用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條，所述試紙條包被有膠體金標記的奶類抗原。本發明利用膠體金標記技術，首次用膠體金標記特異性過敏原(奶類抗原)，然后將標記后的過敏原均勻噴線于醋酸纖維素膜或硝酸纖維素膜上，制成試紙條產品進行過敏原檢測，操作簡便，結果準確，成本低廉，可實現多項自由檢測。
【專利說明】用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及膠體金標記【技術領域】，具體地說，涉及一種用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002]過敏性疾病是當代社會中最常見的一種疾病，它是由廣泛存在的過敏原引起的，我國約5?10%、美國和歐洲約5?25%的人群遭受過過敏性侵擾，其中幼兒和青少年尤為明顯，危害較嚴重。過敏反應(allergy)是免疫機體再次接觸相同變應原時，發生反應過度劇烈而引起的生理功能紊亂和組織損傷的病理性免疫反應。涉及臨床各科，如內科包括支氣管哮喘、過敏性休克、血清病、結締組織病、腎小球腎炎、偏頭痛等，外科包括移植排異反應、耳鼻喉科有過敏性鼻炎、滲出性中耳炎、美尼爾病等，婦產科包括新生兒溶血癥，眼科包括過敏性結膜炎、交感性眼炎，口腔科包括復發性口瘡，皮膚科約半數以上的疾病為過敏反應病，另外還有輸血反應、藥物過敏、過敏性休克等。
[0003]2011年4月國家統計局頒布的的調查統計數據顯示，全國城市人口約5.7億，其中有1.5億城市過敏原發病人口，常年處于過敏原狀態的人群達5122萬人。據此估算，中國人口城市變態反應疾病發病率為27%，加上非城市人口，實際中國變態反應疾病發病人數約為3.6億。然而，近十年來，我國過敏原患者的診治率不到I %，近99%的過敏原患者得不到及時的診斷和治療。
[0004]據不完全統計，全國15000家縣級以上醫院中引進UniCAP的不足150家，引進率僅占1%。這一比例與其他生化檢測設備(約40?50%)的引進率相比，足以說明過敏原的體外診斷領域存在著巨大發展空間。同時，體外過敏原檢測設備和試劑主要依賴進口，這些原料均采自歐美的進口過敏原試劑，與我國患者的地域差和人種差也有待驗證。基于上述情況，開發一種符合本土化要求的過敏原檢測系統，包括我國自主創新的過敏原檢測儀和試劑在內的研發勢在必行。
[0005]過敏原檢測的方法主要分為體內診斷和體外診斷。體內診斷包括皮膚診斷(定性檢查)和激發診斷。常見的皮膚診斷包括皮內實驗、點刺實驗、劃痕實驗、斑貼實驗等。激發診斷包括結膜實驗、鼻實驗、支氣管實驗、食物實驗、藥物激發實驗、物理性激發實驗等。由于體內診斷的影響因素復雜，準確性低，結果只能進行定性，且檢查本身給患者帶來痛苦，對嚴重過敏患者甚至存在生命危險等諸多因素，限制了體內診斷的進一步發展。
[0006]體外診斷的原理是基于IgE抗體診斷，在診斷技術上包括免疫印記法、放射變應原吸附診斷(RAST)、熒光酶標法(FEIA)、酶聯免疫法(ELISA)等。
[0007]目前，國內常用的臨床檢測過敏原的方法是以皮膚針刺試驗(SPT)為主的體內試驗方法，即用稀釋過敏原液直接點刺皮膚，觀察檢測點是否出現風團或潮紅反應，進行陰性或陽性判定。SPT雖然有簡便，成本低，患者可見結果等優點。但是其結果受諸多因素影響，準確性低，檢查本身給患者尤其是小兒患者帶來痛苦，對嚴重過敏患者甚至有生命危險。國內體外診斷領域處于落后狀態，基本集中在手工操作和半定量半自動分析狀態。存在操作煩瑣、靈敏度和精密度差，測試時間長的缺點。
[0008]與體內試驗相比，只需少量血清即可篩選和確定百種過敏原，具有效能參數可靠，不受藥物影響，無全身反應危險等顯著優點。應用比較突出的是PHARDIA UNICAP系統和SIEMENS診斷系統。PHARDIA UNICAP系統自70年代問世以來，一直被作為過敏原診斷的金標準。80年代進入中國，一直處于壟斷地位。而SIEMENS診斷系統是過敏原自動化新技術的代表，是近幾年新興的過敏原診斷系統，尚未進入中國市場。
