一種藥物靶標捕獲方法
【專利摘要】本發明公開了一種藥物靶標的捕獲方法，包括如下步驟：（1）取原料：取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方；（2）連接：將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價連接得化合物；（3）轉運：用基因轉運方法，將步驟（2）得到的標簽化合物分別轉運至細胞內；（4）靶標捕獲：將步驟（3）的細胞破碎，用固定化的互補DNA或RNA捕獲步驟（1）中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟（1）中的親和材料一方，將靶標富集；（5）靶標識別；（6）靶標確認，即可。本發明方法可以將透膜性差的化合物轉運入細胞內與靶標結合，實現更接近真實生理環境的靶標識別，為藥物的作用機理提供更確鑿的證據。
【專利說明】一種藥物朝標捕獲方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種藥物靶標的捕獲方法。
【背景技術】
[0002]選擇確定新穎有效的藥物靶標是新藥開發的首要任務。藥物作用靶標的確定，有助于更好的了解藥物在體內的功能及作用機理，在對藥物定向合成、療效、給藥方式、藥物代謝及安全性評價方面都起著至關重要的作用。現有的方法在對藥物靶標的捕獲方法大體可分為兩種:一是從細胞表型或者功能的變化來判斷，如生物芯片和基于酵母雙雜交或三雜交的捕獲技術，但是細胞內信號通路錯綜復雜，不同的信號分子可調節相同的細胞功能，同一信號分子在不同的信號通路中也可行使不同的作用，因此依據細胞表型或功能的變化不能明確判定細胞內的藥物靶標；另外一類捕獲方法是依據藥物與藥物靶標的親和性，在細胞裂解液中用已知藥物捕獲潛在的藥物靶標，但細胞內不同的蛋白存在于不同的細胞器中，這些細胞器之間彼此相隔成為獨立的小室，細胞在裂解過程中將細胞內所有的蛋白混合在一起，這樣在加入藥物后，可能正常生理狀態下藥物不會作用的靶蛋白在全細胞裂解的時候會相互作用，引起假陽性從而對藥物靶標的捕獲造成干擾。大部分藥物需要穿過細胞膜才能進入組織細胞發揮其作用，而細胞膜這一天然屏障卻使得許多具有很好體外生物活性的分子(如極性比較高的分子)包括藥物不能進入細胞內，以至于無法發揮其應有的作用，從而限制了藥物的應用。
[0003]為了解決現有藥物靶標捕獲方法存在的問題，我們設計了一種新的藥物靶標捕獲方法靶標，即把化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方進行共價連接，再通過不損傷細胞的方式轉運到細胞內，在細胞內部進行藥物靶標的捕獲，然后對捕獲的靶標進行識別和驗證。其優勢在于靶標捕獲的環境是在細胞內:相對于傳統的先裂解細胞再捕獲靶標的方法，本發明的化合物與靶標結合的過程發生在細胞內部，接近于實際的生理狀態，發生結合時細胞內蛋白能夠保持原有的構象，因此能夠更好的模擬體內的藥物作用過程。
【發明內容】
[0004]為了克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種藥物靶標捕獲方法。
[0005]本發明藥物靶標捕獲方法，包括如下步驟:
[0006](I)取原料:取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方；
[0007](2)將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價連接，得如圖1所示的標簽化合物；
[0008](3)轉運:用特定的基因轉運方法，將步驟(2)得到的標簽化合物分別轉運至細胞內；
[0009](4)靶標捕獲:將步驟(3)的細胞破碎，用固定化的互補DNA或RNA捕獲步驟(I)中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟(I)中的親和材料一方，從而通過共價結合的標簽化合物與靶標的親和力將靶標富集。
[0010](5)靶標識別；將富集的靶標從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標。
[0011](6)靶標確認，即可。
[0012]步驟⑴中所述化合物，是藥物本身或者其成分。
[0013]步驟(2)中所述標簽化合物是指在連接了帶生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標記的DNA或RNA的化合物。
[0014]步驟(5)所述靶標識別是將富集的靶標從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標。
[0015]步驟(6)所述靶標確認是按優先級表達或購買(5)中識別的靶標，并逐一通過化合物與這些靶標的相互作用比較，最終達到化合物靶標的確認。
[0016]步驟(I)中，所述化合物的分子量為100?4000Da。
[0017]步驟(I)中，所述化合物為用于步驟(2)中共價連接的、經過化學修飾并具有與靶標化合物相似生物活性的化合物。
