從糖蜜中提取生物素的方法及其薄層層析掃描檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種從糖蜜中提取生物素的方法，以糖蜜和硅藻土為原料，經甲醇提取，N,N-二甲基甲酰胺提取，無水乙醇洗滌除雜，丙酮除雜，氯仿除雜，乙酸丁酯和環己烷提取除雜，最終得到含生物素的樣品液。本發明還提供了一種生物素的薄層層析掃描檢測方法，(1)取待檢測樣品液，點在硅膠板上，向展開缸加入展開劑，在展開缸內展開，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點；(3)利用薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，計算出樣品液中生物素的質量濃度。具有簡單、快速、準確、可靠、穩定等優點。
【專利說明】從糖蜜中提取生物素的方法及其薄層層析掃描檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從糖蜜中提取生物素的方法及其薄層層析掃描檢測方法。
【背景技術】
[0002]生物素是生命活動中必需的維生素之一，是機體內許多酶的輔助因子，參加機體的羧化、脫羧和脫氫反應，參與糖類、脂肪、蛋白質三大營養物質的代謝。生物素已廣泛應用于食品、化工、醫藥、畜牧、生物發酵等領域。在谷氨酸發酵生產中，生物素用量的控制直接影響著生產菌的生長、增殖、代謝和細胞壁、細胞膜的滲透性以及谷氨酸產酸率的高低，由于大多數谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量對生產起著至關重要的作用，因此開展對生物素檢測的研究具有重要的意義。
[0003]糖蜜是一種粘稠、黑褐色、呈半流動態的物質，是制糖工業上不能再用來煮制糖品的廢料，但糖蜜中生物素的含量豐富，可作為良好的谷氨酸發酵的原料和添加劑，是目前谷氨酸生產中生物素的主要來源。但由于其中生物素的含量與糖蜜的來源、生產批次等密切相關，因此，為穩定生產、提高產酸率必須密切關注糖蜜的組成變化，準確測定其中的生物素含量，以實現谷氨酸發酵中對生物素用量的控制。
[0004]現有技術文獻報 道的生物素的檢測方法有微生物法、熒光法、分光光度法、酶聯免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層掃描法等等。目前，對糖蜜中生物素的檢測，微生物法和高效液相色譜法最為常用，但存在以下缺陷:微生物法由于大多數菌株都不是專一性的，因此會帶來較大的檢測誤差，并且整個操作過程費時、費力。高效液相色譜法投資大、溶劑用量大、成本較高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有雜質較多，故樣品處理即生物素的提取純化過程困難，且高效液相色譜法對樣品的純度要求又較高，對成分復雜、色素含量高、雜質干擾大的糖蜜樣品，不宜用該法檢測。
【發明內容】
[0005]針對上述現有技術，本發明提供了一種從糖蜜中提取生物素的方法，本發明還提供了一種薄層層析掃描檢測方法。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]一種從糖蜜中提取生物素的方法，步驟如下:
[0008](I)以糖蜜和硅藻土為原料制得糖蜜硅藻土粉:取糖蜜和硅藻土，混合混勻，40~60°C烘干，得糖蜜硅藻土粉；其中，糖蜜和硅藻土的重量比為3:1~3 ;
[0009](2)向糖蜜硅藻土粉中加入甲醇，攪拌提取30~60min，過濾得濾渣；所述甲醇的加入量為--每I克糖蜜硅藻土粉加入3~5ml甲醇；
[0010](3)向上述濾渣中加入N，N- 二甲基甲酰胺，在水浴70~100°C下攪拌提取I~2小時，過濾得上清液和濾渣；濾渣用無水乙醇洗滌I~3次，得乙醇洗滌液；所述N，N- 二甲基甲酰胺的加入量為:每I克濾渣加入4~6mlN，N-二甲基甲酰胺；所述無水乙醇的加入量為:每次洗滌所用無水乙醇的量為N，N- 二甲基甲酰胺體積的0.8~1.2倍；[0011](4)合并步驟(3)所得上清液和乙醇洗滌液，蒸發濃縮，加入3?5倍量(體積倍數)的丙酮，靜置，過濾除去沉淀，再次蒸發濃縮，加入3?5倍量(體積倍數)的丙酮，靜置，過濾除去沉淀，再次蒸發濃縮，加入3?5倍量(體積倍數)的氯仿，靜置，過濾除去沉淀，得提取液；
[0012](4)向提取液中加入乙酸丁酯和環己烷，乙酸丁酯、環己烷的加入量與提取液的體積相同，靜置分層；取上清液，即為生物素溶液(含有生物素的溶液)。
[0013]以上方法中，蒸發濃縮采用旋轉蒸發儀進行，旋轉蒸發的溫度為40?60°C。
[0014]一種生物素的薄層層析掃描檢測方法，步驟如下:
[0015](I)取待檢測樣品液(即上述方法制備得到的生物素溶液)4μ1，點在硅膠板(優選IOcmX IOcm的涂有娃膠GF254高效薄層板)上，向展開缸加入展開劑，在展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)內展開,展開劑的飽和時間為60分鐘,展開距離為6cm,展開時間為15分鐘，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；同時，采用外標一點法點4μ I不同濃度的生物素標準品溶液，同時展開；
