熒光編碼微球的解碼方法及系統的制作方法
【專利摘要】本發明公開了熒光編碼微球的解碼方法及系統，該熒光編碼微球的解碼方法包括如下步驟：激發步驟，用激光對某個熒光微球進行照射；接收步驟，接收所述某個熒光微球被激光激發后發出的光譜波形；判定步驟，在參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形中，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形，判定所述某個熒光微球為所述某個參考光譜波形對應的參考熒光微球。本發明可以利用更多的熒光物質對微球進行編碼；提高了判別熒光微球的準確度；制備、運輸和保存熒光微球更加簡單；可以采用更多的波形碼，即是說增加了微球編碼的數目。
【專利說明】熒光編碼微球的解碼方法及系統
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及檢測領域，尤其涉及熒光編碼微球的解碼方法及系統。
【【背景技術】】
[0002]生物芯片(biochip)技術是融微電子學、生命科學、計算機科學和光電化學為一體的高通量生物分子檢測技術，是生命科學領域的一場重大革命。傳統形式的生物芯片技術又稱為微陣列(microarray)技術,其原理是將已知序列的生物分子(DNA、RNA、多肽、蛋白質等)集成于固體表面形成探針陣列，用被標記的待檢測生物分子與上述探針陣列進行雜交反應，通過檢測相應位置的雜交探針，實現生物分子檢測的目的。傳統生物芯片雜交屬于固-液相雜交，其分立的固-液反應環境及洗滌因素使其在檢測靈敏度及稀有樣品的檢測中顯現出不足之處。
[0003]隨著人類基因組計劃的進行及人類對自身健康發展的需要，更快速、更高效、更高通量的生物分子檢測技術顯得尤為重要。因此在傳統生物芯片技術的基礎上發展出了液相生物芯片(Liquid biochip)技術。
[0004]液相生物芯片技術是集流式技術、熒光微球化學合成技術、生物分子雜交技術、高效數字信號處理技術為一體的尖端生物分子檢測技術。液相生物芯片技術的核心是熒光編碼標記的功能性高分子微球。目前，熒光微球的編碼和解碼思想是:以LuminexlOO為例，系統采用紅色和橙色兩種熒光染料對直徑為5.5~5.6um大小的聚苯乙烯微球進行編碼，將每種染料以熒光強度分成10等分，形成10X10的100種不同熒光編碼，分別偶聯上100種不同的探針分子用于生物檢測。檢測時用激光逐個激發熒光微球，使激發出的熒光信號通過一系列二向色鏡和濾光片，再用光電倍增管(PMT)進行收集，最終將信號送入處理器進行處理。
[0005]與傳統固基芯片相比，液相生物芯片技術具有如下優點:(1)通量高:可同時對100或500種目的分子進行定性、定量分析，實現多成分檢測的目的；(2)樣本用量少:實現單樣本的多成分檢測，大量節省了樣本用量，能夠實現對稀有樣品的檢測分析，彌補了傳統生物芯片技術的不足；(3)靈敏度高:雜交反應在接近生物體系統內部環境的液相環境下進行，能夠保持蛋白質和DNA的天然構象和活性，而具有較大表面積的微球上可偶聯成千上萬的探針分子，如此高密度的探針分子能夠最大程度的捕獲被檢測分子，保證雜交反應的充分進行，從而提高了檢測的靈敏度；(4)速度快:基于液相反應動力學使雜交反應快速高效，大大縮短了孵育時間，而且流式細胞術使檢測分析時間大大縮短；(5)成本低:單樣本的多成分檢測可有效節約樣本、時間和勞動，芯片技術核心的微球制備工藝簡單成熟，可實現大規模生產，使檢測成本降低；(6)另外，還有檢測范圍廣、準確性高、操作簡單靈活、可重復性強等優點。
[0006]盡管有如此多的優點，但隨著新技術的不斷出現以及社會發展對檢測技術的進一步要求，液相生物芯片技術仍面臨一些困難。【
【發明內容】
】
