膠原纖維負載釀酒酵母作為生物傳感器識別元件快速測定bod的方法

膠原纖維負載釀酒酵母作為生物傳感器識別元件快速測定bod的方法
【專利摘要】本發明公開了屬于生物傳感器領域的以膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法。該方法包括選擇膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件、制備膠原纖維負載釀酒酵母生物敏感膜的工藝、利用膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件對BOD的快速測定方法，以及固定化生物敏感膜的保存和活化方法。本發明拓寬了微生物傳感器領域中微生物的固定化材料；這種微生物膜具有透水性好、傳質效果好、釀酒酵母活性高、穩定性強等優點，其良好的透水性和傳質性能使得BOD微生物傳感器的制作成本大大降低，同時使得傳感器具有較大的測量范圍。由此膜組成的生化需氧量生物傳感器對GGA標準液的響應范圍為BOD510-250mg/L，響應時間為3-15min，微生物膜可連續使用150次以上。
【專利說明】膠原纖維負載釀酒酵母作為生物傳感器識別元件快速測定BOD的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物傳感器領域，提供了用于生化需氧量生物傳感器的膠原纖維負載釀酒酵母生物敏感膜的制備及其使用方法。
【背景技術】
[0002]BOD (生化需氧量)是表示水中有機物經微生物生化作用分解時所消耗的溶解氧量，是水質監測中十分重要的一項指標。BOD值越高表示水中的有機物含量越高，水體被污染程度越嚴重。常規的BOD值測定方法是5日生化需氧量接種稀釋法出005法)，即樣品在20±1°C的條件下培養5d，測定樣品培養前后的溶解氧，兩者之差即為5日生化需氧量。由于此法具有分析周期長，操作復雜，重現性差，不宜現場監測等不足，國內外研究者提出了高溫法、紫外光譜法、檢壓式庫侖計法、活性污泥曝氣降解法、微生物傳感器法等檢測水樣BOD的方法，其中微生物傳感器法具有測定周期短、測量精度高、重現性好、能夠連續在線監測等優點。
[0003]微生物傳感器主要由固定化微生物和信號轉換裝置組成，其中微生物敏感膜對傳感器的靈敏度、穩定性、使用壽命、測量范圍、響應時間等性能有著決定性的影響，是BOD微生物傳感器研究的核心內容。多年來，各國學者對此做了諸多嘗試，探索出了吸附法、夾層法、交聯法和包埋法等微生物固定化方法，常用到的固定化材料有聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇、醋酸纖維膜、異氰酸鹽、氨基硅烷等。但這些方法普遍存在著細胞滲漏、抑制細胞活性、膜堵塞等不足，從而影響了傳感器的穩定性、使用壽命、測量范圍等性能。
[0004]由上述材料制備的微生物膜還存在著以下兩方面的問題:
其一，由于常用固定化材料的通透性較差，傳感器中氧電極測量的溶解氧含量遠遠小于測試水樣中的真實溶解氧含量，使得電信號減弱了 3-6個數量級。所以組成傳感器時需要靈敏度較高的溶解氧儀器的支持，這就使得整體傳感器的成本大幅上升；
其二，BOD微生物傳感器的測量范圍受固定化微生物細胞的數量及活性和固定微生物材料傳質性能的影響。以往研究中所用的材料大多以犧牲固定化微生物細胞活性來提高固定化數量及材料的傳質性能，不能很好平衡或解決它們之間的矛盾，導致傳感器測量范圍較窄，一般僅能到幾十毫克每升，低于城市污水的BOD水平，測量時需要對被測樣進行稀釋。
[0005]膠原纖維是一種天然高分子材料，是牛、羊、豬等動物皮經清洗、堿處理、剖皮、脫堿、脫水、干燥、研磨等工序處理后制成，具有機械性能好、耐曝氣強度高、傳質效果好、透水性及持水性能好、成本低廉、生物相容性好、酸堿適應范圍廣等優點。經金屬離子改性后，膠原纖維在保持原有優點基礎上獲得了較好的耐生物降解性和熱穩定性。金屬離子改性后的膠原纖維對微生物具有較強的吸附能力，有研究表明經改性后的膠原纖維固定化的釀酒酵母具有較游離釀酒酵母更好的發酵性能，說明膠原纖維固定化釀酒酵母具有更高的生物活性。[0006]本專利針對現有BOD生物傳感器存在的問題，以膠原纖維固定化酵母細胞為響應元件制備BOD微生物傳感器，經試驗得到微生物敏感膜的制備技術及使用方法，并確定該傳感器的測量范圍、響應時間、使用壽命等性能。