用于hplc檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑的制作方法
【專利摘要】本發明一種用于HPLC檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑。通過優化樣品預處理方法和調整流動相配方、流動相流動速度、流動相洗脫過程、柱溫、參比電壓、工作電壓和保護池電壓等參數，可快速地、準確地和高靈敏度地檢測樣品中的兒茶酚胺濃度。
【專利說明】用于HPLC檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑，尤其是涉及一種用于HPLC檢 測血液或尿液中兒茶酚胺濃度的試劑。
【背景技術】
[0002] 兒茶酚胺（catecholamines, CAs)是一類含有兒茶酚和胺基的神經類物質，也是 人體內一類重要的信號傳遞物質，均是在腎上腺髓質嗜鉻細胞中的β_羥化酶催化下由苯 丙氨酸和酪氨酸合成而來的。最為重要的兒茶酚胺是多巴胺（dopamine，D0P)、腎上腺素 (adrenaline, ADR)和去甲腎上腺素（noradrenaline, N0R)。不少精神興奮劑也是兒茶酚 胺的類似物。
[0003] 去甲腎上腺素和腎上腺素既是腎上腺髓質所分泌的激素，又是交感神經和中樞神 經系統中去甲腎上腺素能纖維的神經介質。去甲腎上腺素在中樞神經系統內分布廣泛，含 量較多，而腎上腺素含量則較少。多巴胺主要集中在錐體外系部位，也是一種神經介質。它 們是重要的典型的腎上腺素受體激動劑。
[0004] 血液中兒茶酚胺主要來源于交感神經和腎上腺髓質，它們都由尿液排出。測定24 小時尿液中兒茶酚胺濃度可反映交感神經和腎上腺髓質的功能，且有晝夜規律性變化。
[0005] 血漿中兒茶酚胺生理水平很低，正常生理含量為pg( lpg=l(T12g)水平。血漿里兒茶 酚胺水平的變化顯示不同的病態情形。一般通過不正常的兒茶酚胺水平能斷定兩個方面： 首先，涉及到腎上腺髓質瘤，這些瘤結合大量的兒茶酚胺導致循環失常；其次，涉及到心血 管系統。過多的兒茶酚胺分泌可能導致高血壓和心肌梗塞，而低水平的兒茶酚胺可能引起 低血壓、心肌缺血等癥狀的發生。兒茶酚胺含量水平的不同與心臟猝死、冠狀心臟病和心臟 不充血等也有潛在聯系。臨床上，在神經源性、心源性、中毒源性休克的早期，醫生們常用兒 茶酚胺來治療病人以便增加收縮力和擴張外周血管改善微循環。此外，兒茶酚胺也可用于 治療胃出血，通過在胃局部發揮作用導致胃黏膜血管收縮而產生止血效果。然而，兒茶酚胺 治療也會產生不良反應，具體表現為：從血管漏出時會引發局部組織缺血壞死；劑量過大 時會引發急性腎功能衰竭。另外，突然停用兒茶酚胺可出現血壓下降，因此需停用時，應先 逐漸減少劑量和減慢滴速，然后停止使用。
[0006] 鑒于兒茶酚胺不僅直接參與行為活動以及血壓，心率呼吸和睡眠等植物神經功 能調控，而且還與許多功能性疾病如神經分裂癥和憂郁癥以及器官性病變相關聯，因此有 必要對血液和尿液中的兒茶酚胺濃度進行檢測，這不僅可以用于研究它們的生理功能及其 代謝變化，而且還可用于其他與兒茶酚胺相關的疾病的研究，特別有助于原發性高血壓和 嗜鉻細胞瘤的鑒別診斷，同時在利用兒茶酚胺進行休克和胃出血等疾病治療時，實時監控 病人體內的兒茶酚胺水平變化也會盡可能低降低其不良反應。
[0007] 常用的兒茶酚胺檢測方法包括熒光測定、分光光度檢測、放射免疫測定、氣相色譜 法和高效液相色譜法（HPLC)。其中，熒光測定主要涉及三羥基吲哚法，乙二胺縮合法，鄰 苯二胺縮合法和2, 3-二氨基萘衍生化熒光測定法等(董捷，房剛，葉新強.兒茶酚胺類 物質的分析進展.化學分析計量，2001，10(6) :34-37)，都涉及利用加入與兒茶酚胺發生 反應的物質，從而產生熒光物質，通過檢測特定波長處的熒光值來測定兒茶酚胺，但是它們 的靈敏度都不高，而且測定結果容易受到干擾物質的干擾，另外還有些方法只能檢測樣品 中ADR和NOR的總量，但不能檢測DOP的總量。