用于血管內皮生長因子定量測定試劑盒及其發光底物溶液的制作方法

用于血管內皮生長因子定量測定試劑盒及其發光底物溶液的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于血管內皮生長因子定量測定試劑盒及其發光底物溶液，所述底物溶液包括發光液A和發光液B；所述發光液A各組分濃度為：魯米諾0.40－0.50g/L、對碘酚0.10－0.15g/L、1,2-環己二胺四乙酸0.10－0.15g/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化鈉10.00－12.00g/L；所述發光液B各組分濃度為：過氧化脲0.20－0.25g/L、Tween201.00－1.50ml/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化鈉10.00－12.00g/L；所述發光液A和發光液B使用時的體積比為1：1。本發明的發光底物溶液，穩定性好、靈敏度高、光子強度平臺期長的優點。
【專利說明】用于血管內皮生長因子定量測定試劑盒及其發光底物溶液
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蛋白免疫檢測方法，特別涉及一種用于血管內皮生長因子定量測定試劑盒及其發光底物溶液。
【背景技術】
[0002]血清腫瘤標志物(tpgmor marker, TM)是指在腫瘤的發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產生的或者是由機體對腫瘤細胞反應而產生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質，包括蛋白質、激素、酶(同工酶)、多胺及癌基因產物等。腫瘤標志物檢測簡便且創傷小，因而在腫瘤篩查、診斷、治療等方面廣泛應用。
[0003]癌細胞的生長、轉移依賴新生血管的形成，血管內皮生長因子(VEGF)是最有效的促血管生長因子(Ferraraetal.Endocr.Rev.1997，18:4-25)。血管內皮生長因子(Vascpglar Endothelial Growth Factor, VEGF)是近些年發現和研究較為廣泛的一種全新廣譜腫瘤標記物(Cancer biomarker),被認為是最有意義的血液腫瘤篩查的標記物。根據本公司的研究成果和國外的文獻報道血管內皮生長因子檢測試劑盒有四大功能:VEGF血液學檢測可作為(I)腫瘤的篩查、(2)腫瘤的輔助診斷(Kondo S，BiochimBiophys Acta.1994Mar31; 1221 (2):211-4)、(3)腫瘤治療療效的評估和監測、(4)腫瘤預后、以及復發的監測(Marpg D Clin Cancer Res April2, 2013; DO1: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3409)。
[0004]VEGF相對分子量為45kDa，是由二硫鍵連接的糖蛋白二聚體，由同一N端而其他區域有某些差異的兩條多肽鏈組成。VEGF基因位于染色體6p21.3，該基因經過轉錄水平的剪切，可產生5種不同的轉錄子，分別編碼23，121，165，186和206個氨基酸多肽，VEGF是一種典型的外分泌蛋白。VEGF分解的單體無活性，去除N2糖基對生物效應無影響，但可能在細胞分泌中起作用。血管內皮細胞生長因子基因由8個外顯子和7個內含子組成，定位于染色體6p21.3，由于外顯子剪切的不同而形成不同的亞型，產生出分別VEGF121、VEGF145,VEGF165, VEGF185, VEGF206 等至少 5 種蛋白形式，其中 VEGF121、VEGF145、VEGF165 是分泌型可溶性蛋白，在人類中表達,能直接作用于血管內皮細胞促進血管內皮細胞增殖,增加血管通透性。
[0005]近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發展迅速，已廣泛應用于生物醫學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。用于檢測血清學指標的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶聯免疫吸附法、和化學發光免疫分析。這些方法既可以作為初篩試驗也可以作為確認試驗，其中化學發光法具有檢測線性范圍寬、檢測儀器簡單、操作方便等優點。