[0009]在發達國家，臨床上通行的全自動過敏原檢測是基于酶聯免疫法。常用兩種方法:酶聯免疫熒光測定法和生物素-親和素系統-酶聯免疫法。
[0010]酶聯免疫突光測定法的經典系統是Pharmacia (法瑪西亞)公司的Immuno CAP檢測系統，它采用纖維素固相載體，該固相載體經溴化氧活化后與過敏原共價結合。過敏原預先結合在固相載體上，加入血樣后37°C孵育，如患者血清中有針對該過敏原的特異性IgE，即形成抗此過敏原抗體復合物。洗脫后加入酶標記的酶標二抗，形成固相載體-過敏原-特異性IgE-酶標二抗的結合物。再次洗脫后加入底物，產生酶催化熒光產物。測定熒光值。根據熒光吸光度的大小換算成特異性IgE含量。
[0011]生物素-親和素系統-酶聯免疫法采用Fooke公司的ALLERG-0-LIQ測定系統，酶標板由抗人IgE抗體包被,可用來檢測總IgE和特異性IgE。加入血樣后孵育和洗滌，酶標板結合所有IgE，洗滌可避免其他免疫球蛋干擾(如特異性抗原)，再加入生物素標記的過敏原，然后加入結合了酶的鏈霉親和素結合物和顯色底物，通過酶與底物反應后吸光度的變化來檢測針對特異性過敏原的IgE含量。
【發明內容】
[0012]本發明的目的是提供一種用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條。
[0013]本發明的另一目的是提供所述試紙條的制備方法。
[0014]為了實現本發明目的，本發明的一種用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條，所述試紙條包被有膠體金標記的奶類抗原。
[0015]具體地，本發明所述試紙條為包被有膠體金標記的奶類抗原的硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
[0016]其中，所述試紙條的pH值為8.5-10，膠體金顆粒與奶類抗原之間的摩爾比為10-30:1。奶類的來源為牛奶、馬奶或羊奶等。奶類是重要的變應原，奶類中的酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是其中主要的致敏成分。
[0017]所述牛奶抗原的制備方法為:取IOOmL脫脂牛奶，用孔徑0.4μπι的石棉板過濾，被截留的物質即為酪蛋白，收集酪蛋白作為物質I ;將濾出的乳液，加入至盛有300mL丙酮分析純溶液的容器中，用封口膜封好容器，于2-8°C冷柜中放置24h后，取出離心，待丙酮揮發完全，所得沉淀物即為β_乳球蛋白和α-乳白蛋白的混合物，收集沉淀物作為物質II ;將物質I和II混合，于陶瓷研缽中研磨30min，然后用丙酮分析純溶液進行脫脂3_4次，離心后的物質置于通風櫥中，將殘余的丙酮揮發完全，所得物質再次研磨粉碎，即得牛奶抗原。
[0018]本發明還提供所述試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0019]I)奶類抗原溶液的制備:將待標記的奶類抗原溶解在0.9% pH7.0的NaCl溶液中，使其終濃度為50-500 μ g/ml,即得奶類抗原溶液；[0020]2)膠體金溶液的制備:用0.1M K2CO3溶液和0.1M HCl調0.01 % HAuCl4膠體金溶液的PH值至8.5-10，使膠體金的粒徑達到40-60nm，濃度達到0.5-2%,即得膠體金溶液；
[0021]3)膠體金與奶類抗原的結合:用0.1M K2CO3溶液調步驟I)的抗原溶液的pH值至8.5-10，邊攪拌邊向其中加入步驟2)的膠體金溶液，抗原溶液與膠體金溶液的體積比為1-10:100，同時加入穩定劑以防止奶類抗原與膠體金顆粒聚合沉淀，即得膠體金-奶類抗原結合物；所述穩定劑為BSA(牛血清白蛋白)和分子量20KD的聚乙二醇，二者終濃度分別為 1%和 0.1% ;
[0022]4)膠體金標記的奶類抗原的純化:將步驟3)中制備的膠體金-奶類抗原結合物經1500r/min離心20min ;收集沉淀溶于穩定劑中，使其濃度達到5-30% ;然后加至Sephacryl S-400層析柱上進行純化，將純化的膠體金標記的奶類抗原溶液過濾除菌,4°C保存；所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液；
