一種生物巰化物的檢測方法
【專利摘要】本發明屬于生物檢測領域,涉及一種生物巰化物的檢測方法。主要是利用在酸性條件下生物巰化物及顯色劑3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺競爭與銀離子結合,從而抑制銀離子引發的顯色劑藍色顯色復合物的生成,在波長范圍340nm-780nm進行比色測定,用656nm處的吸收峰進行生物巰化物的檢測。該方法在實現生物樣本中生物巰化物快速測定的同時,兼具操作簡單、成本低廉等優點,適用于血清、細胞裂解液等生物樣本中生物巰化物的測定。
【專利說明】一種生物巰化物的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域,涉及一種用于檢測樣品中生物巰化物的方法。
【背景技術】
[0002] 生物巰化物,包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等等,在生物體內各生化過 程起著至關重要的作用。它在體內的含量對維持生物機體內氧化還原環境平衡等方面發揮 著重要作用。近年來若干研宄表明,生物機體內生物巰化物濃度的變化常與各類疾病息息 相關,當其在生物體內表達過低時,常會引起生長趨緩、肝臟損傷等,而當其在機體內呈現 高表達時又會引起阿爾茲海默病、帕金森綜合癥及心血管疾病的發生。因而,生物機體內生 物巰化物的檢測可以為這些疾病的臨床診斷和治療提供許多重要的信息。
[0003] 現今檢測生物巰化物的技術主要包括高效液相色譜法、毛細管電泳法、熒光光譜 測定法等等。這些方法在檢測靈敏度、選擇性、檢測時間和穩定性方面各有優勢,但同時也 存在操作繁瑣、儀器設備昂貴等不足之處。因此,發明一種簡單、直觀、可行的生物巰化物檢 測方法顯得非常迫切。
[0004] 比色法是通過比較或測量有色物質溶液的顏色深淺度來確定待測組分含量的方 法,常用的比色法有兩種:目視比色法和光電比色法,兩種方法都是以朗伯-比爾定律為基 礎。目視比色法,只需用眼睛觀察就可得到直觀的實驗現象,光學比色法只需要使用紫外分 光光度計就可以得到靈敏的實驗結果,所需實驗設備簡單、操作簡便。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了建立一種生物巰化物的簡便檢測方法。該方法通過檢測體系 中一種常見顯色劑3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺所形成的藍色顯色復合物的生成量,即可實 現生物樣本中生物巰化物的間接檢測。
[0006] -種生物巰化物的檢測方法,利用生物巰化物和銀離子的強親和力,在酸性條件 下競爭原本可以使得顯色劑3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺溶液顯色的銀離子,從而抑制顯色 劑藍色復合物的生成,在波長656nm比色測定,通過制定的標準曲線,最終換算成生物巰化 物的濃度。
[0007] 所述的生物巰化物與顯色劑3,3',5,5' -四甲基聯苯胺之間對銀離子的競爭,顯 色劑3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺與銀離子的終濃度分別是ImM及100μM。
[0008] 本發明生物巰化物的檢測方法,于室溫(約25°C)、pH4. 0條件下,加入生物巰化 物樣品反應1小時,在波長340nm-780nm進行比色測定,利用656nm的吸收峰進行定量。
[0009] 本發明生物巰化物的檢測方法中,采用了一種常見的生物巰化物樣品半胱氨酸 (分析純)為標準樣品,測定標準曲線,然后再根據樣品比色值結果測算實際生物巰化物的 含量。
[0010] 本發明的有益效果在于,建立了一個可用實際樣本生物巰化物的檢測方法,通過 溶液顏色的變化實現生物樣本中生物巰化物的快速檢測的同時,兼具操作簡單、成本低廉 等優點,適用于血清、細胞裂解液等生物樣本中生物巰化物的測定,在實際生產生活中有一 定的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為100μΜ半胱氨酸及對照實驗的紫外可見吸收光譜圖。體系中包括lmM3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺、100μM銀離子及(a)對照組,水;(b)對照組,半胱氨酸的巰基阻 斷劑N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM) ; (c)實驗組,100μM半胱氨酸;(d)對照組,100μM半 胱氨酸及巰基的阻斷劑ΝΕΜ。
[0012] 圖2為檢測不同濃度半胱氨酸(從a到j分別為0. 5μΜ、1μΜ、10μΜ、25μΜ、 50μΜ、75μΜ、100μΜ、200μΜ、500μΜ、1000μΜ)時得到的紫外可見吸收光譜圖。
[0013] 圖3為紫外吸收峰值(Abs656nm-753nm)與半胱氨酸濃度的關系圖,插入圖為半胱 氨酸濃度在〇. 5μΜ-50μM范圍內,紫外吸收峰值(Abs656nm-753nm)與半胱氨酸濃度的線 性關系圖,插入圖為半胱氨酸的標準曲線。
[0014] 圖4為檢測特異圖,體系中含有20種不同氨基酸(從左到右分別為丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸)對應的紫外 可見吸收光譜吸收峰值(Abs656nm_753nm)柱狀圖。
[0015]
【具體實施方式】
[0016] 實施例一:實驗原理驗證