[0018]步驟(I)所述的DNA或RNA為在所述范圍的任意序列并具有步驟⑵中用于與化合物共價連接的官能團。
[0019]步驟(I)中，所述DNA或RNA的長度不小于5個堿基對或堿基。
[0020]步驟(I)中,所述的標記為生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標記。
[0021]步驟(I)所述其它親和材料的一方為任意無明顯細胞毒性的、具有與步驟(2)中化合物共價連接的特異性親和材料對的一方。
[0022]步驟⑵所述的標簽化合物為具有與待識別靶標化合物相似活性的化合物。步驟
(3)中，所述基因轉運的方法是不造成明顯細胞損傷的所有轉運方法。
[0023]步驟(3)中，所述基因轉運方法是陽離子脂質體轉染法、磷酸鈣法轉染法、納米顆粒轉染法或電穿孔轉染法以及其他能夠將核酸轉運至細胞內的技術手段。
[0024]所述“基因轉運”是指使用物理、化學或者生物方法將核酸轉移到細胞內的過程。
[0025]所述“特異性親和材料”是指能夠相互作用并且特異性結合的一對分子，例如:互補的核酸片段、酶與底物，酶與抑制劑，酶與輔酶，激素與細胞受體，維生素與結合蛋白，抗體與抗原。
[0026]步驟(I)中，所述的DNA或RNA為是隨機的雙鏈序列時，步驟⑷中用于捕獲的互補的DNA或RNA是能夠與隨機的雙鏈序列中的一條鏈互補的單鏈序列。在捕獲時，需要先對隨機的雙鏈序列進行解鏈。
[0027]步驟(6)中，所述的相互作用為靶標與未經修飾的化合物的親和性。
[0028]步驟￠)中，所述優先級是指從差異蛋白中排除細胞骨架蛋白后，將潛在的靶標蛋白根據(相對)豐度進行優先級排序。
[0029]本發明方法可以將透膜性差的化合物轉運進入細胞內，從而在細胞內與靶標結合，來實現更接近真實生理環境的靶標識別，為化合物對疾病的作用機理提供更為確鑿的證據。此外，該發明技術新穎、方法簡單、速度快、成本低，應用前景非常良好。
[0030]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0031]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1標簽化合物分子的結構通式
[0033]圖2化合物1-3的1H NMR譜圖
[0034]圖3化合物1-5的1H NMR譜圖
[0035]圖4標簽化合物I的HPLC純度分析
[0036]圖5標簽化合物I的質譜分析
[0037]圖6激光共聚焦顯微鏡觀察標簽化合物I在細胞內的定位情況，藍色為細胞核，綠色為FITC標記的標簽化合物I
[0038]圖7Lanel:生物素聯合對照化合物2直接從細胞裂解液中捕獲蛋白；lane2_3:全細胞裂解液；Lane4:蛋白分子量標尺；Lane5:將標簽化合物I轉運至細胞內捕獲革巴蛋白后，用Oligo (dT)磁珠聯合標簽化合物I從細胞裂解液中捕獲的蛋白
[0039]圖8差異蛋白對比以及潛在靶標識別
[0040]圖9未經修飾的化合物對PTPlB的IC50值測定
[0041]圖10激光共聚焦顯微鏡觀察標簽化合物3在細胞內的定位情況，藍色為細胞核，綠色為FITC標記的標簽化合物3
[0042]圖11激光共聚焦顯微鏡觀察標簽化合物4在細胞內的定位情況，藍色為細胞核，綠色為FITC標記的標簽化合物4
【具體實施方式】
[0043]實施例1
[0044]1.標簽化合物合成
[0045]1.1化合物連接位點選擇:根據化合物的構效關系，確定不影響化合物活性的反應位點；
[0046]1.2化合物修飾:用雙官能團試劑對化合物進行修飾，其中未反應的官能團應與用于標簽化合物的反應兼容；
[0047]1.3DNA或RNA或其它特異親和材料的一方的修飾:用雙官能團試劑進行修飾；
[0048]1.4標簽化合物合成:將修飾的化合物與修飾的DNA或RNA或其它特異親和材料的一方進行共價鍵合。
[0049]2.標簽化合物轉運入細胞
[0050]選擇適合化合物轉導的、不造成明顯細胞損傷的基因轉運方法，包括陽離子脂質體轉染法、磷酸鈣法轉染法、納米顆粒轉染法或電穿孔轉染法以及其他能夠將核酸轉運至細胞內的技術手段，將標簽化合物有效轉運到細胞內。
[0051]3.靶標捕獲
[0052]3.1室溫融解RIPA裂解緩沖液，加入蛋白酶抑制劑，置于冰上待用。
[0053]3.2用PBS洗一遍，用細胞刮子刮下細胞。離心收集細胞，留下細胞沉淀備用。
[0054]3.3每20 μ L細胞沉淀加入200 μ L添加了蛋白酶抑制劑的細胞裂解液。
[0055]3.4冰浴反應30分鐘。
[0056]3.540C 14000g 離心 10 分鐘。
[0057]3.6立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞質蛋白。可以立即使用，也可以_70°C凍存。
[0058]3.7根據裂解液體積，加入含兩倍裂解液體積結合緩沖液的磁珠或固定化的其它高親和材料，孵育20分鐘；
[0059]3.8磁鐵吸附磁珠或將固定化的其它高親和材料過濾，并用20mMTris-HCl (pH8.0)洗滌三次；
[0060]3.9加入少量如上20mM Tris-HCl緩沖液，80度加熱3分鐘，然后快速吸取上清，樣品進一步進行SDS-PAGE展開后銀染；