分光光度檢測涉及先讓樣品中的兒茶酚胺 發生多種化學反應而產生顏色變化，然后利用紫外-可見光分光光度計在特定波長下檢測 吸光值（Tayyebeh Madrakian, Abbas Afkhami, Lida Khalafi, et al. Spectrophotometric determination of catecholamines based on their oxidation reaction followed by coupling with 4-aminobenzoic acid. J. Braz. Chem. Soc. , 2006, 17 (7) : 1259?1265 ; J. J. Berzas Nevado, J. M. Lemus Gallego, P. Buitrago Laguna. Spectrophotometric determination of catecholamines with metaperiodate by flow-injection analysis. 1995:293-295)，該方法靈敏度不高，也容易受到樣品中干擾物的 影響而導致測量結果發生偏差。放射免疫測定涉及使用放射性元素，容易對實驗操作者造 成健康風險，同時也會污染環境。氣相色譜法涉及把兒茶酚胺類物質制成硅烷化衍生物三 氯或五氟衍生物，然后用電子捕獲器檢測，雖然適合用于體液中微量兒茶酚胺類物質的分 析，但是它的缺點是需要制備衍生物，此外雖然衍生化反應速度較快，副產物不干擾測定， 但是衍生化試劑遇濕易水解。
[0008] HPLC是在經典液相色譜發展的基礎上，引入了氣相色譜法的理論和實驗技術，以 高壓輸送流動相，采用高靈敏度檢測器，發展而成的現代液相色譜分析方法。比較廣泛應用 的方法就是將HPLC與電化學檢測法、熒光檢測法、質譜法、紫外檢測法的組合應用。
[0009] 高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-υν)雖能分別檢測D0P、ADR和N0R，但是相對而 言，靈敏度還是偏低，不能達到生物樣品檢測目的。高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FD) 也能分別檢測DOP、ADR和N0R，并且具有較好的線性關系，但是熒光檢測前處理復雜，而且 不能將這三種成分完全分開。而高效液相色譜-電化學檢測法（HPLC-E⑶）是將HPLC的 高壓、高速、高效、高靈敏度和應用范圍廣等優點與具有高靈敏度和高選擇性的電化學檢測 器相結合，準確性好，靈敏度高，還具有重現性好、操作簡便、離子對試劑使用量小和色譜 柱壽命長等優點，因而適用于生物組織和體液中微量兒茶酚胺的測定。因此本發明采用 HPLC-E⑶法進行檢測樣品中的兒茶酚胺。
[0010] 在利用HPLC-E⑶檢測諸如血液和尿液之類的樣品中的兒茶酚胺時，需要配置流 動相。為了除去干擾，降低雜峰的產生，所配置的流動相中應當加入一種離子對試劑，如辛 烷磺酸鈉。王忠永、陶志華和楊建榮配置的l〇〇〇ml流動相含有648mg辛烷磺酸鈉(王忠永， 陶志華，楊建榮.RP-HPLC-E⑶檢測血漿尿液中兒茶酚胺及其臨床應用.寧夏醫學雜志， 2003, 25(8) :466-468)。但是辛烷磺酸鈉具有刺激性，皮膚接觸其蒸氣或溶液，可引起皮 炎；眼睛接觸時，可造成眼角膜損傷，因此有必要降低其使用量，同時又不會影響檢測結果 準確性。
[0011] 再者，在利用HPLC-E⑶檢測諸如血液和尿液之類的樣品中的兒茶酚胺時，需要 對樣品進行預處理。現有方法大多采用2~4ml血漿或尿液利用活性氧化鋁吸附或活性氧 化鋁微柱進行預處理，如王忠永、陶志華和楊建榮就分別選擇2ml血漿和2ml尿液進行預 處理，預處理時使用30mg活性氧化鋁吸附血漿和尿液中的兒茶酚胺，然后加入HC10 4溶液 將兒茶酚胺解離（王忠永，陶志華，楊建榮.RP-HPLC-ECD檢測血漿尿液中兒茶酚胺及其 臨床應用.寧夏醫學雜志，2003，25(8):466-468)。