[0023]5)試紙條的包被:將步驟4)中制備的膠體金標記的奶類抗原溶液噴線于試紙條上，干燥后即得用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條成品。
[0024]前述的制備方法，步驟4)中加樣量為S印hacryl S-400層析柱體積的1/10，以穩定劑作為洗脫液，流速為5-10ml/h ;所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二
醇溶液。
[0025]使用時，將本發明的試紙條浸入人血清中，使血清中IgE抗體與特異性過敏原結合，產生紫色條帶。根據條帶顏色的深淺對照比色卡進行分級，
[0026]本發明利用膠體金標記技術，首次用膠體金標記特異性過敏原(奶類抗原)，然后將標記后的過敏原均勻噴線于醋酸纖維素膜或硝酸纖維素膜上，制成試紙條產品進行過敏原檢測，操作簡便，結果準確，成本低廉，可實現多項自由檢測。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0028]實施例用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法
[0029]用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條的制備包括待標記抗原溶液的制備、待標膠體金溶液的制備、膠體金標記牛奶抗原、膠體金牛奶抗原的純化、膠體金蛋白顆粒的粒徑鑒定以及試紙條的包被。具體步驟如下:
[0030]1、待標記抗原溶液的制備
[0031]牛奶抗原的制備:取IOOmL脫脂牛奶，用孔徑0.4μπι的石棉板過濾，被截留的物質即為酪蛋白，收集酪蛋白作為物質I ;將濾出的乳液，加入至盛有300mL丙酮分析純溶液的容器中，用封口膜封好容器，于2-8°C冷柜中放置24h后，取出離心，待丙酮揮發完全，所得沉淀物即為β -乳球蛋白和α -乳白蛋白的混合物，收集沉淀物作為物質II ;將物質I和II混合，于陶瓷研缽中研磨30min，然后用丙酮分析純溶液進行脫脂3_4次，離心后的物質置于通風櫥中，將殘余的丙酮揮發完全，所得物質再次研磨粉碎，即得牛奶抗原。
[0032]將待標記的牛奶抗原溶解在0.9 % pH7.0的NaCl溶液中，使其終濃度為50-500 μ g/ml,即得牛奶抗原溶液。
[0033]2、待標膠體金溶液的制備[0034]用0.1M K2CO3溶液或0.1M HCl調膠體金溶液的pH值至9.0，使膠體金的粒徑達到50nm,濃度達至Ij I %。
[0035]3、膠體金標記牛奶抗原:將膠體金和抗原溶液分別用0.1M K2CO3溶液調pH至9.0，電磁攪拌抗原溶液，加入膠體金溶液，抗原溶液與膠體金溶液的體積比為1-10:100，繼續攪拌lOmin，加入穩定劑BSA和分子量20KD的聚乙二醇，得到I % BSA和0.1 %分子量20KD的聚乙二醇溶液。此過程需要調整抗原的用量，以膠體金標記抗原完成后的溶液呈葡萄酒紅色為最佳。
[0036]4、膠體金標記的牛奶抗原的純化:將步驟3中制備的膠體金-牛奶抗原結合物經1500r/min離心20min ;收集沉淀溶于穩定劑(所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液)中，使其濃度達到5-30% ;然后加至S^hacryl S-400層析柱上進行純化,將純化的膠體金標記的牛奶抗原溶液過濾除菌,4°C保存。
[0037]純化過程中，加樣量為S印hacryl S-400層析柱體積的1/10，以穩定劑(所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液)作為洗脫液，流速為5_10ml/h。
[0038]5、膠體金蛋白顆粒的粒徑鑒定
[0039]膠體金顆粒平均直徑的測量:在透射電鏡下觀察膠體金顆粒，計算100個金顆粒的平均直徑應在40~60nm范圍內。