[0007]經過研究發現，目前在臨床和實驗中，對微球熒光信號的處理方法是先將激發出的微球熒光信號通過一系列二向色鏡和濾光片，再用光電倍增管(PMT)進行收集。這種方法具有其局限性，(I)當系統的二向色鏡和濾光片確定之后，系統所能接收的熒光波段也就確定了，使得應用中只能選擇一些特定波段的熒光物質進行編碼；(2)由于相鄰波段的熒光光譜有重疊區域，因此在解調時需要采用經驗補償的方法對重疊區熒光強度進行補償，這樣就影響了系統的檢測精度；(3)根據檢測的需要，同一批次制備的每個微球熒光發光強度必須十分均一，而且需要考慮在儲存過程中微球熒光物質的漂白、猝滅等問題，使得熒光微球的制備與儲存具有較高的難度，否則由于同一批次規格的熒光微球的熒光強度不一致，在計算機進行分析時，可能會出現解碼錯誤。
[0008]為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種熒光編碼微球的解碼方法及系統。
[0009]熒光編碼微球的解碼方法，包括如下步驟:
[0010]激發步驟，用激光對某個熒光微球進行照射；
[0011]接收步驟，接收所述某個熒光微球被激光激發后發出的光譜波形；
[0012]判定步驟，在參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形中，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形，判定所述某個熒光微球為所述某個參考光譜波形對應的參考突光微球。 [0013]在一個實施例中，還包括如下步驟:
[0014]將所述光譜波形分別與參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形進行相關運算，將與所述光譜波形相關程度最高的參考光譜波形判定為最為接近的某個參考光譜波形。
[0015]在一個實施例中，將所述光譜波形進行歸一化后進行所述判定步驟。
[0016]在一個實施例中，還包括如下步驟:
[0017]分別用激光對同一批次的多個熒光微球進行照射；
[0018]分別接收所述同一批次的多個熒光微球被激光激發后發出的對應光譜波形；
[0019]將多個所述對應光譜波形進行平均后作為所述參考光譜波形庫中的參考光譜波形。
[0020]在一個實施例中，還包括如下步驟:
[0021]將多個所述對應光譜波形進行平均后的波形進行歸一化作為所述參考光譜波形庫中的參考光譜波形。
[0022]在一個實施例中，所述參考光譜波形庫中的任意兩個參考光譜波形之間的相關系數小于設定相關系數。
[0023]本發明還提供了一種熒光編碼微球的解碼系統，包括:激光源、第一透鏡、處理器、線陣光電探測器、色散裝置、第二透鏡、二向色鏡和第三透鏡；
[0024]所述激光源發出的激光經過所述第一透鏡準直后，被所述二向色鏡反射，然后經過所述第三透鏡的聚焦后照射到某個熒光微球；
[0025]所述某個熒光微球被激光激發發出的熒光經過所述第三透鏡的準直后，透過所述二向色鏡，然后經過所述第二透鏡的聚焦，并經過色散裝置的作用被所述線陣光電探測器接收而得到熒光的光譜波形；
[0026]所述處理器用于，在參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形中，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形，判定所述某個熒光微球為所述某個參考光譜波形對應的參考突光微球。
[0027]在一個實施例中，還包括掃描裝置，所述掃描裝置用于，對經過所述二向色鏡反射的激光進行移動，使得經過所述第三透鏡聚焦的激光依次照射到不同的熒光微球上。
[0028]在一個實施例中，所述處理器還用于，將所述光譜波形分別與參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形進行相關運算，將與所述光譜波形相關程度最高的參考光譜波形判定為最為接近的某個參考光譜波形。
[0029]在一個實施例中，所述處理器還用于，將所述光譜波形進行歸一化后，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形。
[0030]在一個實施例中，所述處理器還用于，將多個熒光微球對應的光譜波形進行平均后的波形進行歸一化作為所述參考光譜波形庫中的參考光譜波形。
