快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒及其使用方法

快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒及其使用方法；所述試劑盒包括：C酶瓶、T酶瓶、C底物反應杯、T底物反應杯，所述C酶瓶、T酶瓶均用酶瓶密封蓋密封，且裝有酶凍干的三酶混合劑；所述C底物反應杯、T底物反應杯均設有含有乙酰膽堿、魯米諾及二甲基聯苯胺的凍干吸水墊。本發明還涉應用前述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法。本發明利用乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶及過氧化物酶為催化體系，將氯化乙酰膽堿水解氧化后的產物與魯米諾產生化學發光效應。建立靈敏地測試農產品中有機磷農藥的方法。本發明有具檢測速度快、操作過程簡單、穩定性及重復性好、不需要昂貴儀器等優點，非常適合于在農貿市場進行有機磷農藥的現場監測。
【專利說明】快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種快速檢測食品中有機磷農藥殘留的方法，具體是涉及一種快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]農產品、食品及藥品中的農藥殘留仍是危脅人類身體健康的重要潛在因素之一。在中國的農業生產過程中，農藥年使用量上仍居世界首位，且有機磷農藥的使用量占全部農藥用量的70%以上。據近些年的資料報道，中國省級大城市的農貿市場中第一季度所銷售的蔬菜、水果有機磷農藥不合格率占到14%以上，尤其來自于大棚種植蔬菜的農藥殘留量更高。在農藥抽樣監測中發現，甲胺磷、敵百蟲、氧化樂果、敵敵畏的檢出率更高。當前檢測有機磷農藥的方法主要有:①光譜法，主要包括分光光度法、化學發光法、紅外及熒光光譜法色譜分析法，主要包括薄層色譜分析法、氣相色譜法、液相色譜法、超臨界流體色譜法及色譜/質譜聯用技術；③免疫學分析方法，主要包括酶聯免疫吸附分析法、納米金免疫試紙條法、免疫熒光分析法等；④傳感器法，主要包括壓晶生物傳感器法、光導纖維型酶傳感器、有機磷水解酶生物傳感器、膽堿酯酶傳感器及基于分子印跡技術的仿生傳感器。⑤快速檢測法，主要包括速測卡法及速測儀法。光譜法及色譜法是國家確證性地檢測農產品中有機磷農藥的標準方法，具有特異性強、靈敏度高的特點，其不足之處是需要利用較為昂貴的儀器及專門的測試人員，且操作過程相當復雜，不適合于現場大量檢測農產品中有機磷農藥殘留。免疫學檢測方法的靈敏度高及特異性較強，但只能檢測單個或數種有機磷農藥，且相應抗體的研發時間長而成本高。免疫學檢測方法的另一缺點是其重復性及穩定性較差。傳感器方法是近些年發展起來的新型檢測技術，其中有關利用膽堿酯酶的電流型及電位型傳感器方面的報道非常多。傳感技術的特點是靈敏、操作簡單，但研究成果仍在實驗室階段，仍存在著重復性及穩定性差的缺陷。現有速測卡技術是利用膽堿酯酶能夠水解乙酰膽堿的類似物2，6- 二氯靛酚乙酸酯而生成藍色的2，6- 二氯靛酚乙酸，從而根據速測卡顏色的變化來判定有機磷農藥的殘留情況。其優點是檢測速度快，操作簡單。但該方法仍是簡單的定性方法，靈敏度低，對一些種類的有機磷及氨基甲酸酯農藥的檢測限高出蔬菜、水果的國家限量標準，另外樣品中的有機色素會嚴重干擾測定而造成假陰性結果。而現有的速測儀仍是一種便攜式的分光光度計，需要配合較為復雜的檢測試劑，且在現場不易實施。