[0006]但是，化學發光方法因其所用發光底物溶液穩定性差、光子強度平臺期段、信噪比高等缺點，其應用受到很大的局限。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種能夠使采用其的試劑盒具有穩定性好、靈敏度高的用于血管內皮生長因子定量測定的發光底物溶液。
[0008]本發明的另一目的是提供一種穩定性好、靈敏度高的用于血管內皮生長因子定量測定試劑盒。
[0009]本發明的用于血管內皮生長因子定量測定的化學發光底物溶液，包括發光液A和發光液B ；
[0010]所述發光液A以水為溶劑，并且其中的各組分濃度為:魯米諾0.40 - 0.50g/L、對碘酚 0.10 — 0.15g/L、l，2-環己二胺四乙酸 0.10 — 0.15g/L、硼酸 4.60 — 5.40g/L、硼砂
11.00- 12.00g/L、氯化鈉 10.00 — 12.00g/L，所述發光液 A 的 pH 值為 8.0—10.0 ；
[0011]所述發光液B以水為溶劑，并且各組分濃度為:過氧化脲0.20 - 0.25g/L、Tween201.00 — 1.50ml/L、硼酸 4.60 — 5.40g/L、硼砂 11.00 - 12.00g/L、氯化鈉 10.00 —12.00g/L,所述發光液B的pH值為8.0 —10.0 ；
[0012]所述發光液A和發光液B使用時的體積比為1:1。
[0013]優選的，所述發光液A中各組分濃度為:魯米諾0.41g/L、對碘酚0.10g/L、l，2_環己二胺四乙酸0.12g/L、硼酸4.95g/L、ll.44g硼砂g/L、氯化鈉11.6g/L ；
[0014]所述發光液B中各組分濃度為:過氧化脲0.23g/L、Tween201ml/L、硼酸4.95g/L、硼砂 11.44g/L、氯化鈉 11.6g/L。
[0015]本發明還提供了一種血管內皮生長因子化學發光定量測定試劑盒，其含有:前述的化學發光底物溶液、酶標記的VEGF單克隆抗體、VEGF的單克隆抗體包被的固相載體和VEGF校準品，其中所述的酶能夠與所述的化學發光底物溶液中的魯米諾或異魯米諾反應產生光信號。
[0016]優選的，所述的酶為堿性磷酸酶和/或辣根過氧化物酶。
[0017]優選的，所述的載體是固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
[0018]本發明還提供了一種前述的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0019]I)用VEGF的單克隆抗體包被固相載體；
[0020]2)使待測樣品和VEGF校準品分別與所述的VEGF的單克隆抗體包被固相載體接觸，使其發生抗原抗體結合反應；
[0021]3)酶標記VEGF的單克隆抗體；
[0022]4)使酶標記VEGF的單克隆抗體與結合在固相載體上的VEGF接觸，并發生抗原抗體結合反應；
[0023]5)加入化學發光底物溶液，并使其與所述的酶發生反應；
[0024]6)檢測固相載體上待測樣品和校準品對應的發光值，并通過與校準品比較確定待測樣品中的VEGF含量。
[0025]本發明的試劑盒的分析靈敏度(最低檢出量)不大于20pg/ml、穩定性可達12個月。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為新型夾心法受體包被VEGF化學發光試劑反應原理圖；
[0027]圖2為圖1試劑盒校準曲線，以校準品濃度為橫坐標，RLpg值為縱坐標會出的標準曲線。[0028]圖3為VEGF標準曲線。
【具體實施方式】
[0029]1.小鼠免疫和單克隆抗體制備
[0030]1.1小鼠免疫方案:用VEGF121、VEGF145, VEGF165抗原分別免疫一組BALA/c小鼠，共二個大組，包括大腸桿菌來源VEGF和人工合成短肽；每大組分4個免疫小組，每小組2只6-8周齡雌性balb/c小鼠，免疫抗原設立4個劑量200 μ g、100 μ g、50 μ g、25 μ g，免疫方式兩種:皮下多點注射及腹腔注射，免疫佐劑利用弗氏佐劑及自制佐劑兩種，免疫間隔2_3 周。
[0031]1.2效價檢測:免疫后10-14天鼠眼內眥取血，檢測抗體效價，達到106方可進行
細胞融合。
[0032]1.3細胞融合:免疫小鼠脾細胞，與骨髓瘤細胞融合。CLIA篩選陽性細胞株。
[0033]1.4有限稀釋及擴增凍存:挑選的陽性細胞株進行有限稀釋，反復4-6次；有限稀釋同時擴增凍存細胞株。
[0034]1.5單克隆抗體性質鑒定:性質鑒定包括利用Sigma抗體分型試劑檢測。單抗細胞株上清，應用免疫印記試驗和競爭實驗檢測抗體特異性。利用競爭CLIA檢測抗體親和力。
[0035]2.VEGF抗原的來源