[0031 ] 在一個實施例中，所述參考光譜波形庫中的任意兩個參考光譜波形之間的相關系數小于設定相關系數。
[0032]一些實施例的熒光編碼微球的解碼方法及系統，由于線陣光電探測器接收的是整個可見光波段的光譜信息，對熒光物質的中心波長沒有限制，因此可以利用更多的熒光物質對微球進行編碼；從另一個方面講，采用光譜波形對微球進行編碼和解碼提高了判別熒光微球的準確度；由于不需要利用精確的光強來判別解碼突光微球，所以同一批次突光微球的發光強度不需要嚴格一致，使得制備、運輸和保存熒光微球更加簡單；另外，采用相關運算可以區分出差別很小的光譜波形，因而可以采用更多的波形碼，即是說增加了微球編碼的數目。
【【專利附圖】
【附圖說明】】
[0033]圖1是本發明一種實施例的同一批次的多個熒光微球受激發得到的光譜波形曲線圖；
[0034]圖2是對圖1的光譜波形進行歸一化處理得到的歸一化光譜波形曲線圖；
[0035]圖3是4種歸一化參考光譜波形圖；
[0036]圖4是第一批次的熒光微球受激發后的光譜波形圖；
[0037]圖5是第二批次的熒光微球受激發后的光譜波形圖；
[0038]圖6是第三批次的熒光微球受激發后的光譜波形圖；
[0039]圖7是第四批次的熒光微球受激發后的光譜波形圖；
[0040]圖8是將四個批次的熒光微球的光譜波形歸一化后放在同一個坐標系中的波形圖；
[0041]圖9是本發明一種實施例的突光編碼微球的解碼系統。
【【具體實施方式】】 [0042]以下對發明的較佳實施例作進一步詳細說明。
[0043]經過大量的實驗發現，盡管同一批次制備的熒光微球被激發后發出的熒光信號的亮度不一樣，但這一批次的熒光微球被激發后發射出的熒光光譜具有很高的相似度。
[0044]如圖1所示，是用激光對同一批次的多個熒光微球進行激發得到的對應的一系列光譜波形曲線圖，其中，橫坐標表示像素，縱坐標表示熒光的強度，從圖中可以看出，雖然熒光微球受激發而發出的熒光的強度相差較大，但是，光譜波形的形狀大致相同，如圖2所示，對圖1所示的一系列光譜波形進行歸一化處理，得到光譜波形的歸一化光譜波形曲線圖，從圖2則可以更加清晰地看出，這一系列的歸一化光譜波形圖的形狀非常接近，因此，歸一化光譜波形可以作為參考光譜波形，如果某個熒光微球受到激光激發后的光譜波形與該參考光譜波形接近，則將該熒光微球判別為屬于該參考光譜波形對應的熒光微球，即完成了對熒光微球的解碼。
[0045]可以建立一個參考光譜波形庫，里面包含有多個參考光譜波形，每一個參考波形代表一個編碼，在判別某個熒光微球屬于哪種熒光微球時，在參考光譜波形庫中，選擇與這個熒光微球的光譜波形最為接近的某個參考光譜波形，該熒光微球即屬于所述某個參考光譜波形對應的熒光微球。
[0046]當然，參考光譜波形并不局限于上述的歸一化光譜波形，也可以利用比較標準的熒光微球激發的光譜波形作為參考光譜波形，或者對同一批次的多個熒光微球激發的光譜波形相加后取平均后作為參考光譜波形，或者對同一批次的多個熒光微球激發的光譜波形相加后取平均后再進行歸一化的波形作為參考光譜波形。
[0047]參考光譜波形也并不局限于連續的波形，只要采樣得到的離散光譜波形能夠一定程度反映熒光信號的光譜特征，就可以作為參考光譜波形。拿線陣光電探測器來說，根據線陣光電探測器陣列單元的數目不同，采樣得到的光譜波形離散程度不同，采樣的精度也不同。
[0048]在另一個實施例中，還可以通過相關運算來判斷某個光譜波形與哪個參考光譜波形最為接近，將與該光譜波形最為相關的某個參考光譜波形判別為最為接近的參考光譜波形。更為具體的實施例中，通過分別計算該光譜波形與參考光譜波形的相關系數，并選取相關系數最大時對應的參考光譜波形作為最為接近的參考光譜波形。
[0049]在一個更為具體的實施例中，可以采用如下的相關運算算法計算相關系數。
[0050]在數學上，兩個函數的相關性可以用相關函數來描述。相關函數是描述兩組信號之間相似性的一種量度。對于兩個隨機序列，其相關函數定義為:
[0051]Rxy [n] = E{x[k]y[k+n]} (I)；,
[0052]其中Rxy[n]表示y [k]延遲η個序列后與x[k]的相關函數值。