廖瑛、單濟川和余斌杰采用2ml尿 液進行預處理，預處理時使用自制的活性氧化鋁微柱，活性氧化鋁使用量在2(T40mg (廖 瑛，單濟川，余斌杰.HPLC-E⑶檢測尿兒茶酚胺方法的優化.中山醫科大學學報，1994， 15 (3) : 227~231 )。袁倚盛、趙飛浪和楊巷菁等選擇4ml尿液進行預處理，預處理時使用微型 氧化鋁柱(袁倚盛，趙飛浪，楊巷菁等.雙柱雙泵高效液相色譜-電化學檢測法測定尿中兒 茶酚胺.色譜，1987, 5(5) :311~313)。這些樣品預處理方法樣品用量和活性氧化鋁用量都 較大，而氧化鋁微柱成本高，難以常規檢測和推廣應用。此外，HC10 4溶液是一種具有極強氧 化性的強酸，具強腐蝕性、強刺激性，可致人體灼傷。另外，在采集血液時，需要加入防凝劑， 以便降低因血液凝固而造成的測量結果不準，而在采集尿液時，需要加入防腐劑，以便阻止 尿液中細菌滋生，從而降低因細菌生長導致尿液中的化學物質發生變化所造成的測量結果 不準。如王忠永、陶志華和楊建榮往采集的血液中加入肝素來防止血液凝固，往采集的尿液 中加入濃鹽酸來阻止尿液中細菌生長(王忠永，陶志華，楊建榮.RP-HPLC-E⑶檢測血漿尿 液中兒茶酚胺及其臨床應用.寧夏醫學雜志，2003, 25(8) :466-468)。但是血液中和尿液 中含有金屬離子，這些離子會與流動相中的EDTA相結合，消耗流動相中的EDTA，從而導致 檢測結果發生偏差。
【發明內容】
[0012] 本發明提供一種用于HPLC檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑，所述試劑包括流 動相，用于樣品預處理的活性氧化鋁、〇. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液，其中，在每 1000ml所述流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70?90ml，辛烷磺酸鈉 0· 08 ?0· 10g，冰醋酸 7. 5ml，其余為 ddH20, pH 值 4. 0 ?4. 3。
[0013] 進一步地，所述HPLC檢測的條件為C18反相色譜柱，流速：0. 2ml/min ;柱溫：38°C; 參比電壓ECDl=-100mV，工作電壓ECD2=100mV，保護池電壓Guard=350mV。
[0014] 進一步地，所述樣品選自血液或尿液，當所述樣品為尿液時，所述試劑還包括用于 樣品預處理的濃鹽酸。
[0015] 進一步地，所述用于樣品預處理的0. 01M EDTA-2Na溶液與所述血液或尿液的體積 比為1:100。
[0016] 進一步地，當所述血液用量為0. 5ml或所述尿液用量為0. 2ml時，所述用于樣品預 處理的活性氧化鋁用量為20?25mg。
[0017] 進一步地，所述預處理過程如下所示： (1) 將所述用量的活性氧化鋁加入到一個試管中，然后加入400 μ 1 Tris-HCl緩沖液； (2) 往0. 5ml血液加入0. 01M EDTA-2Na溶液5 μ 1，或者往0. 2ml尿液中加入20ml濃鹽 酸和0. 01M EDTA-2Na溶液2 μ 1，經離心后，收集血漿或者尿液上清液； (3) 將（2)中收集的血漿或者尿液上清液加入到（1)中的試管內，然后振蕩，離心后，移 除上清液； (4) 往試管中加 ddH20清洗，然后振蕩，離心后，移除上清液，重復4次，然后再次離心 后，將試管中的水吸干； (5) 加入0.2MHC1溶液200 μ 1，然后振蕩，離心后，取10 μ 1上清液作為上樣液，準備上 機檢測。
[0018] 進一步地，所述用于樣品預處理的活性氧化鋁用量為23mg。
[0019] 進一步地，所述流動相中辛燒磺酸鈉的用量為0. 08g。
[0020] 進一步地,所述流動相中乙腈的用量為80ml。
[0021] 進一步地，所述流動相中的pH值為4. 0。