[0017] 稱取TMB粉末,用無水乙醇于37度水浴溶解至濃度為10mM。稱取AgNO3粉末、半胱 氨酸粉末、巰基阻斷劑NEM,用雙蒸水分別溶解至濃度為ImM、10mM、10mM。配制IM醋酸-醋 酸鈉緩沖液,pH值4. 0。分別進行以下四組實驗:(a) 800μL雙蒸水;(b) 750μLlOmMNEM溶 液,50μL雙蒸水;(c) 20μLlOmM半胱氨酸溶液,780μL雙蒸水;(d) 20μLlOmM半胱氨酸溶 液,750μLlOmMNEM溶液,30μL雙蒸水,四個反應體系于室溫放置1小時。1小時后,再往 每組實驗體系中加入200μLlOmMTMB溶液,200μLlmMAgNO3溶液,800μLlM醋酸-醋酸 鈉緩沖液(ΡΗ4. 0)混合1小時后,肉眼觀察實驗現象并用紫外可見分光光度計進行檢測,掃 描波長從320nm-780nm。如圖1中a曲線所示,當體系中存在TMB和Ag+時,溶液的顏色會 從無色變成藍色,即在656nm處出現一個吸收峰,而當體系中存在200μM半胱氨酸時,溶液 的顏色顯示為無色(圖1,c曲線)。同時圖1中b、d曲線則表明,當體系中的巰基被阻斷 劑阻斷后,溶液顏色依然為藍色,在656nm處有一個吸收峰,這就證明了體系中溶液顏色的 變化是和疏基相關。
[0018] 實施例二:不同濃度半胱氨酸的標準曲線
[0019]體系中加入 200yLlOmMTMB溶液,200yLlmMAgN03溶液,800μLlM醋酸-醋酸 鈉緩沖液混合,再往體系中加入不同濃度的半胱氨酸(〇. 5μΜ、1μΜ、10μΜ、25μΜ、50μΜ、 75μΜ、100μΜ、200μΜ、500μΜ、1000μΜ)的待測標準溶液,室溫放置1小時后,肉眼觀察實 驗現象并用紫外可見分光光度計進行320nm-780nm的掃描。如圖2所示,隨著半胱氨酸濃 度的提高,在656nm的紫外吸收峰值逐漸減小,而當體系中半胱氨酸濃度為100μM(圖2,曲 線g)時,體系的顏色幾乎是無色,反應在紫外可見吸收光譜上就是在656nm附近的吸收光 譜幾乎是一條直線。這主要是由于隨著半胱氨酸濃度的增加,越來越多的Ag+與半胱氨酸上 的巰基結合,進而抑制了Ag+引發的顯色復合物的變色。圖3為重復多次實驗(η= 3)得 出的紫外吸收峰差值與半胱氨酸濃度作圖所得。圖3中的插入圖顯示,當半胱氨酸的濃度 在0. 5μΜ-50μM之間變化時,半胱氨酸濃度與紫外吸收峰的變化值呈現良好的線性關系, 可以作為半胱氨酸的定量檢測的依據。
[0020] 實施例三:檢測方法特異性研宄
[0021] 體系中加入 200yLlOmMTMB溶液,200yLlmMAgNCV^液,800μLlM醋酸-醋酸鈉 緩沖液混合,再往體系中加入各20種氨基酸(200μΜ),室溫放置1小時后,肉眼觀察實驗現 象并用紫外可見分光光度計進行320nm-780nm的掃描。圖4所示,在針對20種氨基酸的特 異性實驗中,只有半胱氨酸的紫外吸收峰值發生了明顯的變化,即在顏色上,只有半胱氨酸 樣品組的顏色幾乎呈現無色,其他氨基酸實驗樣本均顯示為藍色,即本方明方法只針對20 氨基酸中的半胱氨酸的檢測有效。
[0022] 實施例四:實際生物樣本中生物巰化物的檢測
[0023] 飼養奶牛,通過頸動脈取血的方式取得奶牛的新鮮血液,以3000Xg離心10分鐘 得到新鮮的牛血漿。將離心所得的牛血漿稀釋100倍后取50μL,與200μLlOmMTMB溶液, 200μLlmMAgNO3溶液,800μLlM醋酸-醋酸鈉緩沖液及蒸餾水混合至總體積2mL,混勻后 室溫放至1小時,肉眼觀察實驗現象并用紫外分光光度計進行320nm-780nm的掃描。檢測 結果經分析后,如表1所示,所測牛血漿中生物巰化物的濃度為486μM。同時為了驗證體系 的實際可操作性,我們往牛血漿中加了一定濃度的半胱氨酸(1250μΜ、2500μΜ),根據本 發明方法檢測所得到的半胱氨酸濃度與實際加入的半胱氨酸濃度相符合(表I),證明了該 體系具有實際的操作性,有較好的可信度和重復度。
[0024] 表1牛血清樣品實測結果
[0025]
【權利要求】
1. 一種生物巰化物的檢測方法,其特征是利用在酸性條件下,生物巰化物和銀離子的 強親和力,競爭原本可以使得顯色劑3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺溶液顯色的銀離子,抑制顯 色劑藍色復合物的生成,在波長656nm比色測定,通過制定的標準曲線,最終換算成生物巰 化物的濃度。
2. 根據權利要求1所述的生物巰化物的檢測方法,其特征是所述的生物巰化物與顯色 劑3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺之間與銀離子結合的競爭。
3. 根據權利要求1所述的生物巰化物的檢測方法,其特征是所述的利用生物巰化物中 的巰基與銀離子的強親和力,進行銀離子與生物巰基的共價結合。終濃度分別為100 UM及 ImM銀離子與顯色劑3, 3',5, 5' -四甲基聯苯胺溶液,于室溫(約25°C )、pH4. 0條件下,加 入生物疏化物樣品反應1小時,在波長340nm-780nm進行比色測定,利用656nm的吸收峰進 行定量。
4. 根據權利要求1所述的生物巰化物的檢測方法,其特征是采用半胱氨酸(分析純) 為標準樣品,測定標準曲線,然后再根據樣品比色值結果測算實際生物巰化物的含量。
【文檔編號】G01N21/31GK104483275SQ201410244414
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】許媛媛, 張源淑, 韓天, 李夏青 申請人:南京農業大學