[0016]所述展開劑為二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的體積比為I?3:1?3:1?2:0.04?0.06，優選3:3:2:0.06 ；
[0017]所述生物素標準品溶液包括濃度分別為0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,
0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列標準品溶液；
[0018]所述生物素標準品溶液的配制方法為:精密稱取生物素標準品(購自Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成濃度為lmg/ml的標準溶液；精密吸取50，200，250，300，400μ llmg/ml 的標準溶液，配制成濃度分別 0.05 μ g/μ 1，0.2 μ g/μ 1，
0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列標準品溶液；
[0019](2)將2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛終濃度為0.1?0.2% (質量體積分數，單位g/ml)，硫酸終濃度為I?2% (質量體積分數，單位g/ml);展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點(橙紅色)；
[0020](3)利用Camag3型薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，掃描速度為20mm/s,分辨率為50 μ m/step,得Rf = 0.69 ;照射燈為鎢燈，檢測計算得到生物素標準品溶液質量和峰面積積分值的關系的回歸方程(通過薄層色譜儀管理軟件winCATSl.4.1計算出，為常規手段)，然后根據樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中生物素的質量濃度。[0021 ] 本發明的生物素的提取方法，操作簡單、可靠，本發明的生物素的檢測方法，具有簡單、快速、準確、可靠、穩定等優點。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0023]實施例1以糖蜜為原料進行生物素的提取
[0024]將15g糖蜜和5g硅藻土攪拌均勻，在40°C烘干得到干燥的糖蜜硅藻土粉，加入60ml甲醇，在常溫下攪拌I次，攪拌時間30分鐘，之后進行過濾。向已處理的糖蜜硅藻土粉中加入80mlN，N- 二甲基甲酰胺，在水浴鍋中進行攪拌提取，溫度在75°C，時間為I小時，過濾得到上清液,并用無水乙醇洗滌濾渣,每次80ml，洗滌3次，合并上清液和洗滌液。混合液過濾后用旋蒸儀蒸發濃縮到50ml，加150ml丙酮，攪拌混勻后靜置，沉淀出部分雜質，過濾后再次用旋蒸儀蒸發濃縮到40ml，再向其中加入120ml丙酮，攪拌混勻后靜置，沉淀出部分雜質，過濾后用旋蒸儀濃縮，濃縮到30ml，加入90ml的氯仿，攪拌混勻后靜置，過濾后旋蒸濃縮到3ml ;與3ml乙酸丁酯和3ml環己烷混合，靜置分層，取上清液濃縮到2ml，即為生物素溶液(作為樣品液)。所述旋轉蒸發溫度為55°C。
[0025]實施例2以糖蜜為原料進行生物素的提取
[0026]將15g糖蜜和IOg硅藻土攪拌均勻，在50°C烘干得到干燥的糖蜜硅藻土粉，加入IOOml甲醇在常溫下攪拌2次，攪拌時間45分鐘，之后進行過濾。將已處理的糖蜜硅藻土粉加入125mlN，N-二甲基甲酰胺，在水浴鍋中進行攪拌提取，溫度在85°C，時間為1.5小時，過濾得到上清液,并用無水乙醇洗滌濾渣,每次125ml洗滌4次，合并上清液和洗滌液。混合液過濾后用旋蒸儀蒸發濃縮到80ml，加320ml丙酮攪拌沉淀出部分雜質，過濾后再次用旋蒸儀蒸發濃縮到50ml，再向其中加入200ml丙酮沉淀出部分雜質，過濾后用旋蒸儀濃縮，濃縮到20ml加入80ml的氯仿沉淀雜質，過濾后旋蒸濃縮到3ml。與3ml乙酸丁酯和3ml環己烷混合，靜置分層，取上清液濃縮到2ml，即為生物素溶液(作為樣品液)。旋轉蒸發溫度為60。。。
[0027]實施例3以蜜糖為原料進行生物素的提取
[0028]將15g糖蜜和15g硅藻土攪拌均勻，在60°C烘干得到干燥的糖蜜硅藻土粉，加入150ml甲醇在常溫下攪拌3次，攪拌時間60分鐘，之后進行過濾。將已處理的糖蜜硅藻土粉加入180mlN，N-二甲基甲酰胺，在水浴鍋中進行攪拌提取，溫度在95°C，時間為2小時，過濾得到上清液,并用無水乙醇洗滌濾渣,每次180ml洗滌5次，合并上清液和洗滌液。混合液過濾后用旋蒸儀蒸發濃縮到60ml，加300ml丙酮攪拌沉淀出部分雜質，過濾后再次用旋蒸儀蒸發濃縮到40ml，再向其中加入200ml丙酮沉淀出部分雜質，過濾后用旋蒸儀濃縮，濃縮到20ml加入IOOml的氯仿沉淀雜質,過濾后旋蒸濃縮到3ml ;與3ml乙酸丁酯和3ml環己烷混合，靜置分層，取上清液濃縮到2ml，即為生物素溶液(作為樣品液)。旋轉蒸發溫度為65。。。