[0003]經對現有技術文獻的檢索發現，專利申請號為2005100741791.3，名稱為“化學發光有機磷農藥殘留分析儀及其檢測方法”。其關鍵技術是，在過硫酸鉀及二氧化鈦納米離子存在的條件下，利用紫外光催化作用使蔬菜或水果上的有機磷農藥轉化為無機磷酸鹽，然后與鑰酸及釩酸鹽形成磷鑰釩雜多酸，該物質氧化魯米諾后產生化學發光，并用化學發光儀進行測定。但其缺陷是反應體系易受外界磷酸鹽的干擾，而使結果出現假陰性。另外該檢測方法的缺陷是重復性、穩定性仍不夠理想，不能滿足定性及定量檢測的需要。

【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的缺陷，提供了一種快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒及其使用方法。
[0005]本發明是通過以下的技術方案實現的:
[0006]第一方面，本發明涉及一種快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒，所述試劑盒包括:C酶瓶、T酶瓶、C底物反應杯、T底物反應杯，所述C酶瓶、T酶瓶均用酶瓶密封蓋密封，且裝有酶凍干的三酶混合劑；所述C底物反應杯、T底物反應杯均設置含有氯化乙酰膽堿、魯米諾及二甲基聯苯胺的凍干吸水墊。
[0007]第二方面，本發明還涉及前述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，包括以下步驟:
[0008]第I步:酶冷凍保護劑的制備:將蔗糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、甘油加入氯化鈣溶液中，攪拌至完全溶解，冷凍保存待用；
[0009]第2步:反應酶液的配制:將所述酶冷凍保護劑分別稀釋乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶、過氧化物酶，混合，冷凍干燥后，分別裝入C酶瓶和T酶瓶中；
[0010]所述膽堿酯酶是商品化的乙酰膽堿酯酶，其來源可以是從昆蟲、動物肝臟、魚腦、植物或基因工程技術生產的乙酰膽堿酯酶，本申請優選昆蟲來源的乙酰膽堿酯酶。所述膽堿氧化酶也為商品化的膽堿氧化酶，其來源于產堿菌、土壤球形節桿菌或基因工程技術生產的膽堿氧化酶，本申請優選產堿菌來源的膽堿氧化酶。所述過氧化物酶是市售的辣根過氧化物酶。
[0011]第3步:底物反應杯的制備:將反應底物墊片放入魯米諾、氯化乙酰膽堿、二甲基聯苯胺混合溶液中，浸泡浙干，并冷凍干燥后，放入聚氯乙烯塑料反應杯，標記為C底物反應杯、T底物反應杯；
[0012]第4步:樣品的測試:分別向C、T酶瓶內滴加純凈水，搖勻后，用塑料滴管向所述T酶瓶中滴加待檢樣品溶液，向C酶瓶中滴加純凈水或磷酸鹽緩沖液，搖勻，靜置，用滴管從所述C、T酶瓶中吸取反應產物，分別滴加到C、T底物反應杯中，在2?8分鐘內于便攜式化學發光儀上測定C、T底物反應杯的發光強度，根據發光強度的相對抑制率，確定有機磷的濃度。
[0013]優選地，第I步中，酶冷凍保護劑中包括如下含量的各組分:5?15mmol/L氯化鈣溶液100毫升，蔗糖I?3克，甘氨酸I?3克，甘油5?15毫升，牛血清白蛋白I?3克。
[0014]優選地，第2步中，所述乙酰膽堿酯酶稀釋3000?8000倍，所述膽堿氧化酶稀釋200?800倍，所述過氧化物酶稀釋200?800倍。
[0015]優選地，第3步中，所述C底物反應杯、T底物反應杯的底面內徑為8?20mm，高度為10?25mm。
[0016]優選地,第3步中,所述反應底物墊片的厚度為3?6mm。
[0017]優選地，第3步中，所述魯米諾的濃度為1.0\10_4?3.0父10_411101/1、氯化乙酰膽堿的濃度為3.0X10—3?15.0X10_3mol/L、二甲基聯苯胺的濃度為2.0X10—3?