[0040]6、試紙條的包被
[0041 ] 將陰性對照溶液(含40-70 %牛血清白蛋白的PBS溶液)，步驟4純化的抗原溶液進行均勻噴線。
[0042]在免疫層析試紙硝酸纖維素膜表面進行陰性對照和抗原溶液的噴線。用氣動噴頭進行定量操作。用三維平臺往復來回間隔噴線。最后將噴好的硝酸纖維素膜干燥并裁切成條。
[0043]7、結果判斷
[0044]根據條帶顏色的深淺對照比色卡進行分級，分級方法見表1:
[0045]表1分級標準
【權利要求】
1.一種用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條，其特征在于，所述試紙條包被有膠體金標記的奶類抗原。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條為包被有膠體金標記的奶類抗原的硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條的pH值為8.5-10，膠體金顆粒與奶類抗原之間的摩爾比為10-30:1。
4.根據權利要求1-3任一項所述的試紙條，其特征在于，奶類的來源為牛奶、馬奶或羊奶。
5.根據權利要求4所述的試紙條，其特征在于，所述奶類抗原為牛奶抗原；所述牛奶抗原的制備方法為:取IOOmL脫脂牛奶，用孔徑0.4μ m的石棉板過濾，收集被截留的物質I ;將濾出的乳液，加入至盛有300mL丙酮分析純溶液的容器中，用封口膜封好容器，于2-8°C冷柜中放置24h后，取出離心，待丙酮揮發完全，所得沉淀物作為物質II，將物質I和II混合，于陶瓷研缽中研磨30min，然后用丙酮分析純溶液進行脫脂3-4次，離心后的物質置于通風櫥中，將殘余的丙酮揮發完全，所得物質再次研磨粉碎，即得牛奶抗原。
6.權利要求1-5任一項所述試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)奶類抗原溶液的制備:將待標記的奶類抗原溶解在0.9% pH7.0的NaCl溶液中，使其終濃度為50-500 μ g/ml,即得奶類抗原溶液； 2)膠體金溶液的制備:用0.1M K2CO3溶液和0.1M HCl調0.01 % HAuCl4膠體金溶液的pH值至8.5-10，使膠體金的粒徑達到40-60nm，濃度達到0.5_2%，即得膠體金溶液； 3)膠體金與奶類抗原的結合:用0.1M K2CO3溶液調步驟I)的抗原溶液的pH值至8.5-10，邊攪拌邊向其中加入步驟2)的膠體金溶液，抗原溶液與膠體金溶液的體積比為1-10:100，同時加入穩定劑以防止奶類抗原與膠體金顆粒聚合沉淀，即得膠體金-奶類抗原結合物；所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇； 4)膠體金標記的奶類抗原的純化:將步驟3)中制備的膠體金-奶類抗原結合物經1500r/min離心20min ;收集沉淀溶于穩定劑中，使其濃度達到5-30%;然后加至SephacrylS-400層析柱上進行純化，將純化的膠體金標記的奶類抗原溶液過濾除菌，4°C保存；所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液； 5)試紙條的包被:將步驟4)中制備的膠體金標記的奶類抗原溶液噴線于試紙條上，干燥后即得用于特異性奶類過敏原IgE篩查的試紙條成品。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟4)中加樣量為SephacrylS-400層析柱體積的1/10，以穩定劑作為洗脫液，流速為5-10ml/h ;所述穩定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液。
【文檔編號】G01N33/68GK103983788SQ201410231189
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】蔣琳 申請人:中生北控生物科技股份有限公司