[0022] 進一步地，每1000ml所述流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA_2Na 0. 05g，乙腈 80ml，辛烷磺酸鈉0· 08g，冰醋酸7. 5ml，其余為ddH20, pH值4· 0。
[0023] 本發明的有益效果：本發明采用HPLC-ECD檢測諸如血液和尿液之類的樣品中的 兒茶酚胺濃度，只需使用〇. 5ml血液，0. 2ml尿液，就可準確獲得檢測結果，同時利用本發明 的樣品預處理方法，調整活性氧化鋁用量，用鹽酸替代HC104溶液，并調整流動相配方、流動 相流動速度、流動相洗脫過程和柱溫等參數，從而顯著地降低樣品用量和辛烷磺酸鈉用量， 從而提高了檢測準確性，靈敏度，降低了檢測時間，而且簡便易操作，成本下降，同時降低環 境污染。
[0024] 再者，通過分別往收集的血液和尿液中加入EDTA，不僅可以起到防止血液凝固的 作用，而且還可以與血液和尿液中的金屬離子相結合，從而阻止這些金屬離子消耗流動中 的EDTA組分，提高檢測效果。
[0025] 此外，當利用經過預處理的樣品上機進行HPLC-E⑶檢測時，10 μ 1上樣液先經過 保護池，在保護池電壓的作用下，將樣品中的干擾物質氧化，從而有助降低這些干擾物的影 響，提高檢測結果的準確性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1.流動相配方1時的譜圖。譜圖中，峰上方數值的表示分隔符，前面 的"1"、"2"和"3"分別代表去甲腎上腺素（N0R)、腎上腺素（ADR)和多巴胺（D0P)的峰， 后面的"1.917"、"2. 168"和"2. 908"分別代表去甲腎上腺素（N0R)、腎上腺素（ADR)和多 巴胺（D0P)的出峰時間。以下皆同。
[0027] 圖2.流動相配方2時的譜圖。
[0028] 圖3.流動相配方3時的譜圖。
[0029] 圖4.流動相中辛烷磺酸鈉（B8)=0. 06g時的譜圖。
[0030] 圖5.流動相中辛烷磺酸鈉（B8)=0. 08g時的譜圖。
[0031] 圖6.流動相中辛烷磺酸鈉（B8)=0. 10g時的譜圖。
[0032] 圖7.流動相中辛烷磺酸鈉（B8)=0. 648g時的譜圖。
[0033] 圖8.流動相中乙腈用量為70ml時的譜圖。
[0034] 圖9.流動相中乙腈用量為80ml時的譜圖。
[0035] 圖10.流動相中乙腈用量為90ml時的譜圖。
[0036] 圖11.流動相pH=3. 4時的譜圖。
[0037] 圖12.流動相pH=4. 0時的譜圖。
[0038] 圖13.流動相ρΗ=4· 2時的譜圖。
[0039] 圖14.流動相ρΗ=4· 3時的譜圖。
[0040] 圖15.流動相ρΗ=4. 5時的譜圖。
【具體實施方式】
[0041] 本發明利用HPLC-ECD法檢測樣品中的兒茶酚胺濃度，在檢測中對樣品預處理方 法和流動相配方進行優化，同時對檢測時的相關參數進行調整。在這里，雖然用于預處理的 EDTA鹽和流動相配置的EDTA鹽均為乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na)，但是其他的EDTA鹽也 可發揮類似的作用，尤其是乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K)，只要保證溶液中乙二胺四乙酸根 離子摩爾濃度保持不變即可。此外，用于樣品預處理的濃鹽酸為質量分數超過37%的HC1 溶液，本發明雖然優選質量分數為37. 5%的HC1溶液，但是其他的濃鹽酸也能發揮類似的防 腐作用。
[0042] 下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明 的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，張慶合主編的《高效 液相色譜實用手冊》和維諾尼卡R.邁耶（Veronika R. Meyer)編寫的《實用高效液相色譜》 第五版，或者按照廠商所建議的步驟和條件。