10.0X10_3mol/L。
[0018]優選地，第4步中，所述向C、T酶瓶內滴加純凈水為50?200微升，所述待檢樣品溶液為50?200微升，所述C酶瓶中純凈水為50?200微升，磷酸鹽緩沖液為0.lmol/L,且pH為7.0。[0019]優選地，第4步中，所述C、T底物反應杯中的反應產物100?300微升。
[0020]本發明具有如下的有益效果:
[0021](I)檢測靈敏度高:本發明選用了含有乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶及過氧化物酶的三酶體系，并建立了基于增敏劑及魯米諾的化學發光技術，其靈敏度高出數十倍及上千倍，且檢測線性范圍顯著增寬。本發明檢測敵敵畏及敵百蟲的最低檢測限達0.078ppm;檢測苯線磷的最低檢測限達0.035ppm ;對丁硫克百威的檢測限達0.039ppm ；
[0022](2)本發明試劑盒使用方便，操作簡單，在測試中不需要復雜的配制試劑過程，非專業人員按照試劑盒說明書便可輕易完成檢測；
[0023](3)檢測快速:本發明可在半小時內完成樣品的前處理過程及檢測過程，對蔬菜、水果樣品前處理只需要3?5分鐘，用試劑盒測試過程需要10?25分鐘。
[0024](4)可檢測的有機磷范圍廣:本發明可檢測包括涕滅威、氧化樂果、樂果、乙酰甲胺磷、西維因、敵百蟲、呋喃丹、丁硫克百威、二嗪農、敵敵畏、百治磷、硫線磷、乙基對硫磷、苯線磷、馬拉硫磷、甲胺磷、甲基對硫磷、久效磷、殺線威、亞胺硫磷、辛硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、甲基異硫磷、谷硫磷等在內的數幾十種有機磷農藥。本發明同時也可檢測出一些重金屬包括鎘、銅、鉛、汞及鋅等物質在蔬菜、水果上的殘留。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0026]圖1為本發明快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒的模式圖；
[0027]其中，I為含有對照及測試用的三酶試劑瓶組，包括C酶瓶、T酶瓶；2為酶瓶密封蓋，3為三酶試劑瓶體；4為酶凍干的三酶混合劑；5為底物反應杯杯體；6為含有氯化乙酰膽堿、魯米諾及二甲基聯苯胺的凍干吸水墊；7為對照及測試用二聯底物反應杯組，包括C底物反應杯、T底物反應杯。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0029]實施例1
[0030]本實施例涉及一種利用試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，包括以下步驟:
[0031]本實施例檢測市售油菜中有機磷農藥的殘留。
[0032]1、樣品前處理，將重量在10克之內的市售油菜葉10份，放置于一帶有螺旋蓋的塑料及玻璃容器中，也可以用常用的罐頭瓶。加入約10毫升的純凈水，搖晃3分鐘后，靜置2分鐘后，取上清可直接用于測試；
[0033]2、酶冷凍保護劑的制備:本實施例的配制方法如下:先配制5mmol/L氯化鈣溶液100毫升，然后加入蔗糖I克，甘氨酸I克，甘油5毫升，牛血清白蛋白I克，對以上成分邊加入邊攪拌，直至所有的粉狀試劑全部溶解，然后在_15°C條件下冷凍保存待用；[0034]3、反應酶液的配制:將上述三種酶液用上述酶冷凍保護劑進行稀釋，即將每毫克含有425國際酶活性單位的乙酰膽堿酯酶稀釋3000倍，將每毫克含有10國際酶活性單位的乙酰膽堿酯酶稀釋200倍，將每毫克含有113國際酶活性單位的辣根過氧化物酶稀釋200倍。然后各取上述酶液100微升混合于一起，分裝在棕色的安瓿瓶中，放在冷凍干燥機上冷凍干燥后，上蓋后密封，放置于鋁箔袋中，室溫保存；
[0035]4、底物反應杯的制備:在本實施例中，用聚氯乙烯塑料反應杯，底面內徑為8mm，高度為10mm，所述反應底物墊片的厚度為3mm，將此墊片放入含有濃度為1.0X 10_4mol/L魯米諾、3.0X 10_3mol/L氯化乙酰膽堿及2.0 X 10_3mol/L 二甲基聯苯胺的混合溶液中，浸泡3分鐘后浙干，并冷凍干燥后，放入反應杯中，分別標記為C及T杯，封入包裝袋中，室溫保存待用；
[0036]5、樣品的測試:分別向C及T酶瓶滴加50微升純凈水，輕輕搖勻后，向T酶瓶中用定量塑料滴管滴加50微升待檢樣品溶液，向C酶瓶中用定量塑料滴管滴加50微升純凈水，輕輕搖勻后，放置15分鐘，然后用滴管從上述C及T的酶瓶吸取反應產物100微升，分別滴加到C及T底物反應杯中，在2分鐘內于便攜式化學發光儀上測定C及T底物反應杯的發光強度，根據發光強度的相對抑制率，確定有機磷的濃度。
