李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其特征在于：其中，由保藏號為CGMCCNo.8002的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6產生的單克隆抗體作為金標抗體偶聯膠體金，以及由保藏號為CGMCCNo.8765的雜交瘤細胞株1B4E7A6C9產生的單克隆抗體作為檢測抗體，金標抗體偶聯膠體金后噴涂于金標墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。本發明對李斯特菌的檢測特異性和靈敏性均較高。
【專利說明】李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測領域。具體而言，本發明涉及一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
【背景技術】
[0002]李斯特菌(Listeriaspp.)是一種短小的革蘭氏陽性無芽胞兼性厭氧桿菌,共有單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytohenes)、綿羊李斯特菌(Listeria iuanuii)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua)、威爾斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西爾李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、默氏李斯特菌(Listeriamurrayi)七個菌株，其中單核細胞增生李斯特菌是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，也是唯一對人致病的、典型的胞內寄生菌，可以導致嚴重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產和單核細胞增多等癥狀。1988年，世界衛生組織(World Health Organization, WHO)發表“食源性李斯特菌病勸告書”，指導全世界各國如何預防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成為新的重要的食源性疾病病原菌，WHO將其與E.coli0157、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌并列為20世紀90年代四大食源性致病菌。該菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香腸、加工禽類、生肉、魚、蝦、煙熏魚、生蔬菜。
[0003]目前李斯特菌的檢測主要依賴于國標所規定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應大量的樣品篩查。免疫學檢測是近年來出現的最快速、準確、穩定的快速檢測手段，但是檢測產品全部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產權，且可運用于檢測實踐的快速檢測產品，該專利以李斯特菌為檢測靶標，所要求保護的技術涉及李斯特菌快速檢測產品。
【發明內容】
[0004]為解決上述問題，本發明提供一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0005]一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其特征在于:
[0006]其中，由保藏號為CGMCCN0.8002的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6產生的單克隆抗體作為金標抗體偶聯膠體金，由保藏號為CGMCCN0.8765的雜交瘤細胞株1B4E7A6C9產生的單克隆抗體作為檢測抗體，金標抗體偶聯膠體金后噴涂于金標墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。
[0007]另外，本發明還提供了李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品中的李斯特菌中的應用。
[0008]發明作用與效果
[0009]根據本發明的李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，由于采用了配對單克隆抗體分別噴涂金標墊和檢測線，實驗結果對李斯特菌的檢測特異性和靈敏性均較高。【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明實施例中單克隆抗體純度測定的結果；
[0011]圖2是本發明實施例中李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯膠體金的最佳pH的檢測結果；
[0012]圖3是本發明實施例中李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯膠體金的最佳結合量的檢測結果；
[0013]圖4是本發明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的結構示意圖；
[0014]圖5是本發明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體組合配對結果；
[0015]圖6是本發明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的靈敏度測定結果；
[0016]圖7是本發明李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的交叉反應結果；以及
[0017]圖8是本發明實施例中李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條的模擬帶菌實驗結果O
[0018]保藏信息
[0019]1.產生抗單核細胞增生李斯特菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6于2013年07月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為CGMCCN0.8002。
[0020]2.抗單核細胞增生李斯特菌雜交瘤細胞1B4E7A6C9于2014年01月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為CGMCCN0.8765。
【具體實施方式】
[0021]本發明人的研究表明，以單核細胞增生性李斯特菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得到抗李斯特菌單克隆抗體1B4E7A6C9和6D4H7C8B6，其抗體效價可達到1:100000，其能夠特異性、高效地與李斯特菌結合，與豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內氏志賀、鮑氏志賀、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等均無交叉反應。
[0022]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明中所使用的菌株，除提供保藏編號的兩株外，其它菌株均可以通過商業渠道獲得。
[0023]一、抗李斯特菌單克隆抗體的制備及鑒定
[0024]1.免疫原和陽性標準品的準備
[0025]單核細胞增生性李斯特菌(ATCCN0.43251)接種于李氏增菌肉湯37°C、150r/min振蕩培養17h，計數，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I天。用生理鹽水調整單核細胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)濃度至5 X 109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調整濃度為IO8Cfu/ml作為陽性對照標準品，李氏增菌肉湯為陰性對照標準品。
[0026]2.單克隆抗體的制備過程
[0027](I)實驗動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。[0028](2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射一次。
[0029](3)采血:3次加強免疫后從尾部靜脈采血，采用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規方法進行細胞融合。
[0030](4)細胞融合:取免疫小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50% PEG作用下常規融合，分別接種于96孔培養板，置于37°C、5% CO2培養箱培養。
[0031](5)雜交瘤細胞篩選:采用間接非競爭酶聯免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細胞，將其轉移至24孔培養板。
[0032](6)克隆培養及抗體制備:用有限稀釋法進行克隆化培養。當細胞生長至鋪滿孔底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復3 — 4次，直至陽性率達到100 %。將雜交瘤細胞擴大培養，注射于經石蠟油預處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個雜交瘤細胞，7~10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。
[0033]3.單克隆抗體純化及鑒定
[0034]腹水先用辛酸-硫酸銨法粗提后,再用Protein G Sepharose親和層析法純化,將制備純化所得抗體D3、E7、B9通過Nanodrop2000C測定儀測得濃度如表1，1B4E7A6C9濃度為4.5mg/ml,6D4H7C8B6濃度為3.8mg/ml，該濃度適于抗體的使用與保存，不需再進行濃縮或稀釋。 [0035]純化后的抗體經倍比稀釋后用間接ELISA法測定效價，結果見表2 ;再用SDS-PAGE分析純度，5%積層膠，10%分離膠，120V電壓，電泳至膠底部，凝膠用考馬斯亮藍法染色，脫色后凝膠成像分析系統觀察結果，結果如圖1所示。圖1中第I泳道是1B4E7A6C9，第二泳道是:6D4H7C8B6。
[0036]表1單克隆抗體的濃度
[0037]
【權利要求】
1.一種李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其特征在于: 其中，由保藏號為CGMCCN0.8002的雜交瘤細胞株6D4H7C8B6產生的單克隆抗體作為金標抗體偶聯膠體金，由保藏號為CGMCCN0.8765的雜交瘤細胞株1B4E7A6C9產生的單克隆抗體作為檢測抗體，所述金標抗體偶聯膠體金后噴涂于所述金標墊上，所述檢測抗體噴涂于所述NC膜上形成檢測線。
2.如權利要求1所述的李斯特菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品中的李斯特菌中的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK103941012SQ201410178017
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】劉箐, 李建武, 楊標 申請人:上海理工大學