亞鐵血紅素—二氧化錳復合物的制備及其用于檢測人IgG的方法
【專利摘要】本發明公開了亞鐵血紅素—二氧化錳復合物的制備及其用于檢測人IgG的方法。本發明將亞鐵血紅素在氨水作用下溶于磷酸鹽緩沖溶液，再依次加入MnAc2溶液和NaOH溶液反應，制得亞鐵血紅素—二氧化錳復合物(Hemin-MnO2)；Hemin-MnO2具有過氧化物酶活性，能催化雙氧水氧化TMB使其由無色變為藍色，通過傳統的“三明治”夾心結構法，以Hemin-MnO2作為兔抗人IgG標記物，來進行人體免疫球蛋白IgG抗原的檢測，使用Hemin-MnO2的比色免疫法檢測具有穩定性好、靈敏度高、選擇性好、重現性優、分析速度快等優點；該免疫傳感方法簡單，價格低廉，肉眼即可觀察其顏色變化，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的制備及其用于檢測人IgG的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的制備及其用于檢測人IgG的方法，屬于生物傳感領域。
【背景技術】
[0002]近年來，新型生物傳感技術的構建及應用發展迅速，在臨床早期診斷、環境監測、食品檢測等領域得到了廣泛應用。而很多傳感方法及其應用受儀器及相關技術專業人員的限制而無法在許多發展中國家普及，所以構建一種簡單、經濟且無需借助精密儀器設備的傳感方法成為科研熱門研究領域。基于顏色變化來實現檢測的生物免疫傳感方法，因其反應迅速、方便經濟、操作簡單等特點而受到眾多科研工作者親睞。
[0003]現有的定量檢測人IgG的方法包括電化學檢測法，熒光檢測法、化學發光法等。但這些方法依賴于一定的儀器設備，而且不能同一時間檢測多種樣品，所耗時間較長。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是在于提供一種結構穩定、具有過氧化物酶活性的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的制備方法，該制備方法簡單、成本低。
[0005]本發明的另一個目的是在于提供了一種基于亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的檢測人IgG的方法，該方法利用亞鐵血紅素一二氧化錳復合物催化雙氧水氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)產生顏色變化，實現了人IgG檢測，該方法相對傳統的酶聯免疫法相比，不需要使用酶作為抗體標記物，具有穩定性好、簡單、靈敏度高、選擇性好、價格低廉等優點，實現了人體內免疫球蛋白IgG的高通量檢測。
[0006]本發明提供了一種亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的制備方法，該制備方法是將亞鐵血紅素與磷酸鹽緩沖溶液混合后，加入氨水促使亞鐵血紅素溶解，再在混合溶液中依次加入過量的MnAc2溶液和過量的NaOH溶液，攪拌均勻，再離心處理后，除去未反應完的MnAc2和NaOH，即得。
[0007]本發明的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的制備方法包括以下優選方案:
[0008]所述的離心處理是在8000?IOOOOrpm的速率下離心15?25min。
[0009]所述的磷酸鹽緩沖溶液pH為7.4。
[0010]所制得的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物PBS緩沖溶液清洗2?3遍，于不大于4°C的環境下儲存備用。
[0011]本發明還提供了一種基于亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的檢測人IgG的方法，該方法是在聚苯乙烯96孔板的各個孔的底表面先固定羊抗人IgG，并用牛血清白蛋白將所述各個孔的底表面封閉；再在所述牛血清白蛋白封閉過的各個孔的底表面分別組裝不同摩爾量的人IgG后，進一步組裝亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG ;組裝完成后，在各個孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的檸檬酸緩沖液進行反應，反應完成后，用酶標儀測定各個孔中3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的氧化產物在652nm的吸光度值，進行比色分析。
[0012]本發明的基于亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的檢測人IgG的方法還包括以下優選方案:
[0013]優選的方法是先在聚苯乙烯96孔板的各個孔中加入羊抗人IgG靜置8~12h，除去多余的羊抗人IgG，再在所述的各個孔中加入牛血清白蛋白靜置2~3h，除去多余的牛血清白蛋白；再在各個孔中分別加入等體積不同濃度的人IgG溶液，在37°C下溫育0.8~
1.2h,除去各孔中的剩余人IgG溶液，再在各個孔中加入亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG，在37°C下溫育1.2~1.7h，除去各孔中的剩余亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG ;最后在各個孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的檸檬酸緩沖液進行反應10~20min后，用酶標儀測定各個孔中3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的氧化產物在652nm的吸光度值，進行比色分析。