[0037]結果表明，在10份被檢油菜樣品中，有2份油菜樣品的化學發光抑制率分別為16%及33%，判定為陽性。其余8份油菜樣品的化學發光抑制率均小于15%。對照測試陽性樣品為5ppm的氧化樂果。
[0038]實施例2
[0039]本實施例涉及一種利用試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，包括以下步驟:
[0040]本實施例檢測市售菠菜中有機磷農藥的殘留。
[0041]1、樣品前處理，步驟同實施例1的步驟I ;
[0042]2、酶冷凍保護劑的制備:本實施例的配制方法如下:先配制lOmmol/L氯化鈣溶液100毫升，然后加入蔗糖2克，甘氨酸2克，甘油10毫升，牛血清白蛋白2克。對以上成分邊加入邊攪拌，直至所有的粉狀試劑全部溶解，然后在_25°C條件下冷凍保存待用；
[0043]3、反應酶液的配制:將上述三種酶液用上述酶冷凍保護劑進行稀釋，即將每毫克含有425國際酶活性單位的乙酰膽堿酯酶稀釋5000倍，將每毫克含有10國際酶活性單位的乙酰膽堿酯酶稀釋500倍，將每毫克含有113國際酶活性單位的辣根過氧化物酶稀釋500倍。然后各取上述酶液200微升混合于一起，分裝在棕色的安瓿瓶中，放在冷凍干燥機上冷凍干燥后，上蓋后密封，放置于鋁箔袋中，室溫保存。
[0044]4、底物反應杯的制備:在本實施例中，用聚苯乙烯塑料反應杯。底面內徑為12mm，高度為15mm。所述反應底物墊片的厚度為4mm。將此墊片放入含有濃度為2.0 X 10_4mol/L魯米諾、8.0 X 10_3mol/L氯化乙酰膽堿及6.0 X 10_3mol/L 二甲基聯苯胺的混合溶液中，浸泡3分鐘后浙干，并冷凍干燥后，放入反應杯中，分別標記為C及T杯，封入包裝袋中，室溫保存待用；
[0045]5、樣品的測試:分別向C及T酶瓶滴加100微升純凈水，輕輕搖勻后，向T酶瓶中用定量塑料滴管滴加100微升待檢樣品溶液。向C酶瓶中用定量塑料滴管滴加100微升純凈水，輕輕搖勻后，放置20分鐘。然后用滴管從上述C及T的酶瓶吸取反應產物200微升，分別滴加到C及T底物反應杯中。然后在5分鐘內于便攜式化學發光儀上測定C及T底物反應杯的發光強度，根據發光強度的相對抑制率，確定有機磷的濃度。
[0046]結果表明，在10份被檢菠菜樣品中，有1份油菜樣品的化學發光抑制率分別為21%，判定為陽性。其余9份菠菜樣品的化學發光抑制率均小于15%。對照測試陽性樣品為IOppm的久效磷。
[0047]實施例3
[0048]本實施例涉及一種利用試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，包括以下步驟:
[0049]本實施例檢測市售水晶梨中有機磷農藥的殘留。
[0050]1、樣品前處理:先將水晶梨切取八分之一大小，放置于一干凈的罐頭瓶中。其余步驟同實施例1的步驟I;
[0051]2、酶冷凍保護劑的制備:本實施例的配制方法如下:先配制15mmol/L氯化鈣溶液100毫升，然后加入蔗糖3克，甘氨酸3克，甘油15毫升，牛血清白蛋白3克。對以上成分邊加入邊攪拌，直至所有的粉狀試劑全部溶解，然后在_40°C條件下冷凍保存待用；
[0052]3、反應酶液的配制:將上述三種酶液用上述酶冷凍保護劑進行稀釋，即將每毫克含有425國際酶活性單位的乙酰膽堿酯酶稀釋8000倍，將每毫克含有10國際酶活性單位的乙酰膽堿酯酶稀釋800倍，將每毫克含有113國際酶活性單位的辣根過氧化物酶稀釋800倍。然后各取上述酶液300微升混合于一起，分裝在棕色的安瓿瓶中，放在冷凍干燥機上冷凍干燥后，上蓋后密封，放置于鋁箔袋中，室溫保存。
[0053]4、底物反應 杯的制備:在本實施例中，用聚碳酸酯塑料反應杯。底面內徑為20mm，高度為25mm。在制備反應底物墊片時。所述的反應底物墊片時，所用的厚度為6mm。然后將此墊片放入含有濃度為3.0父10_4!1101/1魯米諾、15.0\10_311101/1氯化乙酰膽堿及
10.0X 10_3mol/L 二甲基聯苯胺的混合溶液中，浸泡3分鐘后浙干，并冷凍干燥后，放入反應杯中，分別標記為C及T杯，封入包裝袋中，室溫保存待用；
[0054]5、樣品的測試:分別向C及T酶瓶滴加200微升純凈水，輕輕搖勻后，向T酶瓶中用定量塑料滴管滴加200微升待檢樣品溶液。向C酶瓶中用定量塑料滴管滴加200微升純凈水，輕輕搖勻后，放置25分鐘。然后用滴管從上述C及T的酶瓶吸取反應產物300微升，分別滴加到C及T底物反應杯中。然后在8分鐘內于便攜式化學發光儀上測定C及T底物反應杯的發光強度，根據發光強度的相對抑制率，確定有機磷的濃度。