[0061]4.靶標識別
[0062]4.1將蛋白條帶與空白對照提交進行蛋白質譜鑒定，獲得與化合物結合蛋白的詳細信息。
[0063]4.2比對經親和富集的蛋白與空白對照的差異，確定潛在的化合物靶標。
[0064]5.革巴標確認
[0065]5.1按優先級表達或購買4.2中識別的潛在化合物靶標。
[0066]5.2用化合物對潛在的靶標進行逐一親和性實驗，并進行對比后，最終確認化合物靶標。
[0067]下面用實驗例的方式驗證本發明的有益效果:
[0068]實驗例I標簽化合物I的合成
[0069]1、實驗材料和試劑
[0070]化合物1-1根據參考文獻的方法(D.P.Wilson et al，J.Med.Chem.2007，50，4681-4698)在本公司合成；5’ -氨基、3’ -熒光素修飾的多聚腺苷酸(5，-(CH2) 12-A19-3，-FITC)由英濰捷基(上海)貿易有限公司(Invitrogen TradingShanghai C0.，Ltd)定制合成；其余化學合成使用的試劑分別從Aldrich或TCI購買而得。
[0071]2、標簽化合物I的合成
[0072]標簽化合物I的合成路線如下:
[0073]
【權利要求】
1.一種藥物靶標捕獲方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取原料:取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方； (2)連接:將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價連接得化合物； (3)轉運:用基因轉運方法，將步驟(2)得到的標簽化合物分別轉運至細胞內； (4)靶標捕獲:將步驟(3)的細胞破碎，用固定化的互補DNA或RNA捕獲步驟⑴中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟(I)中的親和材料一方，將靶標富集; (5)靶標識別； (6)靶標確認，即可。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟(5)所述靶標識別是將富集的靶標從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標； 步驟(6)所述靶標確認是按優先級表達或購買(5)中識別的靶標，并逐一通過化合物與這些靶標的相互作用比較，最終達到化合物靶標的確認。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述化合物的分子量為100 ?4000Da。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述化合物為用于步驟(2)中共價連接的、經過化學修飾并具有與靶標化合物相似生物活性的化合物。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的DNA或RNA為在所述范圍的任意序列并具有步驟(2)中用于與化合物共價連接的官能團。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟⑴中，所述DNA或RNA的長度不小于5個堿基對或堿基。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述DNA或RNA標記有生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標記。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述其它親和材料的一方為任意無明顯細胞毒性的、具有與步驟(2)中化合物共價連接的特異性親和材料對的一方。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的標簽化合物為具有與待識別靶標化合物相似活性的化合物。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述基因轉運的方法是不造成明顯細胞損傷的所有轉運方法。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述基因轉運方法是陽離子脂質體轉染法、磷酸鈣法轉染法、納米顆粒轉染法或電穿孔轉染法以及其它能夠將核酸轉運至細胞內的技術手段。
12.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(6)中，所述的相互作用為靶標與未經修飾的化合物的親和性。
【文檔編號】G01N27/62GK104181221SQ201410214864
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年5月21日 優先權日:2013年5月21日
【發明者】李進, 楊本艷姿, 竇登峰, 葛嘯虎, 宋宏梅, 萬金橋, 張艷, 胡曉, 王星, 馮靜超, 鐘國慶 申請人:成都先導藥物開發有限公司