[0014]所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG通過以下方法制備得到，將所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物依次置于殼聚糖溶液、戊二醛溶液和兔抗人IgG中反應、離心處理，即得。
[0015]所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物依次置于0.3~0.8wt%的殼聚糖溶液中反應1.8~2.2h,離心3~7min,于0.2~0.3wt %的戍二醒溶液中反應0.4~0.6h,離心3~7min,于40~60 μ g ml/1的兔抗人IgG中0.8~1.2h,離心處理后，將離心物分散到磷酸鹽緩沖溶液中，得到亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG溶液。所述的磷酸鹽緩沖溶液PH值優選為pH = 7.4。所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG溶液濃度為Img Inr10
[0016]本發明的有益效果:本發明首次通過簡單的方法合成了亞鐵血紅素一二氧化錳復合物(Hemin-MnO2)，發現其具有過氧化物酶活性，能催化雙氧水氧化3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)使其由無色變為藍色；本發明申請進一步將亞鐵血紅素一二氧化錳復合物作為抗體標記物應用于人IgG的檢測，具有較高靈敏度，用肉眼即可辨別其顏色變化。本發明采用傳統的“三明治”夾心結構法，在聚苯乙烯96孔微量滴定板上固定羊抗人IgG，用所合成的Hemin-MnO2復合物作為兔抗人IgG標記物，來進行人體免疫球蛋白IgG抗原的檢測，發現隨著抗原濃度增大，最終氧化的產物顏色也出現有規律的變化(無色一淺藍一深藍)，可以借助酶標儀測定的吸光度值實現人IgG的定量分析。使用Hemin-MnO2復合物的比色免疫法檢測相對現有技術中傳統的酶聯免疫法，不需要使用酶作為抗體標記物，具有穩定性好、靈敏度高、選擇性好、重現性優、分析速度快等優點。該免疫傳感方法簡單，價格低廉，肉眼即可觀察其顏色變化，在生物技術、生物測定和生物醫學方面具有潛在的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]【圖1】為本發明實施例1制備的Hemin-MnO2復合物的透射電子顯微鏡圖像。
[0018]【圖2】為本發明實施例1制備的Hemin-MnO2復合物的能量色散X射線光譜圖。
[0019] 【圖3】為本發明實施例1制備的Hemin-MnO2復合物以及Hemin、MnO2和TMB催化雙氧水氧化TMB的顯色變化圖以及相應的吸光度一波長曲線圖；1為TMB ;2為MnO2, 3為Hemin，4為Hemin-MnO2復合物；顯色變化圖從上到下依次對應曲線4、3、2和I。[0020]【圖4】為不同濃度的本發明實施例1制備的Hemin-MnO2復合物催化氧化等量TMB的顯色變化圖以及相應的吸光度一波長曲線圖；曲線9、8、7、6和5依次對應Hemin-MnO2復合物濃度到由高到低，顯色變化圖從上到下依次對應9、8、7、6和5。
[0021]【圖5】為是本發明實施例1制備的Hemin-MnO2復合物采用雙抗夾心法修飾后的免疫傳感器測定不同濃度人IgG抗原所得的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例旨在進一步說明本
【發明內容】
，而不是限制本發明的保護范圍。
[0023]實施例1
[0024]新型亞鐵血紅素一二氧化猛復合物(Hemin-MnO2)的合成:將15mg的Hemin與IOmL pH = 7.4的PBS緩沖溶液混合后，加入50 μ L的氨水，攪拌溶解，然后邊攪拌邊加入
1.6mL100mM的MnAc2溶液，室溫下攪拌5min，然后加入100 μ LlM的NaOH溶液，繼續攪拌6~8h,最終得到Hemin-M nO2復合物,然后在9000rpm下離心20min,除去多于的MnAc2和NaOH,再用PBS緩沖溶液清洗2~3遍，最后將離心得到的產物儲存在4°C的冰箱中備用。
[0025]本發明的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG合成方法:將合成的Hemin-MnO2復合物分散到0.5wt%的殼聚糖溶液中，反應2h,離心5min ;再用0.25wt%的戍二醒分散0.5h,離心5min ;然后用50 μ g mL—1的兔抗人IgG與之反應Ih,離心；最后將其分散到pH = 7.4的PBS中，制得Img mL—1的溶液，儲存在4°C的冰箱中備用。
