一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條，其包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述金標墊上噴射有金標CSFV反應原性多肽、金標PRRSV反應原性多肽、金標豬PRV反應原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質控線，所述三條檢測線上分別固定有CSFV反應原性多肽、PRRSV反應原性多肽、PRV反應原性多肽，所述質檢線上固定有CSFV抗體、PRRSV抗體和PRV抗體。本發明的試紙條具有多聯、特異、敏感，使用簡便、快速等優點，可為我國生豬養殖基層提供高效、實用的抗體檢測技術與產品，為生豬疫病的防疫監督提供有效的技術支撐。
【專利說明】一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物檢測【技術領域】，具體涉及一種利用多肽抗原制備的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條。
【背景技術】
[0002]近年來危害我國養豬業的主要疫病有豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟和偽狂犬病、口蹄疫和圓環等，其中藍耳病危害最為嚴重。美國、歐洲養豬業發達國家普遍采用疫病凈化戰略，針對一些重要疫病如豬口蹄疫、豬瘟、偽狂犬等已停止使用疫苗，嚴格檢疫、監測和凈化的措施予以防控。我國因為現有基礎條件和疫病形勢的原因，目前尚不能完全照搬國外疫病凈化的策略，疫苗免疫與疫病監控依然是我國生豬疫病防控最為有效的措施之一。
[0003]由于國內疫苗種類繁多，質量參差不齊，免疫流程與技術人員操作各不相同，因此，疫苗免疫后抗體效價與免疫效果的監測就顯得極為重要，各類抗體水平的監測急需免疫檢測技術與產品的支持。我國目前常用的免疫學檢測方法有ELISA技術與乳膠凝集技術，然而ELISA技術需耗時2-3個小時，對操作人員有較高的技術要求，不太適應我國基層推廣。乳膠凝集則敏感性較低。免疫膠體金層析技術因兼有ELISA與乳膠凝集技術的優點，既比ELISA快速(僅需5-10分鐘)，又比乳膠凝集敏感(接近ELISA，可達ng/mL水平)，成為國內外動物疫病及抗體水平監測技術研究的熱點之一。
[0004]豬瘟，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸的病毒性傳染病，該病以流行廣、發病率和死亡率高為特征,給養豬業帶來慘重損失。該病被國際動物法規列入A類16種傳染病之一，被我國動物衛生法規列為一類傳染病。
[0005]豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種繁殖障礙與呼吸系統傳染病。豬是此病的唯一天然宿主。該病以接觸性、高度傳染性、高發病率，慢性和高死亡率為特征。病豬生長十分緩慢，甚至停滯生長，嚴重影響養豬業的經濟效益，因此對該病及時做出診斷有利于降低經濟損失。
[0006]偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起的多種家畜、野生動物的一種以發熱、腦脊髓炎為主的急性傳染病。豬是本病的主要宿主和帶毒者。通常引起妊娠母豬流產、產木乃伊胎、死胎和弱仔；初生仔豬出現神經癥狀，感染率和病死率可達100%。偽狂犬病(PR) —旦傳入豬群，將導致巨大的經濟損失，且很難根除。
[0007]目前，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在上述幾種病的診斷中已得到普遍應用，ELISA雖然靈敏度比較高，甚至可以區分野毒感染和疫苗免疫接種產生的抗體，但操作需要專門的技術人員和分析儀器，不適合基層的使用，因此，適用于現場使用的快速診斷與檢測試劑如膠體金試紙條、核酸分子檢測技術如實時熒光定量PCR技術，以及對一些多病原檢測的試劑如核酸檢測生物芯片等的研制與開發也很受關注。膠體金試紙卡應用簡單、快速、直觀，不需要配備專門的儀器以及技術人員，適于基本養殖場的檢測需求，節省人力、物力成本。而目前豬病抗體的檢測模式多是養殖場采集血清樣本然后送到專門的檢測單位通過ELISA方法進行檢測，從樣本送檢到報告結果一般需要3-4天有時甚至更多的時間，不利于降低檢測成本及提高檢測速度。
[0008]就膠體金試紙條研發方面而言，目前文獻報道的多是針對病原檢測的單聯、多聯試紙卡以及各豬病抗體檢測的單聯試紙卡，尚無同時檢測CSFV、PRRSV, PRV三種疾病抗體的膠體金檢測試紙卡，且已有的檢測用金標抗原多是利用表達蛋白或是全病毒抗原，利用多肽作為金標抗原的也尚未見報道。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條。
[0010]本發明所采取的技術方案是:
一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述金標墊上噴射有金標豬瘟病毒反應原性多肽、金標豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、金標豬偽狂犬病毒反應原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質控線，所述三條檢測線上分別固定有豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽，所述質檢線上固定有豬瘟病毒抗體、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體和豬偽狂犬病毒抗體。
[0011]作為優選的，所述豬瘟病毒反應原性多肽選自以下任一條:
【權利要求】