[0036]購自NIBSC的WHO英國國家生物制品檢定所的重組人血管內皮生長因子(VEGF)國際約定校準品 WHO/NIBSC code:02/286。
[0037]3.VEGF-CLIA 試劑制備
[0038]試劑采用一種新型夾心法作為本課題的主要研究方法，基本原理是以VEGF165抗體包被，以VEGF121抗體作檢測抗體，制成夾心法CLIA。具體試驗過程包括以下一個步驟。
[0039]3.1包被受體及酶標抗體濃度確定:棋盤試驗，對不同配對組合下校準品的RLU值作統計學分析，以VEGF濃度為橫坐標X值，RLU值為縱坐標Y值，求線性相關系數R值。最終挑選具有良好線性，較高R值的受體、二抗用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶，酶標二抗應用濃度和抗體包被濃度作為夾心法CLIA檢測方法的關鍵條件在選擇時應同時滿足SORLU 值< 100，S6/S0 (P/N)最大等條件。
[0040]3.2 包被板的制備:以 Na2CO3.2H20、2.9g/l NaHCO3.12H20、9g/lNacl (ρΗ9.4)作為包被液，包被VEGF165抗體(0.2g/l) 100 μ I/孔在發光板上，4 °C過夜。用生理鹽水(0.9%NaCl)洗滌 5 遍，用 0.2g/l NaH2P04.2Η20、2.9g/lNa2HP04 *2H20U0g/l BSA 和 lml/
IProclin300、5.0g/1 蔗糖(C12H22011)、10g/l 明膠，作為封閉液(ρΗ7.0)，按 250 μ I/孔加入發光板中，于18 — 26°C靜置3小時，然后將所述的包被板晾干，置于2 — 8°C保存。
[0041 ] 3.3VEGF校準品制備:將VEGF重組抗原純品用PBS配制成六個濃度點:Opg/ml (SO)、25pg/ml (SI)、50pg/ml (S2)>IOOpg/ml(S3)、200pg/ml(S4)、400pg/ml (S5)、800 (S6)，準確度為90% — 110%。用2ml規格的管制玻璃瓶分裝校準品溶液，分裝量為0.5ml/瓶。置于2—8°C保存。
[0042]3.4VEGF酶結合物制備:用經典過碘酸鈉氧化法把辣根過氧化物酶HRP標記在 VEGFl21 抗體上，制成酶標記物(VEGF-HRP)。然后將 0.2g/lNaH2P04.2Η20、2.9g/lNa2HP04.2H20、10g/l BSA、10g/l 酪蛋白、3g/l 氨基吡啉和 lml/1 Proclin300，用純化水溶解作為酶稀釋液(PH7.0)，按1:9000(V/V)的比例向酶稀釋液中加入酶標記物(VEGF-HRP)，配制成酶結合物，置于2 — 8°C保存。
[0043]3.5檢測流程:加待檢樣品50 μ I/孔，加酶結合物50 μ I孔37。。Ih,洗滌5次，加入底物發光液100 μ I/孔，避光5min，檢測RLU值。具體步驟需要參考最終確定的檢測條件。
[0044]4.發光底物溶液制備
[0045]4.1稱量0.41g魯米諾、0.1Og對碘酚、0.12gl，2-環己二胺四乙酸、4.95g硼酸、
11.44@硼砂、11.6g氯化鈉,將上述試劑放入潔凈容器中，加雙蒸水溶解,定容至1000ml,調節PH值為8.0—10.0,制成發光液A。然后用8.0ml規格塑料瓶按3.0ml/瓶分裝，置于2—8°C保存。
[0046]4.2 稱量 0.23g 過氧化脲、Iml Tween20、4.95g 硼酸、11.44g 硼砂、11.6g 氯化鈉，將上述試劑放入潔凈容器中，加雙蒸水溶解，定容至1000ml，調節pH值為8.0 —10.0，制成發光液B。然后用8.0ml規 格塑料瓶按3.0ml/瓶分裝，置于2 — 8°C保存。
[0047]試劑盒的組成成份
[0048]1.VGEF校準品:VGEF (人體體液中提取)，0.5ml/瓶*7瓶，濃度為O (SO)、25 (SI)、50 (S2) UOO (S3)、200(S4)、400(S5)、800 (S6) pg/ml ；
[0049]2.包被板:VGEF單克隆抗體(鼠源)，2.5 μ g/mL, I ik, 96人份，真空密封于鋁箔袋內；
[0050]3.酶結合物溶液:VGEF單抗(鼠源)辣根酶結合物，磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，I瓶，6mL ；
[0051]4.底物液A:魯米諾，I瓶，3mL ;
[0052]5.底物液B:過氧化物，I瓶，3mL ;
[0053]6.濃縮洗液(20X ):磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.2)，I瓶，30mL ；
