Psa2蛋白在作為缺氧預適應生物標記物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了PSA2蛋白在作為缺氧預適應生物標記物中的應用。本發明提供了鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品，包含用于檢測PSA2蛋白的物質；還包含記載有如下內容的載體：若所述待測動物或細胞中PSA2蛋白的含量高于對照動物或細胞中PSA2蛋白的含量，則所述待測動物或細胞處于缺氧預適應狀態或候選處于缺氧預適應狀態；反之，則所述待測動物或細胞不處于缺氧預適應狀態后候選不處于缺氧預適應狀態；所述對照動物或細胞為：與所述待測動物或細胞分類命名相同，且未經缺氧處理的正常的動物或細胞。實驗證明，缺氧預適應后，PSA2蛋白在腦組織中含量明顯增加；本發明對缺氧相關疾病做出早期診斷和干預治療有很大幫助。
【專利說明】PSA2蛋白在作為缺氧預適應生物標記物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及PSA2蛋白在作為缺氧預適應生物標記物中的應用，特別涉及檢測PSA2蛋白含量的儀器或/和物質在制備鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品中的應用。
【背景技術】
[0002]缺氧，是指因為組織的氧氣供應不足或者用氧障礙，從而導致組織器官的代謝、功能甚至形態結構發生異常變化的病理生理過程。缺氧雖然不能作為單獨的疾病存在，但卻是臨床各種疾病中十分常見的一類病理過程，嚴重時甚至會導致器官的損傷或者功能的障礙。針對這一廣泛存在的病理過程，尋找提升機體抗缺氧能力的藥物和措施一直是研究的熱點。經過實驗研究發現，動物或細胞經過非致死量的缺氧刺激后，可以對隨后出現的更嚴重的缺氧產生耐受性，從而減輕缺氧對動物或者細胞的損傷，即會產生缺氧預適應(Hypoxic Preconditioning, HPC)的保護作用。HPC的機制可能與抗缺氧活性物質的產生或者內源性保護通路的激活等因素有關，但目前機制仍然未被闡明。蛋白質作為生物體內具體功能的執行者是生命的物質基礎，在機體受到缺氧刺激之后，會引起體內蛋白質表達與含量的動態改變。因此，通過對比經過缺氧預適應刺激后動物的重要組織器官與未經過缺氧刺激的動物蛋白質的系統動態研究，有助于從蛋白質層次上揭示缺氧預適應的發生過程，可能為我們找到相關抗缺氧蛋白質，對于預防缺氧損傷有著重要的意義。生物標志物，一般指可以提供客觀測定和評價的一個普通生理或病理指標，通過對它的測定便可以判斷機體當前所處的生物學過程中的進程。特異性的生物標志物對于疾病的鑒定、早起診斷、預防、治療以及愈后判定都有著積極的幫助租用，因此，尋找和發現有價值的生物標志物對于臨床研究有著重要意義。鑒于缺氧損傷存在的廣泛性與損傷結果的嚴重性，針對缺氧預適應相關蛋白生物標志物的研究便有著深遠的意義。從蛋白質的層次上尋找缺氧預適應相關蛋白生物標志物，從而為后期研發抗缺氧藥物提供可能的思路與靶點。
[0003]蛋白質組學，是指一種基因、細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組學是一種在整體、大規模水平上研究蛋白質的特征，包括表達水平，翻譯后的修飾等等，從而獲得在機體受到外源性刺激前后，蛋白質整體水平上的變化情況。目前，蛋白質組學中最常用且較為先進的方法為雙向突光差異凝膠電泳(Two dimensional difference in gelelectrophoresis, 2D-DIGE)。它是在傳統的雙向電泳的基礎上發展起來的新型蛋白質組學定量分離計數。DIGE實驗使用三種熒光染料(Cy2Cy3和Cy5)標記蛋白質，并且在同一張凝膠上對標記好的三組蛋白質混合物進行電泳分離，是一種多通道的蛋白分離技術，消除了因為凝膠差異而造成的誤差。于此同時，用Cy2標記所有蛋白質的混合物作為內參，在凝膠掃描后，使用專門的軟件將蛋白質的變化與內標含量進行比對分析，采用特殊的算法，給出準確可靠的定量信息，提高了實驗的重復性和準確性，減少了假陽性結果。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品。