[0043] 實施例1利用HPLC檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑 用于HPLC檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑，所述試劑包括流動相，用于樣品預處理的 活性氧化鋁、0. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液： 每1000ml所述流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA_2Na 0. 05g，乙腈70?90ml, 辛烷磺酸鈉0.08?0.10g，冰醋酸7. 5ml，其余為ddH20, pH值4.0?4. 3。其中乙腈 體積優選為80ml，辛烷磺酸鈉用量優選為0. 08g，流動相pH值優選為4. 0。當所述樣品為 尿液時，所述試劑還包括用于樣品預處理的濃鹽酸。所述濃鹽酸優選質量分數為37. 5%的 HC1溶液。
[0044] 此外，所述試劑還可包括兒茶酚胺標準品、甲腎上腺素（N0R)標準品、腎上腺素 (ADR)標準品、多巴胺（D0P)標準品、內標準品和稀釋液。
[0045] 稀釋液：可選自ddH20、0. 1MHC1等溶液，這里優選0· 1MHC1溶液。
[0046] N0R標準品、ADR標準品、D0P標準品和兒茶酚胺標準品配置如下：去甲腎上腺素 (N0R)、腎上腺素（ADR)和多巴胺（D0P)購買自Sigma-Aldrich公司。分別稱取一定重量的 NOR、ADR、D0P，加入到一定體積的0. 1MHC1溶液中，配置成所需濃度的N0R標準品、ADR標 準品和D0P標準品，需要時利用0. 1M HC1溶液加以稀釋。將同等重量的N0R、ADR、D0P同時 加入到一定體積的〇. 1M HC1溶液中，配置成所需濃度的兒茶酚胺標準品，需要時利用0. 1M HC1溶液加以稀釋。如lOOpprn (lppm=lmg/L)兒茶酚胺標準品，就是將20mg N0R、20mg ADR 和20mg D0P同時加入到200ml的(λ 1M HC1溶液中。
[0047] 內標準品配置：3, 4-二輕基節胺（DHBA)購買自Sigma-Aldrich公司。稱取一定 重量的DHBA，加入到一定體積的0. 1M HC1溶液中，配置成所需濃度的DHBA內標準品，需要 時利用0. 1MHC1溶液加以稀釋。
[0048] 實施例2血液預處理方法 (1)將20?25mg活性氧化錯(購買自Sigma-Aldrich公司）加入到一個試管中，然后 加入400 μ 1 Tris-HCl緩沖液。
[0049] (2)往0· 5ml 血液中按 100:1 體積比例加入 0· 01MEDTA-2Na溶液 5μ 1，在 3500rpm 下離心10min后，收集血漿，待用時4°C保存。
[0050] (3)將⑵中收集的血漿加入到（1)中的試管內，先振蕩5min，再在3500rpm下離 心lOmin，移除上清液； (4) 往試管中加 ddH20清洗，然后振蕩2min，在3500rpm下離心3min，移除上清液，重復 4次，隨后在3500rpm下再離心5min，用棉簽將試管中的水吸干； (5) 往試管中加入0· 2M HC1 200μ 1，振蕩5min，在3500rpm下離心lOmin，取10μ 1上 清液作為上樣液，準備上機檢測。
[0051] 實施例3尿液預處理方法 (1)將20?25mg活性氧化錯（購買自Sigma-Aldrich公司）加入到一個試管中，然后 加入400 μ 1 Tris-HCl緩沖液。
[0052] (2)往0· 2ml尿液中按1:100體積比例加入20ml質量分數為37. 5%的鹽酸溶液， 同時按100:1體積比例加入0. 01M EDTA-2Na溶液2μ 1，在3500rpm下離心lOmin后，收集 上清液。