[0029]實施例4以糖蜜為原料進行生物素的提取
[0030]將15g糖蜜和IOg硅藻土攪拌均勻，在55°C烘干得到干燥的糖蜜硅藻土粉，加入IOOml甲醇在常溫下攪拌3次，攪拌時間50分鐘，之后進行過濾。將已處理的糖蜜硅藻土粉加入lOOmlN，N-二甲基甲酰胺，在水浴鍋中進行攪拌提取，溫度在85°C，時間為75min，過濾得到上清液,并用無水乙醇洗滌濾渣,每次IOOml洗滌4次，合并上清液和洗滌液。混合液過濾后用旋蒸儀蒸發濃縮到60ml，加240ml丙酮攪拌沉淀出部分雜質，過濾后再次用旋蒸儀蒸發濃縮到40ml，再向其中加入200ml丙酮沉淀出部分雜質，過濾后用旋蒸儀濃縮，濃縮到20ml加入IOOml的氯仿沉淀雜質,過濾后旋蒸濃縮到3ml ;與3ml乙酸丁酯和3ml環己烷混合，靜置分層，取上清液濃縮到2ml，即為生物素溶液(作為樣品液)。旋轉蒸發溫度為65。。。
[0031]實施例5生物素薄層層析掃描檢測方法
[0032]精密稱取生物素標準品(Sigma公司)1.29mg,加入N，N- 二甲基甲酰胺1.29ml,配制成濃度為lmg/ml的標準溶液。精密吸取50，200, 250，300, 400 μ llmg/ml的標準溶液，配制成濃度分別 0.05 μ g/ μ 1，0.2 μ g/ μ I, 0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列標準品溶液，分別取實施例1所得的樣品液4 μ I和標準液4 μ I點在涂有硅膠GF254高效薄層板(IOcmXlOcm)上，以二氯甲燒(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V) =3:3:2:0.06的比例配制8.06ml展開劑,在展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)內層析,展開劑的飽和時間為60分鐘，展開距離為6cm，展開時間為15分鐘，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干。將2，4- 二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2，4- 二甲氨基肉桂醛濃度為0.1%，硫酸濃度為1%，晾干后的薄層板用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯橙紅色的標準品斑點和樣品斑點。
[0033]利用Camag3型薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，掃描速度為20mm/s,數據分辨率為50 μ m/step,得Rf = 0.69。照射燈為鎢燈進行檢測計算，以生物素標準品的質量(ng)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，由薄層色譜儀管理軟件winCATSl.4.1直接得到標準品與峰面積積分值關系的回歸方程Y = 67.1435+2.8351X，r =
0.99933，RSD = 2.58%。結果表明，樣品液在0.2?1.6 μ g/斑點線性良好，經計算糖蜜中生物素的總含量為26.525 μ g/g。
[0034]實施例6生物素薄層層析掃描檢測方法
[0035]按照實施例5的層析方法，區別在于采用實施例2所得的生物素樣品液，以二氯甲烷(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V) = 3:2:1:0.04的比例配制7.04ml展開劑，染色液其中的2，4-二甲氨基肉桂醛濃度為0.2%，硫酸濃度為2%，按照線性回歸方程計算得糖蜜中生物素的含量為26.515 μ g/g。
[0036]實施例7生物素薄層層析掃描檢測方法
[0037]按照實施例5的層析方法，區別在于采用實施例3所得的生物素樣品液，以二氯甲燒(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V) = 2:3:2:0.05的比例配制7.05ml展開劑,染色液其中的2，4-二甲氨基肉桂醛濃度為0.15%，硫酸濃度為1.5%，按照線性回歸方程計算得糖蜜中生物素的含量為26.545 μ g/g。
[0038]實施例8生物素薄層層析掃描檢測方法
[0039]按照實施例5的層析方法，區別在于采用實施例4所得的生物素樣品液，以二氯甲燒(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V) = 2:2:3:0.05的比例配制7.05ml展開劑,染色液其中的2，4-二甲氨基肉桂醛濃度為0.15%，硫酸濃度為2%，按照線性回歸方程計算得糖蜜中生物素的含量為26.535 μ g/g。
【權利要求】