[0005]本發明所提供的鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品，包含用于檢測PSA2蛋白的物質。
[0006]在本發明中，所述缺氧預適應是指動物或細胞經過非致死性缺氧后，對再次遭遇的缺氧產生耐受，從而減輕缺氧對動物或細胞的損傷；所述耐受具體可體現為對相同的缺氧狀態的耐受時間延長。
[0007]所述產品還可包含記載有如下內容的載體:
[0008]若所述待測動物或細胞中PSA2蛋白的含量高于(在統計學上顯著高于)對照動物或細胞中PSA2蛋白的含量，則所述待測動物或細胞處于缺氧預適應狀態或候選處于缺氧預適應狀態；反之，則所述待測動物或細胞不處于缺氧預適應狀態或候選不處于缺氧預適應狀態；
[0009]所述對照動物或細胞為:與所述待測動物或細胞分類命名相同，且未經缺氧處理的正常的動物或細胞。
[0010]進一步，所述PSA2蛋白的含量高于對照動物或細胞中PSA2蛋白的含量，具體可為所述PSA2蛋白的含量為所述對照動物或細胞中PSA2蛋白的含量的1.2倍以上，再如2倍以上。
[0011]所述載體可為紙張，也可為電子信息載體，如U盤、軟盤、⑶等。
[0012]在本發明中，所述PSA2蛋白的氨基酸序列具體為序列表中序列I。
[0013]進一步，在本發明中，所述用于檢測PSA2蛋白的物質為用于進行雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)的試劑和儀器，具體為如下:
[0014](al)三種熒光染料Cy2、Cy3和Cy5 ；
[0015](a2)等電聚焦電泳儀(如GE公司生產的IEF等電聚焦電泳儀);
[0016](a3)垂直電泳儀(如GE公司生產的垂直電泳儀)；
[0017](a4)突光掃描儀(如GE公司生產的臺風Trio掃描儀)；
[0018](a5) 2D圖像分析軟件(如GE公司生產的DeCyder2D圖像分析軟件)；
[0019](a6)質譜儀(如布魯克公司生產的型號為Ultraflex treme T0F/T0F的質譜儀)。
[0020]所述用于檢測PSA2蛋白的物質也可為抗所述PSA2蛋白的抗體。
[0021]更進一步，所述鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品，具體可由以上任一所述的用于檢測PSA2蛋白的物質，以及以上所述的載體組成。
[0022]另外，所述產品在鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態中的非疾病診斷應用也屬于本發明的保護范圍。
[0023]用于檢測PSA2蛋白的物質在制備用于鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0024]在所述應用中，所述用于檢測PSA2蛋白的物質為用于進行雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)的試劑和儀器，具體為如下:
[0025](al)三種熒光染料Cy2、Cy3和Cy5 ；
[0026](a2)等電聚焦電泳儀(如GE公司生產的IEF等電聚焦電泳儀);
[0027](a3)垂直電泳儀(如GE公司生產的垂直電泳儀)；[0028](a4)熒光掃描儀(如GE公司生產的臺風Trio掃描儀)；
[0029](a5) 2D圖像分析軟件(如GE公司生產的DeCyder2D圖像分析軟件)；
[0030](a6)質譜儀(如布魯克公司生產的型號為Ultraflex treme T0F/T0F的質譜儀)。
[0031]所述用于檢測PSA2蛋白的物質也可為抗所述PSA2蛋白的抗體。
[0032]進一步，所述PSA2蛋白的氨基酸序列具體為序列表中序列I。
[0033]本發明的一個實施例中，具體選擇小鼠(如ICR小鼠)作為所述動物，用于檢測所述PSA2蛋白的含量，檢測部位具體為所述動物(如小鼠)的腦組織。
[0034]本發明結合雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)和質譜對提取液進行全面分析，最終發現PSA2蛋白可作為缺氧預適應的標記物。具體表現為，缺氧預適應后，PSA2蛋白在腦組織中含量明顯增加。缺氧預適應生物標志物的揭示將對更加深入的了解缺氧預適應的機制在臨床上對缺氧相關疾病做出早期診斷和干預治療有很大幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035]圖1為2D-DIGE電泳圖。
