基于牛血清白蛋白-納米鉑模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法
【專利摘要】本發明公開一種基于牛血清白蛋白-納米鉑模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其是將Tris-鹽酸緩沖液、乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶混合溫浴后再加入膽堿氧化酶、N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-納米鉑混合溫浴。反應體系中乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解生成膽堿，膽堿氧化酶催化氧化膽堿生成過氧化氫，牛血清白蛋白-納米鉑催化過氧化氫氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽與4-氨基安替比林形成紫色產物，該顯色產物的最大吸收峰為550nm。顯色產物在550nm處吸光度與乙酰膽堿濃度在10~200μmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為2.84μmol/L。該方法可用于血漿中乙酰膽堿的測定。
【專利說明】基于牛血清白蛋白-納米鉑模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及以牛血清白蛋白-納米鉬作為模擬過氧化物酶，催化過氧化氫氧化N-乙基-N- (3-磺丙基)-3_甲基苯胺鈉鹽與4-氨基安替比林，形成穩定的紫色顯色產物，測定乙酰膽堿的紫外可見分析方法，屬于分析化學和納米【技術領域】。
【背景技術】
[0002]乙酰膽堿是一種神經遞質，能特異性地作用于各類膽堿受體，在組織內能被膽堿酯酶水解破壞，其作用廣泛，對神經系統，心血管系統及胃腸道等都有明顯作用。在神經細胞中，乙酰膽堿是由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶的催化作用下合成的。中樞膽堿能系統與學習、記憶密切相關，乙酰膽堿是中樞膽堿能系統中重要的神經遞質之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起重要作用。腦內的乙酰膽堿與認知活動，神經信號的傳遞密切相關，研究認為體內該物質含量與阿爾茲海默病的癥狀改善顯著相關。所以對乙酰膽堿的檢測具有非常重要的意義。
[0003]乙酰膽堿酯酶可以選擇性水解乙酰膽堿，能使乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，再通過膽堿氧化酶氧化膽堿乙酰膽堿生成過氧化氫，過氧化物酶可催化過氧化氫氧化過氧化物酶底物顯色。本發明以生物蛋白分子牛血清白蛋白為模板，通過生物礦化作用，制備出具有模擬過氧化物酶活性的牛血清白蛋白-納米鉬。與天然過氧化物酶相比，牛血清白蛋白-納米鉬具有制備簡單、經濟、快捷、耐高溫、耐酸堿、性質穩定等諸多優勢，可替代天然過氧化物酶用于乙酰膽堿的測定。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是基于牛血清白蛋白-納米鉬良好的模擬過氧化物酶活性，結合乙酰膽堿酯酶可以選擇性水解乙酰膽堿成膽堿和乙酸，再通過膽堿氧化酶氧化膽堿生成過氧化氫的過程，提供了一種牛血清白蛋白-納米鉬催化過氧化氫氧化N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽與4-氨基安替比林形成紫色顯色產物，并通過紫外可見分光光度法測定550 nm處吸光度定量檢測乙酰膽堿的新方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是利用乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解生成膽堿，膽堿氧化酶催化膽堿氧化生成過氧化氫，牛血清白蛋白-納米鉬催化過氧化氫氧化N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽)與4-氨基安替比林形成紫色產物以鑒定乙酰膽堿。
[0006]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-鹽酸緩沖溶液、乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶，溫浴后加入膽堿氧化酶、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-納米鉬，將混合液放入恒溫水浴中反應，生成紫色產物，用紫外可見分光光度計測定反應產物的吸光度以測定乙酰膽堿。
[0007]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是反應生成紫色產物的最大吸收峰為550 nm。
[0008]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是牛血清白蛋白-納米鉬采用以下制備方法制得:在5 mL濃度為50 mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL濃度為16 mmol/L的氯鉬酸水溶液，混勻后加入0.5 mL濃度為1.5mol/L氫氧化鈉水溶液，80 1:水浴加熱2小時，所得溶液經過超濾并水洗，得到牛血清白蛋白-納米鉬水溶液。反應后溶液裝入截止分子量為3k的超濾離心管,6000 r/min離心超濾，并水洗3次。
[0009]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是乙酰膽堿的水解反應體系pH值為7.5，反應溫度為37 °C，反應時間為30分鐘。
[0010]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是恒溫水浴中反應體系中N-乙基-N- (3-橫丙基)-3-甲基苯胺納鹽的濃度為0.2 mmol/L，4-氨基安替比林的濃度為4.2 mmol/L，牛血清白蛋白-納米鉬的濃度為9 ymol/L，膽堿氧化酶的濃度為0.125 U/mL。
[0011]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是恒溫水浴中反應體系的反應溫度為30 °C，反應時間為80分鐘。