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種以膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法，其特征在于，該方法包括選擇膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件，制備膠原纖維負載釀酒酵母生物敏感膜的方法，利用膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件對BOD的快速測定方法，以及該固定化釀酒酵母的保存方法和該微生物敏感膜的活化方法;
所述膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件的原因如下:
1)膠原纖維作為一種天然高分子材料，具有機械性能好、耐曝氣強度高、透水及持水性能好、傳質效果好、成本低廉、生物相容性好、酸堿適應范圍廣等優點；
2)經金屬離子改性后的膠原纖維在保持膠原纖維原有優良性能的基礎上，更具備了良好的耐熱性和耐生物降解性；
3)金屬離子改后的膠原纖維對微生物表現出較強的吸附性能，且金屬離子鋯(Zr)改性后膠原纖維作為載體固定化釀酒酵母具有較游離釀酒酵母更強的發酵性能，即更高的生物活性；
4)良好的透水性使得由該材料制備的BOD微生物傳感器無需高精度的溶解氧儀，可大大降低傳感器的設備成本；
5)良好的傳質效果使得由該材料制備的BOD微生物傳感器具有較寬的測量范圍，減少實際測量中的稀釋過程；
6)膠原纖維負載釀酒酵母具有使用壽命長、固定化微生物保存和活化方法簡單的特點。
[0008]所述金屬離子鋯(Zr)改性膠原纖維固定化載體(ZICF)由已有方法制備(發明專利:膠原纖維固載金屬離子吸附材料及其制備方法和用途，專利號:200410040145.0)。
[0009]所述固定化釀酒酵母的制備方法:稱取干重0.5g ZICF置于無菌水中浸泡5_12h。釀酒酵母經液體PDA培養基活化培養后(30°C，震蕩培養30-36h)，經離心、無菌水清洗后收集細胞于生理鹽水中制得菌懸液，并調節菌懸液濃度為106-109cfu/mL。將ZICF過濾后加入上述菌懸液中，震蕩吸附5h后用無菌水清洗至無游離菌檢出，即得膠原纖維固定化釀酒酵母。
[0010]所述生物敏感膜的制備方法:每次稱量濕重為0.60-0.90g的膠原纖維固定化釀酒酵母，將固定化釀酒酵母置于兩層200目尼龍網之間，使之形成一層膠原纖維膜，即微生物膜，使用時將該膜緊貼于溶解氧電極頭前的半透膜上。
[0011]所述利用膠原纖維負載釀酒酵母作為生物敏感膜對BOD的快速測定方法:測量時，將附有固定化釀酒酵母的溶解氧電極頭置于盛有0.07mol/L磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀緩沖液的測量杯中，以24L/h的曝氣強度對緩沖液進行曝氣，測量溫度為30°C、pH為6，無機鹽離子濃度范圍為0-3.5% ;待溶解氧(DO)值達到穩定后加入樣品，固定化微生物分解樣品中的有機物導致水中溶解氧下降到另一個穩定值，求得前后兩次溶氧值之差，通過標準曲線計算所測水樣的BOD值。
[0012]所述固定化釀酒酵母的保存方法:膠原纖維固定化釀酒酵母在0.07 mol/L磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀緩沖液中，PH為6，4 °C條件下保存4個月后其活性仍然良好。
[0013]所述固定化釀酒酵母的活化方法:將存于4°C條件下的固定化釀酒酵母在30°C條件下于原溶液中放置24h。組成BOD傳感器后對濃度為50mg/L的GGA溶液反復測定8_10次，DO下降值連續5次相對偏差小于5%，即完成固定化釀酒酵母的活化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是BOD5為10-250mg/L范圍的GGA溶液的標準曲線。
【具體實施方式】
[0015]實例1:以本發明提出的膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件，對不同濃度的GGA (葡萄糖谷氨酸)溶液的測定。
