa Fluor? 488突光標記抗體常溫孵育I小時后，用PBS洗3遍，最后用流式細胞儀檢測，結果如圖7表示，表明所獲的納米抗體結合陽性細胞比例和商業化抗體相似。用高純度的納米抗體在CD7陰性的細胞系RPMI8226細胞上進行流式細胞分析，檢測特異性。實驗步驟同上，結果如圖8所示，表明所獲的納米抗體特異性較好。
[0067]實施例6:用細胞 免疫熒光法檢測所獲得的納米抗體活性
[0068]用lipofectamine2000轉染試劑轉染pcDNA3.1-CD7質粒到CD7陰性細胞系H460細胞，48小時候后用胰酶消化H460細胞后，一半繼續培養24小時后用于流式檢測(商業抗體)檢驗轉染效果，另一半細胞用于細胞爬片，24小時后進行細胞免疫熒光檢測。流式細胞檢測方法步驟如下:取出轉染的H460細胞，PBS洗3遍，加入商業化⑶7流式抗體，常溫孵育I小時后PBS洗3遍，進行流式細胞儀檢測，檢測結果如圖9所示，轉染效率在18%左右。細胞免疫熒光檢測步驟如下:把載玻片取出，用PBS洗2遍后用4%多聚甲醛固定15分鐘，然后用3% BSA封閉I小時，最后加抗體染色，方法同實施例5，最后用共聚焦熒光顯微鏡拍攝，結果如圖10所示，表明同商業化抗體染色比例相似，以及特異性較好。
[0069]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變形，這些改進和變形也應視為本發明的保護 范圍。
【權利要求】
1.一種人⑶7納米抗體的VHH鏈，包括框架區FR和互補決定區⑶R，其特征在于，所述框架區FR選自以下的FRl~FR4的氨基酸序列:
SEQIDN0.1 所示的 FR1，SEQIDN0.2 所示的 FR2，SEQIDN0.3 所示的 FR3，SEQIDN0.4 所示的 FR4 ；
或 SEQIDN0.5 所示的 FRl，SEQIDN0.6 所示的 FR2，SEQIDN0.7 所示的 FR3，SEQIDN0.8 所示的FR4 ；
或SEQIDN0.1所示的氨基酸序列FRl，SEQIDN0.9所示的FR2，SEQIDN0.3所示的FR3，SEQIDN0.4 所示的 FR4 ；
SEQIDN0.5 所示的 FRl，SEQIDN0.10 所示的 FR2, SEQIDN0.11 所示的 FR3, SEQIDN0.12所示的FR4 ；
或 SEQIDN0.13 所示的 FRl ,SEQIDN0.14 所示的 FR2，SEQIDN0.15 所示的 FR3，SEQIDN0.8所示的FR4 ； 或SEQIDN0.5所示的氨基酸序列FRl ,SEQIDN0.14所示的FR2，SEQIDN0.16所示的FR3，SEQIDN0.8 所示的 FR4 ； 所述的互補決定區⑶R選自以下的⑶Rl~⑶R3的氨基酸序列:
SEQIDN0.17 所示的 CDRl，SEQIDN0.18 所示的 CDR2, SEQIDN0.19 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.20 所示的 CDRl，SEQIDN0.21 所示的 CDR2, SEQIDN0.22 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.17 所示的 CDRl，SEQIDN0.23 所示的 CDR2, SEQIDN0.24 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.25 所示的 CDRl，SEQIDN0.26 所示的 CDR2, SEQIDN0.27 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.28 所示的 CDRl，SEQIDN0.29 所示的 CDR2, SEQIDN0.22 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.30 所示的 CDRl，SEQIDN0.31 所示的 CDR2, SEQIDN0.22 所示的 CDR3。
2.根據權利要求1所述的人CD7納米抗體的VHH鏈，其特征在于，它具有SEQIDN0.32、SEQIDN0.33、SEQIDN0.34、SEQIDN0.35、SEQIDN0.36 或 SEQIDN0.37 所示的氨基酸序列。
3.—種人CD7納米抗體，其特怔在于，它是針對人CD7分子表位的的納米抗體，包括具有 SEQIDN0.32、SEQIDN0.33、SEQIDN0.34、SEQIDN0.35、 SEQIDN0.36或SEQIDN0.37所示的氨基酸序列的VHH鏈。
4.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質:權利要求1或2所示的人CD7納米抗體的VHH鏈,或權利要求3所示的人CD7納米抗體。
5.根據權利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:SEQIDN0.38、SEQIDN0.39、SEQIDN0.40、SEQIDN0.41、SEQIDN0.42 或 SEQIDN0.43。
6.— 種表達載體，其特征在于，它含 SEQIDN0.38、SEQIDN0.39、SEQIDN0.40、SEQIDN0.41、SEQIDN0.42 或 SEQIDN0.43 所示的核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它表達針對人CD7的納米抗體。
8.權利要求3所述的人CD7納米抗體用于檢測人CD7分子的用途。
9.權利要求3所述的人CD7納米抗體用于流式檢測和細胞免疫熒光實驗的用途。
【文檔編號】G01N33/68GK104004095SQ201410244584
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月4日 優先權日:2014年6月4日
【發明者】湯金樂, 楊林 申請人:博生吉醫藥科技(蘇州)有限公司