[0012]本發明所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬的乙酰膽堿測定方法，其特征是將0.8mL不同濃度的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L、pH=7.5的Tris-鹽酸緩沖液中，混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度，以吸光度對乙酰膽堿濃度作圖得到標準曲線，吸光度與乙酰膽堿濃度在10?200 Mmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為2.84 Mmol/L。
[0013]本發明所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬測定血漿乙酰膽堿的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-鹽酸緩沖溶液、血漿樣品、乙酰膽堿酯酶，溫浴后加入膽堿氧化酶、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-納米鉬形成混合液，將混合液放入恒溫水浴中反應，用紫外可見分光光度計測定在550 nm的紫外吸收，根據乙酰膽堿標準曲線計算血漿中乙酰膽堿含量。
[0014]所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬測定血漿乙酰膽堿的方法，其特征是將0.4mL血漿樣品，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到1.35 mL濃度為50 mmol/L、pH=7.5的Tris-鹽酸緩沖液中，所形成的混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度，根據乙酰膽堿標準曲線計算血漿中乙酰膽堿含量
具體地說，本發明采用以下技術方案:(一)牛血清白蛋白-納米鉬的制備:
在50 mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L的氯鉬酸水溶液,混勻后加入1.5mol/L氫氧化鈉水溶液，80 1:水浴加熱2小時。所得溶液經過超濾并水洗，得到牛血清白蛋白-納米鉬水溶液。反應后溶液裝入截止分子量為3k的超濾離心管,6000 r/min離心超濾，并水洗3次。以上過程中使用的所有玻璃器皿均經過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。
[0015](二)乙酰膽堿的測定
在EP管中依次加入Tris-鹽酸緩沖溶液、乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶，將混合液置于37°C恒溫水浴反應30分鐘。30分鐘后，依次向EP管加入膽堿氧化酶，N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-納米鉬，將混合液放入30 °C恒溫水浴中反應80分鐘。用紫外可見分光光度計測定反應產物在550 nm處的吸光度，以吸光度對乙酰膽堿濃度作圖得到標準曲線。
[0016](三)血漿中乙酰膽堿的測定
將乙酰膽堿替換為血漿樣品重復步驟二，將所得吸光度代入標準曲線，得到血漿樣品中乙酰膽堿的含量。
[0017]本發明的優點:
本發明利用牛血清白蛋白-納米鉬良好的模擬過氧化物酶活性，結合乙酰膽堿酯酶催化水解乙酰膽堿和膽堿氧化酶氧化膽堿生成過氧化氫的過程，提供了一種牛血清白蛋白-納米鉬催化過氧化氫氧化N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽與4-氨基安替比林形成穩定的紫色產物，并通過紫外可見分光光度法測定顯色產物在550 nm的吸光度，從而定量檢測乙酰膽堿的新方法。該技術測定乙酰膽堿的線性范圍為1(T200 Mmol/L，檢測限為2.84 Mmol/L。本發明方法具有穩定性好，靈敏度高，樣品需求量少，重現性好，成本低等優點，可應用于血漿樣品中乙酰膽堿的測定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為顯色體系的外觀圖，圖中a是在沒有牛血清白蛋白-納米鉬存在時，不發生顯色反應，溶液為透明無色，圖中b是在牛血清白蛋白-納米鉬存在時，發生顯色反應，溶液為紫色。
[0019]圖2為顯色體系的紫外吸收光譜圖。
[0020]圖3為N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽濃度對顯色體系的影響圖。
[0021]圖4為4-氨基安替比林濃度對顯色體系的影響圖。
[0022]圖5為牛血清白蛋白-納米鉬濃度對顯色體系的影響圖。
[0023]圖6為膽堿氧化酶濃度對顯色體系的影響圖。
[0024]圖7為顯色反應溫度對顯色體系的影響圖。
[0025]圖8為顯色反應時間對顯色體系的影響圖。
[0026]圖9為乙酰膽堿水解時間對顯色體系的影像圖。
[0027]圖10為多巴胺，血清素，甘氨酸，天冬氨酸，谷胱甘肽及乙酰膽堿的顯色反應吸光度對比圖。
[0028]圖11為乙酰膽堿的標準曲線圖。
[0029]圖12為血漿中乙酰膽堿和緩沖液中乙酰膽堿的線性相關圖。【具體實施方式】
[0030]實例1:
牛血清白蛋白-納米鉬的制備:在5 mL濃度為50 mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL濃度為16 mmol/L的氯鉬酸水溶液,混勻后加入0.5 1^濃度為1.5 mol/L氫氧化鈉水溶液，80 1:水浴加熱2小時。反應后溶液裝入截止分子量為3k的超濾管，6000 r/min離心超濾，并水洗3次。
[0031]實例2:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后觀察顯色體系的顏色變化。如圖1所示，圖中a是在沒有牛血清白蛋白-納米鉬存在時，不發生顯色反應，溶液為透明無色，圖中b是在牛血清白蛋白-納米鉬存在時，發生顯色反應，溶液為紫色。
[0032]實例3:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物的紫外可見吸收光譜。如圖2所示，顯色產物的最大吸收峰為550 nm。