[0053]相關系數是對相關函數進行歸一化處理，相關系數值可作為判定兩個隨機序列相似程度的一個指標，其表達式為:
【權利要求】
1.熒光編碼微球的解碼方法，其特征是，包括如下步驟: 激發步驟，用激光對某個熒光微球進行照射； 接收步驟，接收所述某個熒光微球被激光激發后發出的光譜波形； 判定步驟，在參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形中，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形，判定所述某個熒光微球為所述某個參考光譜波形對應的參考熒光微球。
2.如權利要求1所述的熒光編碼微球的解碼方法，其特征是，還包括如下步驟:將所述光譜波形分別與參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形進行相關運算，將與所述光譜波形相關程度最高的參考光譜波形判定為最為接近的某個參考光譜波形。
3.如權利要求1所述的熒光編碼微球的解碼方法，其特征是，將所述光譜波形進行歸一化后進行所述判定步驟。
4.如權利要求1所述的熒光編碼微球的解碼方法，其特征是，還包括如下步驟: 分別用激光對同一批次的多個熒光微球進行照射； 分別接收所述同一批次的多個熒光微球被激光激發后發出的對應光譜波形； 將多個所述對應光譜波形進行平均后作為所述參考光譜波形庫中的參考光譜波形。
5.如權利要求4所述的熒光編碼微球的解碼方法，其特征是，還包括如下步驟: 將多個所述對應光譜波形進行平均后的波形進行歸一化作為所述參考光譜波形庫中的參考光譜波形。
6.如權利要求1、4或5所述的熒光編碼微球的解碼方法，其特征是: 所述參考光譜波形庫中的任意兩個參考光譜波形之間的相關系數小于設定相關系數。
7.一種熒光編碼微球的解碼系統，其特征是，包括:激光源、第一透鏡、處理器、線陣光電探測器、色散裝置、第二透鏡、二向色鏡和第三透鏡； 所述激光源發出的激光經過所述第一透鏡準直后，被所述二向色鏡反射，然后經過所述第三透鏡的聚焦后照射到某個熒光微球； 所述某個熒光微球被激光激發發出的熒光經過所述第三透鏡的準直后，透過所述二向色鏡，然后經過所述第二透鏡的聚焦，并經過色散裝置的作用被所述線陣光電探測器接收而得到熒光的光譜波形； 所述處理器用于，在參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形中，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形，判定所述某個熒光微球為所述某個參考光譜波形對應的參考突光微球。
8.如權利要求7所述的熒光編碼微球的解碼系統，其特征是，還包括掃描裝置，所述掃描裝置用于，對經過所述二向色鏡反射的激光進行移動，使得經過所述第三透鏡聚焦的激光依次照射到不同的熒光微球上。
9.如權利要求7所述的熒光編碼微球的解碼系統，其特征是: 所述處理器還用于，將所述光譜波形分別與參考光譜波形庫中的多個參考光譜波形進行相關運算，將與所述光譜波形相關程度最高的參考光譜波形判定為最為接近的某個參考光譜波形。
10.如權利要求7所述的熒光編碼微球的解碼系統，其特征是:所述處理器還用于，將所述光譜波形進行歸一化后，選擇與所述光譜波形最為接近的某個參考光譜波形。
11.如權利要求7所述的熒光編碼微球的解碼系統，其特征是: 所述處理器還用于，將多個熒光微球對應的光譜波形進行平均后的波形進行歸一化作為所述參考光譜波形庫中的參考光譜波形。
12.如權利要求7所述的熒光編碼微球的解碼系統，其特征是: 所述參考光譜波形庫中的任意 兩個參考光譜波形之間的相關系數小于設定相關系數。
【文檔編號】G01N21/64GK103983625SQ201410206932
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月15日 優先權日:2014年5月15日
【發明者】王東風, 何永紅, 朱亮, 李國花, 孫樹清, 馬輝 申請人:清華大學深圳研究生院