[0055]結果表明，10份被檢水晶梨樣品的化學發光抑制率均小于15%，結果判定為均為陰性。對照測試陽性樣品為15ppm的甲胺磷。
[0056]本發明利用乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶及過氧化物酶為催化體系，將氯化乙酰膽堿水解氧化后的產物與魯米諾產生化學發光效應。由于有機磷農藥會抑制這種反應體系的三種酶的活性，尤其是乙酰膽堿酯酶的活性，從而可建立靈敏地測試農產品中有機磷農藥的方法，并利用此原理研制出檢測有機磷農藥的化學發光檢測試劑盒。本發明有具檢測速度快、操作過程簡單、穩定性及重復性好、不需要昂貴儀器等優點，非常適合于在農貿市場進行有機磷農藥的現場監測。
[0057]以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。
【權利要求】
1.一種快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:c酶瓶、T酶瓶、C底物反應杯、T底物反應杯，所述C酶瓶、T酶瓶均用酶瓶密封蓋密封，且裝有酶凍干的三酶混合劑；所述C底物反應杯、T底物反應杯均設置含有氯化乙酰膽堿、魯米諾及二甲基聯苯胺的凍干吸水墊。
2.一種應用權利要求1所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，包括以下步驟: 第I步:酶冷凍保護劑的制備:將蔗糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、甘油加入氯化鈣溶液中，攪拌至完全溶解，冷凍保存待用； 第2步:反應酶液的配制:將所述酶冷凍保護劑分別稀釋乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶、過氧化物酶，混合，冷凍干燥后，分別裝入C酶瓶和T酶瓶中； 第3步:底物反應杯的制備:將反應底物墊片放入魯米諾、氯化乙酰膽堿、二甲基聯苯胺混合溶液中，浸泡浙干，并冷凍干燥后，放入聚氯乙烯塑料反應杯，標記為C底物反應杯、T底物反應杯； 第4步:樣品的測試:分別向C、T酶瓶內滴加純凈水，搖勻后，用塑料滴管向所述T酶瓶中滴加待檢樣品溶液，向C酶瓶中滴加純凈水或磷酸鹽緩沖液，搖勻，靜置，用滴管從所述C、T酶瓶中吸取反應產物，分別滴加到C、T底物反應杯中，在2~8分鐘內于便攜式化學發光儀上測定C、T底物反應杯的發光強度，根據發光強度的相對抑制率，確定有機磷的濃度。
3.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第I步中，酶冷凍保護劑中包括如下含量的各組分:5~15mmol/L氯化鈣溶液100毫升,鹿糖I~3克，甘氨酸I~3克，甘油5~15毫 升，牛血清白蛋白I~3克。
4.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第2步中，所述乙酰膽堿酯酶稀釋3000~8000倍，所述膽堿氧化酶稀釋200~800倍，所述過氧化物酶稀釋200~800倍。
5.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第3步中，所述C底物反應杯、T底物反應杯的底面內徑為8~20mm，高度為10~25mm。
6.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第3步中，所述反應底物墊片的厚度為3~6_。
7.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第3步中，所述魯米諾的濃度為1.0X 10_4~3.0X 10_4mol/L、氯化乙酰膽堿的濃度為3.0X 10_3~15.0X10_3mol/L、二甲基聯苯胺的濃度為 2.0Χ10-3 ~10.0 X l(T3mol/L。
8.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第4步中，所述向C、T酶瓶內滴加純凈水為50~200微升，所述待檢樣品溶液為50~200微升，所述C酶瓶中純凈水為50~200微升，磷酸鹽緩沖液為0.lmol/L，且pH為7.0。
9.如權利要求2所述的試劑盒快速檢測有機磷農藥殘留的方法，其特征在于，第4步中，所述C、T底物反應杯中的反應產物100~300微升。
【文檔編號】G01N21/76GK104007104SQ201410219923
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】劉國艷, 柴春彥, 王藝如, 管毓渝, 任慧鵬 申請人:上海交通大學