1.一種從糖蜜中提取生物素的方法，其特征在于:步驟如下: (1)以糖蜜和硅藻土為原料制得糖蜜硅藻土粉:取糖蜜和硅藻土，混合混勻，烘干，得糖蜜硅藻土粉；其中，糖蜜和硅藻土的重量比為3:1~3 ; (2)向糖蜜硅藻土粉中加入甲醇，攪拌提取30~60min，過濾得濾渣；所述甲醇的加入量為:每I克糖蜜硅藻土粉加入3~5ml甲醇； (3)向上述濾渣中加入N，N-二甲基甲酰胺，在水浴70~100°C下攪拌提取I~2小時，過濾得上清液和濾渣；濾渣用無水乙醇洗滌I~3次，得乙醇洗滌液；所述N，N-二甲基甲酰胺的加入量為:每I克濾渣加入4~6mlN，N- 二甲基甲酰胺；所述無水乙醇的加入量為:每次洗滌所用無水乙醇的量為N，N- 二甲基甲酰胺體積的0.8~1.2倍； (4)合并步驟(3)所得上清液和乙醇洗滌液，蒸發濃縮，加入3~5倍量的丙酮，靜置，過濾除去沉淀，再次蒸發濃縮，加入3~5倍量的丙酮，靜置，過濾除去沉淀，再次蒸發濃縮，加入3~5倍量的氯仿，靜置，過濾除去沉淀，得提取液； (4)向提取液中加入乙酸丁酯和環己烷，乙酸丁酯、環己烷的加入量與提取液的體積相同，靜置分層；取上清 液，即為生物素溶液。
2.根據權利要求1所述的從糖蜜中提取生物素的方法，其特征在于:所述蒸發濃縮采用旋轉蒸發儀進行，旋轉蒸發的溫度為40~60°C。
3.—種生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:步驟如下: (1)取待檢測樣品液，點在硅膠板上，向展開缸加入展開劑，在展開缸內展開，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；同時，采用外標一點法點4μ I不同濃度的生物素標準品溶液，同時展開； 所述展開劑為二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的體積比為I~3:1~3:1~2:0.04~0.06 ; (2)將2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛終濃度為0.1~0.2%，硫酸終濃度為I~2%;展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點； (3)利用薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，照射燈為鎢燈，檢測計算得到生物素標準品溶液質量和峰面積積分值的關系的回歸方程，然后根據樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中生物素的質量濃度。
4.根據權利要求3所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述硅膠板為涂有硅膠GF254高效薄層板。
5.根據權利要求3所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的體積比為3:3:2:0.06。
6.根據權利要求3所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述生物素標準品溶液包括濃度分別為 0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I, 0.3 μ g/μ I, 0.4 μ g/μ I的一系列標準品溶液。
7.根據權利要求3所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述回歸方程 Y = 67.1435+2.8351Χ, r = 0.99933，RSD = 2.58%。
8.根據權利要求3所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述樣品液是通過以下方法制備得到的:(1)以糖蜜和硅藻土為原料制得糖蜜硅藻土粉:取糖蜜和硅藻土，混合混勻，烘干，得糖蜜硅藻土粉；其中，糖蜜和硅藻土的重量比為3:1~3 ; (2)向糖蜜硅藻土粉中加入甲醇，攪拌提取30~60min，過濾得濾渣；所述甲醇的加入量為:每I克糖蜜硅藻土粉加入3~5ml甲醇； (3)向上述濾渣中加入N，N-二甲基甲酰胺，在水浴70~100°C下攪拌提取I~2小時，過濾得上清液和濾渣；濾渣用無水乙醇洗滌I~3次，得乙醇洗滌液；所述N，N-二甲基甲酰胺的加入量為:每I克濾渣加入4~6mlN，N- 二甲基甲酰胺；所述無水乙醇的加入量為:每次洗滌所用無水乙醇的量為N，N- 二甲基甲酰胺體積的0.8~1.2倍； (4)合并步驟(3)所得上清液和乙醇洗滌液，蒸發濃縮，加入3~5倍量的丙酮，靜置，過濾除去沉淀，再次蒸發濃縮，加入3~5倍量的丙酮，靜置，過濾除去沉淀，再次蒸發濃縮，加入3~5倍量的氯仿，靜置，過濾除去沉淀，得提取液； (4)向提取液中加入乙酸丁酯和環己烷，乙酸丁酯、環己烷的加入量與提取液的體積相同，靜置分層；取上清液，即為樣品液。
9.根據權利要求8所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述蒸發濃縮采用旋轉蒸發儀進行，旋轉蒸發的溫度為40~60°C。
【文檔編號】G01N1/28GK103926367SQ201410187112
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】馮木香, 劉代成 申請人:山東師范大學