[0036]圖2為PSA2蛋白的一級質譜圖與二級質譜圖。其中，A為PSA2蛋白一級質譜圖。B為m/z2362.1123 二級質譜圖。
[0037]圖3為PSA2蛋白在對照組與缺氧組中含量變化圖。縱軸為PSA2蛋白相對含量的對數值。
【具體實施方式】
[0038]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040]實施例1、小鼠缺氧預適應動物模型的獲得
[0041]將ICR小鼠(雄性，體重18_22g，由首都醫科大學實驗動物中心提供(動物號:SCXK(京)2012-0001)飼養于清潔室內，實驗前禁食12小時不禁水。將9只小鼠隨機分成3組，分別為對照組、缺氧3次組和缺氧6次組，每組3只。
[0042]稱重后將缺氧3次組和缺氧6次組的小鼠置于125ml的廣口瓶中，將瓶口用涂有凡士林的橡膠塞塞緊密封，開始計時(缺氧耐受時間的起點)并觀察小鼠的反應。當小鼠出現喘呼吸現象時，記錄時間(缺氧耐受時間的終點)。立即將小鼠從瓶中取出，并迅速放入另一個充滿新鮮空氣的125ml廣口瓶中后，立即將瓶口用涂有凡士林的橡膠塞塞緊密封，重新開始下一輪計時，記錄該次缺氧處理的缺氧耐受時間。共重復缺氧處理3次或6次。
[0043]小鼠在缺氧3次或6次后立即斷頭處死，然后在冰上迅速取出小鼠的腦組織，用濾紙將血跡吸干，放到液氮中保存待用。而對照組小鼠不進行缺氧處理，直接斷頭處死，在冰上迅速取出小鼠的腦組織，用濾紙將血跡吸干，放到液氮中保存待用。
[0044]對缺氧6次組小鼠的缺氧耐受時間與缺氧處理次數之間的關系進行分析，可見小鼠缺氧耐受時間隨著缺氧預適應次數的增多而大幅延長，從缺氧第I次的大約15min到缺氧第6次能夠延長到約80-90分鐘，可見，小鼠對缺氧產生了一定的適應性，即處于缺氧預適應狀態。
[0045]實施例2、缺氧預適應生物標記物的發現[0046]一、腦組織樣品的處理
[0047]將實施例1獲得的各組小鼠的腦組織從液氮中取出置于冰上，稱重，按照每克腦組織2.5ml的用量，分別加入組織裂解液【配方:溶劑為水，溶質及其濃度如下:8M尿素，2M硫脲(GE公司產品，其產品目錄為:RPN6301)，2% (w/v) CHAPS (GE公司產品，其產品目錄為:17-1314-01)】，并加入終濃度為0.005g/ml的蛋白酶抑制劑混合物片(羅氏公司產品，其產品目錄號04693159001)，用手持勻漿機于冰上勻漿。超聲破碎儀進行細胞粉碎。在冰上靜置15分鐘。150000rpm，4°C離心60分鐘。收集上清。加入三倍體積的冰冷的含有10%(w/v)三氯醋酸的丙酮溶液。置于_20°C過夜沉淀。沉淀結束后，取出樣品。15000rpm，4°C離心30分鐘。棄上清，加入冰冷的丙酮溶液，15000rpm，4°C離心10分鐘。棄上清，再次加入冰冷的丙酮溶液，15000rpm，4°C離心10分鐘。將沉淀凍干，得蛋白質干粉，置于_20°C備用。
[0048]二、對步驟一樣品進行雙向凝膠熒光差異凝膠電泳分析
[0049]1、待測樣品溶液的配制
[0050]用含有30mM Tris的水化液【水化液:溶劑為水，溶質及其濃度如下:8M尿素，2M硫脲(GE公司產品，其產品目錄為:RPN6301)，2% (w/v) CHAPS (GE公司產品，其產品目錄為:17-1314-01),0.002% (w/v)溴酚藍】。將蛋白質干粉充分溶解，并且用IM HCl或IM NaOH精確調pH至8.0-8.5。
[0051]2、蛋白定量
[0052]采用GE公司生產的2-Quant蛋白定量試劑盒(產品目錄號為80_6483_56)，對步驟I配制的待測樣品溶液進行蛋白定量。具體操作如下:
[0053]在定量實驗開始之前，先按要求配好preliminary color reagent溶液25ml,將試劑盒中的A液與B液按照100:1 (體積比)的比例混合均勻備用。向EP管中加入I μ 1、5 μ 1、10 μ 1、15 μ I和20 μ I濃度為2 μ g/μ I的BSA標準液，每個濃度重復3次，作為制作標準曲線的樣品。將溶解好的小鼠腦蛋白樣品(即步驟I配制的待測樣品溶液)取2-3 μ 1，加入空白EP管中。向每個EP管中加入500 μ I precipitant溶液。顛倒混勻后室溫下靜置2-3分鐘,然后加入co-precipitant溶液500 μ I。顛倒混勻后1000Og離心5分鐘。從沒有白色沉淀的一側吸凈上清，洗凈上清并確保沒有液體殘留。上清棄掉之后，每管中加入100 μ I copper solution和400 μ I純水，顛倒混勻。加入1ml事先配制好的preliminarycolor reagent溶液,顛倒混勻。于室溫下孵育15-20分鐘。用分光光度測定波長為480nm處的戲光值。根據測得的數值，做出標準曲線。并根據樣品的吸光值以及體積，用公式算出樣品的蛋白質含量。
[0054]3、2D_DIGE 檢測
[0055](I)標記蛋白樣品
[0056]采用最小標記法標記蛋白。具體操作如下:
[0057]用Iml的注射器吸取二甲基甲酰胺(DMF)，沖洗針管及600 μ I Ep管。再取出一定量DMF放入沖洗好的EP管中備用。
[0058]從熒光染料試劑盒(GE公司產品，其產品目錄號為25-8010-65)中取出三種染料:Cy2、Cy3 和 Cy5。
[0059]配制染料母液(濃度為1mmol/ μ I):每管染料(5mmol)加入5 μ I DMF,渦輪混勻，1000Og 離心 30s。
[0060]配制染料工作液:0.6μ I DMF加入0.4μ I染料母液配制1μ I工作液，可用來標記50 μ g蛋白質。
[0061]對蛋白樣品進行標記:按照表1對各蛋白樣品進行標記，將各個待標記的蛋白樣品與染料混合，進行渦旋混勻，4°C離心，避光，在冰上孵育30min。向IS管內加入3 μ IlOmM賴氨酸，其余各管中分別加入I μ I賴氨酸,于冰上孵育lOmin，終止標記。
[0062]表12D-DIGE中對蛋白樣品的標記
【權利要求】
1.鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品，包含用于檢測PSA2蛋白的物質。
2.根據權利要求1所述的產品，其特征在于:所述產品還包含記載有如下內容的載體: 若所述待測動物或細胞中PSA2蛋白的含量高于對照動物或細胞中PSA2蛋白的含量，則所述待測動物或細胞處于缺氧預適應狀態或候選處于缺氧預適應狀態；反之，則所述待測動物或細胞不處于缺氧預適應狀態后候選不處于缺氧預適應狀態； 所述對照動物或細胞為:與所述待測動物或細胞分類命名相同，且未經缺氧處理的正常的動物或細胞。
3.根據權利要求1或2所述的產品，其特征在于:所述PSA2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列I。
4.根據權利要求1-3中任一所述的產品，其特征在于:所述用于檢測PSA2蛋白的物質為如下: (al)三種熒光染料Cy2、Cy3和Cy5 ； (a2)等電聚焦電泳儀； (a3)垂直電泳儀； (a4)突光掃描儀； (a5)2D圖像分析軟件； (a6)質譜儀。
5.根據權利要求1-3中任一所述的產品，其特征在于:所述用于檢測PSA2蛋白的物質為抗所述PSA2蛋白的抗體。
6.權利要求1-5中任一所述的產品在鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態中的非疾病診斷應用。
7.用于檢測PSA2蛋白的物質在制備用于鑒定或輔助鑒定動物或細胞是否處于缺氧預適應狀態的產品中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述用于檢測PSA2蛋白的物質為如下: (al)三種熒光染料Cy2、Cy3和Cy5 ； (a2)等電聚焦電泳儀； (a3)垂直電泳儀； (a4)突光掃描儀； (a5)2D圖像分析軟件； (a6)質譜儀。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述用于檢測PSA2蛋白的物質為抗所述PSA2蛋白的抗體。
10.根據權利要求7-9中任一所述的應用，其特征在于:所述PSA2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列I。
【文檔編號】G01N21/64GK103954597SQ201410179074
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】薛明, 崔燦, 徐平湘, 白露 申請人:首都醫科大學