[0053] (3)取⑵中收集的上清液200μ 1加入到（1)中的試管內，先振蕩5min，再在 3500rpm下離心lOmin,移除上清液； (4) 往試管中加 ddH20清洗，然后振蕩2min，在3500rpm下離心3min，移除上清液，重復 4次，隨后在3500rpm下再離心5min，用棉簽將試管中的水吸干； (5) 往試管中加入0. 2MHC1 200μ 1，振蕩5min，在3500rpm下離心lOmin，獲得上清液， 取10 μ 1上清液作為上樣液，準備上機檢測。
[0054] 實施例4 HPLC-ECD檢測條件 色譜條件：C4、C8、C18反相色譜柱均可，如C18反相色譜柱可選擇Thermo Fisher Scientific 公司的 Acclaim?RSLC 120 C18 2. 2Mm (2· 1 X 100mm)。
[0055] 流動相如實施例1所示。
[0056] 流速：0· 2ml/min。
[0057] 柱溫：38 °C。
[0058] 電化學檢測條件：參比電壓E⑶l=-100mV，工作電壓E⑶2=100mV，保護池電壓 Guard=350mV。
[0059] 實施例5流動相配置 按照以下三種配方配置流動相： 配方1 :每l〇〇〇ml流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70ml，辛燒磺酸 鈉 0. 08g，冰醋酸 7. 5ml，ddH20 922. 5ml，pH 值 4. 0。0. 22 μ m 濾膜過濾，超聲脫氣 30min。
[0060] 結果分析：按照實施例1所示的方法配置lOOpprn的兒茶酚胺標準品，取10 μ 1上 機檢測，所采用的儀器和檢測條件如實施例4所示，所使用的流動相如配方1所示，檢測結 果如圖1所示。
[0061] 由圖1可知，采用流動相配方1，能成功地分離NOR、ADR和D0P，同時NOR、ADR和 D0P的峰與溶劑峰完全分離。
[0062] 此外，在相同實驗條件下，分別了檢測2ppm和10ppm的兒茶酚胺標準品（按照實 施例1所示的方法配置），也均能成功地分離NOR、ADR和D0P，同時NOR、ADR和D0P的峰與 溶劑峰完全分離。
[0063] 配方2 :每1000ml流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA-2NaO. 05g，乙腈80ml，辛烷磺 酸鈉 0. 10g，冰醋酸 7. 5ml，ddH20 912. 5ml，pH 值 4. 2。0. 22 μ m 濾膜過濾，超聲脫氣 30min。
[0064] 結果分析：按照實施例1所示的方法配置lOOppm的兒茶酚胺標準品，取10 μ 1上 機檢測，所采用的儀器和檢測條件如實施例4所示，所使用的流動相如配方2所示，檢測結 果如圖2所示。
[0065] 由圖2可知，采用流動相配方2,能成功地分離NOR、ADR和D0P，同時NOR、ADR和 D0P的峰與溶劑峰完全分離。
[0066] 此外，在相同實驗條件下，分別了檢測2ppm和lOppm的兒茶酚胺標準品（按照實 施例1所示的方法配置），也均能成功地分離NOR、ADR和D0P，同時NOR、ADR和D0P的峰與 溶劑峰完全分離。
[0067] 配方3 :每1000ml流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈90ml，辛燒磺 酸鈉 0. 09g，冰醋酸 7. 5ml，ddH20 902. 5ml，pH 值 4. 3。0. 22 μ m 濾膜過濾，超聲脫氣 30min。
[0068] 結果分析：按照實施例1所示的方法配置lOOppm的兒茶酚胺標準品，取10 μ 1上 機檢測，所采用的儀器和檢測條件如實施例4所示，所使用的流動相如配方3所示，檢測結 果如圖3所示。
[0069] 由圖3可知，采用流動相配方3,能成功地分離NOR、ADR和D0P，同時NOR、ADR和 D0P的峰與溶劑峰完全分離。
[0070] 在相同實驗條件下，分別了檢測2ppm和lOppm的兒茶酚胺標準品（按照實施例1 所示的方法配置），也均能成功地分離NOR、ADR和D0P，同時與溶劑峰完全分離。