[0026]本發明的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物用于免疫分析檢測對免疫球蛋白IgG的檢測方法:將150 μ L羊抗人IgG(用緩沖液稀釋至10 μ g mL-1)加入聚苯乙烯96孔微量滴定板中，在4°C下孵育一整夜，將抗體固定到孔中。未固定的羊抗人IgG溶液用300yL洗滌緩沖液沖洗三次洗去。接著在37°C下，加入250 μ L封閉緩沖液，溫育2.5h，減少人IgG的非特異吸附，過量的BSA則用300 μ L的洗滌緩沖液沖洗三次。以pH = 7.4的PBS溶液分別配制不同濃度的IgG溶液(0，1，2，5，10，50，100，500，1000pg mL—1)，然后分別將150 μ L所配不同濃度的人IgG溶液加入孔中，孵育lh，再沖洗三次。隨后加入150 μ LHemin-MnO2修飾兔抗人IgG，孵育1.5h。在用300 μ L的洗滌緩沖液沖洗四次。最后，在每個孔中加入150 μ L含4.3mM雙氧水的檸檬酸緩沖液配制的2.5mM TMB,反應15min，繼而用酶標儀測定TMB氧化產物的吸光度值，制得的標準曲線如圖5所示。
[0027]實施例2
[0028]利用亞鐵血紅素一二氧化錳復合物用于臨床免疫分析檢測對人血清中人IgG回收率的測定:將人血清樣品用pH = 7.4的PBS緩沖液逐級稀釋到10,倍，然后加入不同濃度的 Opg mL'lOpg mL_1>50pg mL—1、IOOpg mL—1 和 SOOpgmL—1 的人 IgG 溶液。以加入 OpgmL—1人IgG的純血清溶液為空白參比溶液，按照實施例1的具體操作測定TMB氧化產物的吸光度值，制得回收率如表1，從表1數據可以看出人IgG回收率高，可以證明實施例1的檢測方法的可行性和準確性。
[0029]表1.人血清中人IgG回收率的測定(pg mL—1)
[0030]
【權利要求】
1.亞鐵血紅素一二氧化錳復合物的制備方法，其特征在于，將亞鐵血紅素與磷酸鹽緩沖溶液混合后，加入氨水促使亞鐵血紅素溶解，再在混合溶液中依次加入過量的MnAc2溶液和過量的NaOH溶液，攪拌均勻，再離心處理后，除去未反應完的MnAc2和NaOH，即得。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的離心處理是在8000?10000rpm的速率下離心15?25min。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖溶液PH為7.4。
4.基于權利要求1?3任一項所述制備方法制備的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物檢測人IgG的方法，其特征在于，在聚苯乙烯96孔板的各個孔的底表面先固定羊抗人IgG，并用牛血清白蛋白將所述各個孔的底表面封閉；再在所述牛血清白蛋白封閉過的各個孔的底表面分別組裝不同摩爾量的人IgG后，進一步組裝亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG;組裝完成后，在各個孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的檸檬酸緩沖液進行反應，反應完成后，用酶標儀測定各個孔中3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺的氧化產物在652nm的吸光度值,進行比色分析。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，先在聚苯乙烯96孔板的各個孔中加入羊抗人IgG靜置8?12h，除去多余的羊抗人IgG，再在所述的各個孔中加入牛血清白蛋白靜置2?3h，除去多余的牛血清白蛋白；再在各個孔中分別加入等體積不同濃度的人IgG溶液，在37°C下溫育0.8?1.2h，除去各孔中的剩余人IgG溶液，再在各個孔中加入亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG，在37°C下溫育1.2?1.7h，除去各孔中的剩余亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG ;最后在各個孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的檸檬酸緩沖液進行反應10?20min后，用酶標儀測定各個孔中3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺的氧化產物在652nm的吸光度值，進行比色分析。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG通過以下方法制備得到，將所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物依次置于殼聚糖溶液、戊二醛溶液和兔抗人IgG中反應、離心處理，即得。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的亞鐵血紅素一二氧化錳復合物依次置于0.3?0.8wt%的殼聚糖溶液中反應1.8?2.2h,離心3?7min,于0.2?0.3wt%的戍二醒溶液中反應0.4?0.6h,離心3?7min,于40?60 μ g ml/1的兔抗人IgG中0.8?1.2h，離心處理后，將離心物分散到磷酸鹽緩沖溶液中，得到亞鐵血紅素一二氧化錳復合物修飾兔抗人IgG溶液。
【文檔編號】G01N33/532GK103969445SQ201410192532
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】陽明輝, 郭林燕, 周苗 申請人:中南大學