1.一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯金標檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，其特征在于:所述金標墊上噴射有金標豬瘟病毒反應原性多肽、金標豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、金標豬偽狂犬病毒反應原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質控線，所述三條檢測線上分別固定有豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽，所述質檢線上固定有豬瘟病毒抗體、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體和豬偽狂犬病毒抗體。
2.根據權利要求1所述的檢測試紙條，其特征在于，所述豬瘟病毒反應原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.1:c-HKVRNEVMVHWFDDE ；
SEQ ID N0.2:GLSTAENALLVALFGYV ；
SEQ ID N0.3:CTAVSPTTLRTE ；
SEQ ID N0.4:KYNTTLLNGSA-c。
3.根據權利要求1所述的檢測試紙條，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.5:c-GFMVPPGLSSEGHLT ；
SEQ ID N0.6:KTKSVKSLPGNKPVP-c。
4.根據權利要求1所述的檢測試紙條，其特征在于，所述豬偽狂犬病毒反應原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.7:VALALLLLALAAA ；
SEQ ID N0.8 =YYKNVIVTTYffSGSTYA ；
SEQ ID N0.9:LAIGLLYLAGLYAAFLAYR ；
SEQ ID N0.10:LLAALLAALYARTTL。
5.根據權利要求1~4任一項所述的檢測試紙條，其特征線在于，金標墊上噴涂的金標豬瘟病毒反應原性多肽、金標豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、金標豬偽狂犬病毒反應原性多肽分別為豬瘟病毒反應原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復合物、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復合物、偽狂犬病毒反應原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復合物。
6.根據權利要求1~4任一項所述的檢測試紙條，其特征在于，硝酸纖維素膜檢測線上固定的豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽先與非蛋白多聚體偶聯，得到多聚體偶聯反應原性多肽，再進一步將多聚體偶聯反應原性多肽固定到檢測線上。
7.根據權利要求6所述的檢測試紙條，其特征在于，所述多聚體偶聯反應原性多肽的制備方法如下: 1)選取反應原性多肽溶解，得到反應原性多肽溶液； 2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液； 3)在反應原性多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯劑，混合均勻； 4)將反應原性多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應，使反應原性多肽偶聯到非蛋白多聚體上；5)用透析袋去除未參與結合的偶聯劑及游離多肽，純化，凍干，得到多聚體偶聯反應原性多肽。
8.根據權利要求7所述的檢測試紙條，其特征在于，所述非蛋白多聚體為聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚苯乙烯磺酸鈉、殼聚糖、葡聚糖硫酸鈉、海藻糖中的任一種。
9.根據權利要求7所述的檢測試紙條，其特征在于，所述偶聯劑為EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、乙烯基三乙氧基硅烷、I，5-戊二醛中的任一種。
10.一種豬瘟、豬藍耳、偽狂犬病毒抗體三聯金標檢測試紙條的制備方法，包括以下步 驟: 1)合成豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽； 2)包被膜制備:將硝酸纖維素膜粘到PVC板上，用劃膜噴金機將CSFV、PRRSV、PRV抗體的混合溶液噴涂到硝酸纖維素膜上，形成質檢線；將與非蛋白多聚體偶聯的豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽分別噴涂到硝酸纖維素膜上，形成三條檢測線，干燥后保存備用； 3)金標墊制備:用膠體金顆粒標記鏈霉親和素，然后與生物素化的豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽結合形成金標結合物，用金子稀釋液稀釋濃縮的金標結合物到10%~20%，再用劃膜噴金機定量噴涂到玻璃纖維膜上，干燥保存備用； 4)樣品墊制備:用樣品處理液均勻處理玻璃纖維膜，干燥保存備用； 5)組裝:金標墊與吸水紙分別緊密連接于硝酸纖維素膜的兩端，然后將樣品墊緊密連接于金標結合墊上組裝成大板，再進一步切割成試紙條。
【文檔編號】G01N33/558GK103954772SQ201410182377
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】林禮錕, 李其昌, 陳善真, 王志花, 劉博奇, 陳克宏, 王貴平 申請人:廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司