[0071] 實施例6流動相分析 (1)離子對試劑辛烷磺酸鈉 每1000ml流動相配置如下所示： 先加入912. 5ml ddH20,邊攪拌邊依次加入4. lg無水乙酸鈉，0· 05g EDTA-2Na，一定量 的辛烷磺酸鈉（B8)，7. 5ml冰醋酸，調pH至4. 0,再加入80ml乙腈，攪拌均勻后，0. 22 μ m 濾膜過濾，超聲脫氣30min，備用，其中辛烷磺酸鈉的用量分別選擇0. 06g，0. 08g，0. 10g和 0. 648g〇
[0072] 按照實施例1所示的方法配置lOOppm的兒茶酚胺標準品，進樣量為10 μ 1，所采 用的儀器和檢測條件如實施例4所示。作為兒茶酚胺標準品中的三種組分，去甲腎上腺素 (N0R)、腎上腺素（ADR)和多巴胺（D0P)的出峰時間分別如表1、圖4、圖5、圖6和圖7所示： 表1不同B8用量下的NOR、ADR和D0P出峰時間 _
【權利要求】
1. 一種用于HPLC檢測樣品中兒茶酚胺濃度的試劑，所述試劑包括流動相，用于樣品預 處理的活性氧化鋁、0. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液，其特征在于： 每1000ml所述流動相中，無水乙酸鈉4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70?90ml，辛燒磺 酸鈉 0. 08?0. 10g，冰醋酸7. 5ml，其余為ddH20, pH值4. 0?4. 3。
2. 如權利要求1所述的試劑，所述HPLC檢測的條件為C18反相色譜柱，流速：0. 2ml/ min ;柱溫：38°C ;參比電壓ECDl=-100mV，工作電壓ECD2=100mV，保護池電壓Guard=350mV。
3. 如權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述樣品選自血液或尿液，當所述樣品為尿 液時，所述試劑還包括用于樣品預處理的濃鹽酸。
4. 如權利要求3所述的試劑，其特征在于，所述用于樣品預處理的0. 01M EDTA-2Na溶 液與所述血液或尿液的體積比為1: 1〇〇。
5. 如權利要求3所述的試劑，其特征在于，當所述血液用量為0. 5ml或所述尿液用量為 0. 2ml時，所述用于樣品預處理的活性氧化鋁用量為20?25mg。
6. 如權利要求5所述的試劑，其特征在于，所述預處理過程如下所示： 將所述用量的活性氧化鋁加入到一個試管中，然后加入400 μ 1 Tris-HCl緩沖液； 往0. 5ml血液加入0. 01M EDTA-2Na溶液5 μ 1，或者往0. 2ml尿液中加入20ml濃鹽酸 和0. 01M EDTA-2Na溶液2 μ 1，經離心后，收集血漿或者尿液上清液； 將（2)中收集的血漿或者尿液上清液加入到（1)中的試管內，然后振蕩，離心后，移除 上清液； 往試管中加 ddH20清洗，然后振蕩，離心后，移除上清液，重復4次，然后再次離心后，將 試管中的水吸干； 加入0. 2M HC1溶液200 μ 1，然后振蕩，離心后，取10 μ 1上清液作為上樣液，準備上機 檢測。
7. 如權利要求5所述的試劑，其特征在于，所述用于樣品預處理的活性氧化鋁用量為 23mg〇
8. 如權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述流動相中辛烷磺酸鈉的用量為0. 08g。
9. 如權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述流動相中乙腈的用量為80ml。
10. 如權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述流動相中的pH值為4. 0。
【文檔編號】G01N30/88GK104062388SQ201410194385
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月9日 優先權日:2014年5月9日
【發明者】陽愿望, 霍玉美, 潘超, 單洪波 申請人:廣州艾迪康醫學檢驗所有限公司