[0033]實例4:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 °C溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL不同濃度(0.1~2.0 mmol/L)的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21mmol/L的4-氨基安替比林,0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴，80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖3所示，吸光度隨著N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽濃度的增大而增大，并在N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽的終濃度為0.2 mmol/L之后達到最大值。
[0034]實例6:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8mmol/L的N-乙基_N_(3-磺丙基)_3_甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL不同濃度(0.13~26.25 mmol/L)的4-氨基安替比林，0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30°C溫浴，80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖4所示，吸光度隨著4-氨基安替比林濃度的增大而增大，并在4-氨基安替比林的終濃度為4.2 mmol/L之后達到最大值。[0035]實例7:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1 mL不同濃度(0.072、.576 mmol/L)的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴，80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖5所示，吸光度隨牛血清白蛋白-納米鉬濃度的增大而增大，并在牛血清白蛋白-納米鉬的終濃度為9 ymol/L之后達到最大值。
[0036]實例8:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL不同濃度0-2.8 U/mL)的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30°C溫浴，80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖6所示，吸光度隨膽堿氧化酶濃度的增大而增大，并在膽堿氧化酶的終濃度為0.125 U/mL之后達到最大值。
[0037]實例9:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，實例I制備的0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后分別置于不同溫度(2(T50 °C)下溫浴，80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖7所示，吸光度在反應溫度為30 1:時達到最大值。
[0038]實例10:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，實例I制備的0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴不同時間(0-90分鐘)后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖8所示，吸光度隨著反應時間的延長而增大，并在反應時間為80分鐘之后達到最大值。
[0039]實例11:
將0.8 mL濃度為I mmol/L的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到 0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 1:溫浴水解不同反應時間(0-40分鐘)，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)_3_甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，實例I制備的0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖9所示，吸光度隨著乙酰膽堿水解反應時間的延長而增大，并在反應時間為30分鐘之后達到最大值。
[0040]實例12:
將0.8 mL不同的干擾物質,0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，實例I制備的0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 V溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖10所示，與I mmol/L的乙酰膽堿產生的吸光度信號相比，I mmol/L的多巴胺或5 mmol/L血清素或5 mmol/L甘氨酸或5mmol/L天冬氨酸或5 mmol/L谷胱甘肽產生的信號均可忽略不計。
[0041]實例13:
將0.8 mL不同濃度的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，實例I制備的0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 V溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖11所示，以吸光度對乙酰膽堿濃度作圖得到乙酰膽堿標準曲線，吸光度與膽堿濃度在1(T200 Mmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為 2.84 Mmol/L。
[0042]實例14:
將0.4 mL加入了不同濃度含乙酰膽堿的血漿樣品，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到1.35 mL濃度為50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH=7.5)中，所形成的混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，實例I制備的0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度。如圖12所示，以吸光度對加入血漿中的乙酰膽堿濃度作圖得到標準曲線，將血漿中回收的乙酰膽堿濃度與實例13中測得的乙酰膽堿濃度作線性相關圖，得到線性相關系數為0.995，且斜率為0.9981，則證實在血漿樣品中能檢測乙酰膽堿。
【權利要求】
1.一種基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是利用乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解生成膽堿，膽堿氧化酶催化膽堿氧化生成過氧化氫，牛血清白蛋白-納米鉬催化過氧化氫氧化N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽)與4-氨基安替比林形成紫色產物以鑒定乙酰膽堿。
2.一種基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-鹽酸緩沖溶液、乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶，溫浴后加入膽堿氧化酶、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-納米鉬，將混合液放入恒溫水浴中反應，生成紫色產物，用紫外可見分光光度計測定反應產物的吸光度以測定乙酰膽堿。
3.根據權利要求1或2所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是反應生成紫色產物的最大吸收峰為550 nm。
4.根據權利要求1或2所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是牛血清白蛋白-納米鉬采用以下制備方法制得:在5 mL濃度為50 mg/ml牛血清白蛋白水 溶液中加入5 mL濃度為16 mmol/L的氯鉬酸水溶液，混勻后加入0.5mL濃度為1.5 mol/L氫氧化鈉水溶液,80 °(:水浴加熱2小時,所得溶液經過超濾并水洗，得到牛血清白蛋白-納米鉬水溶液；反應后溶液裝入截止分子量為3k的超濾離心管，6000r/min離心超濾,并水洗3次。
5.根據權利要求1或2所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是乙酰膽堿的水解反應體系PH值為7.5，反應溫度為37 °C，反應時間為30分鐘。
6.根據權利要求1或2所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽喊的方法，其特征是恒溫水浴中反應體系中N-乙基-N- (3-橫丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽的濃度為0.2 mmol/L，4-氨基安替比林的濃度為4.2 mmol/L，牛血清白蛋白-納米鉬的濃度為9 μ mol/L，膽堿氧化酶的濃度為0.125 U/mL。
7.根據權利要求1或2所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬模擬過氧化物酶測定乙酰膽堿的方法，其特征是恒溫水浴中反應體系的反應溫度為30 °C，反應時間為80分鐘。
8.一種基于牛血清白蛋白-納米鉬的乙酰膽堿測定方法，其特征是將0.8 mL不同濃度的乙酰膽堿，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到0.95 mL濃度為50 mmol/L、pH=7.5的Tris-鹽酸緩沖液中，混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，I mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基_N_( 3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，0.1 mL濃度為0.36mmol/L的牛血清白蛋白-納米鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度，以吸光度對乙酰膽堿濃度作圖得到標準曲線，吸光度與乙酰膽堿濃度在10-200Mmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為2.84 Mmol/L。
9.一種基于牛血清白蛋白-納米鉬測定血漿乙酰膽堿的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-鹽酸緩沖溶液、血漿樣品、乙酰膽堿酯酶，溫浴后加入膽堿氧化酶、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-納米鉬形成混合液，將混合液放入恒溫水浴中反應，用紫外可見分光光度計測定在550 nm的紫外吸收，根據乙酰膽堿標準曲線計算血漿中乙酰膽堿含量。
10.根據權利要求9所述的基于牛血清白蛋白-納米鉬測定血漿乙酰膽堿的方法，其特征是將0.4 mL血漿樣品，0.1 mL濃度為10 U/mL的乙酰膽堿酯酶加入到1.35 mL濃度為50mmol/L、pH=7.5的Tris-鹽酸緩沖液中，所形成的混合液在37 °C溫浴水解反應30分鐘，隨后向混合液中依次加入0.25 mL濃度為2 U/mL的膽堿氧化酶，1mL濃度為0.8 mmol/L的N-乙基-N-( 3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，0.8 mL濃度為21 mmol/L的4-氨基安替比林，.0.1 mL濃度為0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-納米 鉬，混合后在30 °C溫浴80分鐘后測定顯色產物在550 nm處的吸光度，根據乙酰膽堿標準曲線計算血漿中乙酰膽堿含量。
【文檔編號】G01N21/33GK103954616SQ201410200138
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】陳偉, 何少斌, 吳鋼偉, 鄧豪華, 李光文 申請人:福建醫科大學