[0016]分別配置BOD5濃度為5、10、25、50、75、125、150、175、200、225、250、275、300mg/L
的GGA溶液，用膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件與溶解氧電極結合組成BOD微生物傳感器，測定上述濃度的GGA溶液。測定條件為:溫度30°C，pH=6,曝氣強度24h/L，磁力攪拌子轉速使溶氧顯示值在4-7mg/L。
[0017]測定結果表明，DO下降值與樣品BOD濃度之間具有良好的線性關系，在BOD5濃度10-250mg/L范圍內，線性相關系數大于0.995，滿足BOD測量的精度要求。
[0018]實例2:以本發明提出的膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件，在30°C、pH為6，曝氣強度24L/h條件下對BOD5值為30mg/L、50mg/L、100 mg/L的GGA溶液進行測定，測定傳感器的結果重現性，結果如表1所示:
表1傳感器重現性測定結果
【權利要求】
1.一種以膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法，其特征在于，該方法包括選擇膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件、制備膠原纖維負載釀酒酵母生物敏感膜的工藝和利用膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件對BOD的快速測定，以及該固定化釀酒酵母的保存方法和該微生物敏感膜的活化方法。
2.權利要求1所述以膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法，其特征在于，所述的微生物固定化載體為金屬離子鋯(Zr)改性后的膠原纖維(ZICF)。
3.權利要求1所述以膠原纖維負載釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法，其特征在于，所述的固定化微生物種類為釀酒酵母。
4.權利要求1所述膠原纖維負載釀酒酵母的制備:稱取干重0.5gZICF置于無菌水中浸泡5-12h ;釀酒酵母經液體PDA培養基活化培養后(30°C，震蕩培養30_36h)，經離心、無菌水清洗后收集細胞于生理鹽水中制得菌懸液，并調節菌懸液濃度為106-109cfu/mL ;將ZICF過濾后加入上述菌懸液中，震蕩吸附5h后用無菌水清洗至無游離菌檢出，即得膠原纖維固定化釀酒酵母。
5.權利要求1所述膠原纖維負載釀酒酵母生物敏感膜的制備:每次稱量濕重為0.60-0.90g的膠原纖維固定化釀酒酵母，將固定化釀酒酵母置于兩層200目尼龍網之間，使之形成一層膠原纖維膜，即微生物膜，使用時將該膜緊貼于溶解氧電極頭前的半透膜上。
6.權利要求1所述利用膠原纖維負載釀酒酵母作為生物敏感膜對BOD的快速測定:測量時，將附有固定化釀酒酵母的溶解氧電極頭置于盛有0.07mol/L磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀緩沖液的測量杯中，以24L/h的曝氣強度對緩沖液進行曝氣，測量溫度為30°C、pH為6，無機鹽離子濃度范圍為0-3.5%，待溶解氧值達到穩定后加入樣品，固定化微生物分解樣品中的有機物導致水中溶解氧下降到另一個穩定值，求得前后兩次溶氧值之差，通過標準曲線計算所測水樣的BOD值。
7.權利要求1所述的膠原纖維負載釀酒酵母的保存方法，其特征在于，膠原纖維負載釀酒酵母的保存條件為0.07mol/L磷酸鹽緩沖液，pH為6，溫度4°C。
8.權利要求1所述的膠原纖維負載釀酒酵母的活化方法，其特征在于，膠原纖維負載釀酒酵母的活化方法為:將存于4 °C條件下的固定化釀酒酵母在30 °C條件下于原溶液中放置24h ;組成BOD傳感器后對濃度為50mg/L的GGA溶液反復測定8_10次，DO下降值連續5次相對偏差小于5%，即完成固定化釀酒酵母的活化。
【文檔編號】G01N27/26GK103969303SQ201410204412
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月15日 優先權日:2014年5月15日
【發明者】不公告發明人 申請人:四川農業大學