[0054]5.分析性能分析和穩定性試驗
[0055]采用建立的雙抗體夾心CLIA方法檢測VEGF標準品，計算不同濃度范圍標準曲線的線性相關系數，R值最大的一組濃度范圍即此方法最佳濃度范圍。對線性關系重復性、特異性、準確性等需要反復驗證。
[0056]5.1 外觀
[0057]微孔板應清潔，無異物污染和加工缺陷；液體部分應清亮、無沉淀或絮狀物。
[0058]5.2最低檢出量
[0059]VEGF標準品的最低檢出量不大于20pg/ml。
[0060]5.3精密度
[0061]批內精密性CV (%)應不高于10% (η≥20);批間精密性CV (%)應不高于15%(n ^ 5)
[0062]5.4準確性
[0063]回收率應介于90%_110%之間。
[0064]5.5線性范圍
[0065]在(O~800) pg/ml的線性范圍內，試劑盒的相關系數r應≥0.99。
[0066]5.6穩定性[0067]2-8 °C儲存，有效期為12個月。
[0068]6、臨床應用性能
[0069]6.1患者資料
[0070]選擇718例樣本，其中腫瘤組血清469例，正常血清249例，進行臨床研究試驗:
[0071]VEGF濃度的計算公式為:y=0.0046x+0.0167.標準曲線見圖3。
[0072]VEGF標準曲線線性關系良好，相關系數r=0.9987。該實驗的重復性好，批內和批間CV分別為3.4%和6.3%O
[0073]腫瘤組VEGF檢測濃度明顯高于正常對照組。兩組間比較，差異有統計學意義(Ρ〈0.01)(見表 I)
[0074]表1兩組血清VEGF檢測值統計表
【權利要求】
1.一種用于血管內皮生長因子定量測定的發光底物溶液，其特征在于，包括發光液A和發光液B ； 所述發光液A以水為溶劑，并且其中的各組分濃度為:魯米諾0.40 - 0.50g/L、對碘酚 0.10 — 0.15g/L、l，2-環己二胺四乙酸 0.10 一 0.15g/L、硼酸 4.60 一 5.40g/L、硼砂11.00- 12.00g/L、氯化鈉 10.00 — 12.00g/L，所述發光液 A 的 pH 值為 8.0—10.0 ； 所述發光液B以水為溶劑，并且各組分濃度為:過氧化脲0.20 — 0.25g/L、Tween201.00 — 1.50ml/L、硼酸 4.60 — 5.40g/L、硼砂 11.00 - 12.00g/L、氯化鈉 10.00 —12.00g/L,所述發光液B的pH值為8.0 —10.0 ； 所述發光液A和發光液B使用時的體積比為1:1。
2.根據權利要求1所述的發光底物溶液，其特征在于，所述發光液A中各組分濃度為:魯米諾0.41g/L、對碘酚0.12g/L、l，2-環己二胺四乙酸0.12g/L、硼酸4.95g/L、硼砂11.44g/L、氯化鈉 11.6g/L ； 所述發光液B中各組分濃度為:過氧化脲0.23g/L、Tween201ml/L、硼酸4.95g/L、硼砂11.44g/L、氯化鈉 11.6g/L。
3.—種血管內皮生長因子化學發光定量測定試劑盒，其特征在于，其含有:權利要求1所述的化學發光底物溶液、酶標記的VEGF單克隆抗體、VEGF的單克隆抗體包被的固相載體和VEGF校準品，其中所述的酶能夠與所述的化學發光底物溶液中的魯米諾或異魯米諾反應產生光信號。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶為堿性磷酸酶和/或辣根過氧化物酶。
5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的載體是固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
6.一種權利要求3 - 5任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用VEGF的單克隆抗體包被固相載體； 2)使待測樣品和VEGF校準品分別與所述的VEGF的單克隆抗體包被固相載體接觸，使其發生抗原抗體結合反應； 3)酶標記VEGF的單克隆抗體； 4)使酶標記VEGF的單克隆抗體與結合在固相載體上的VEGF接觸，并發生抗原抗體結合反應； 5)加入化學發光底物溶液，并使其與所述的酶發生反應； 6)檢測固相載體上待測樣品和校準品對應的發光值，并通過與校準品比較確定待測樣品中的VEGF含量。
【文檔編號】G01N33/68GK103969447SQ201410216078
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月21日 優先權日:2014年5月21日
【發明者】張從從, 鐘曉瑋 申請人:張從從