一種激光掃描共焦熒光顯微內窺成像系統的制作方法
【專利摘要】本發明屬于三維顯微成像領域，提供了一種熒光共焦顯微成像系統。該系統是在現有可獲取樣品三維層析圖像的激光光源和共焦成像光路的基礎上，另外增加可得到寬場圖像的寬場成像光路、寬場照明激光光源、以及面陣探測器，并增加共焦成像光路與寬場成像光路配合使用的光學器件，以實現寬場圖像與三維層析圖像的同時顯示。該系統可首先利用寬場圖像成像模式獲得寬場圖像，實現對樣品上待觀測目標的快速搜索，在鎖定待觀測目標后，利用三維層析圖像成像模式獲得待觀測目標的高精度三維層析圖像，并同時獲得樣品的寬場表面圖像。相對于現有技術，解決了樣品逐點掃描所帶來的掃描時間長的問題，同時結構簡單，降低了系統成本，有利于系統的產業化應用。
【專利說明】一種激光掃描共焦熒光顯微內窺成像系統
【技術領域】
[0001]本發明屬于三維顯微成像領域，尤其涉及一種熒光共焦顯微成像系統。
【背景技術】
[0002]共焦顯微成像系統是一種可對生物樣品等實現光學斷層成像的系統。在共焦顯微成像系統中，點光源發出的光經第一物鏡后聚焦到樣品表面，再由樣品反射或透射后經聚光鏡再聚焦到探測器。點光源、物體、探測器前的小孔三者是互相共軛的。由掃描機構對樣品進行xy平面掃描以得到樣品的一幅二維圖像，再由軸向掃描便可得到樣品多個層面的掃描圖像，各層圖像經過圖像處理，便可重構出樣品的高分辨率三維層析圖像。
[0003]熒光共焦顯微成像系統是通過激光照射樣品以激發樣品發出熒光，再通過探測器接受熒光來對樣品進行觀察的共焦顯微成像系統。現有技術提供的熒光共焦顯微成像系統不具有快速準確尋找目標能力，需要采用激光逐點大范圍掃描，使得獲取目標樣品的三維層析圖像的時間較長，準確成像目標物體比較難，且由于需要采用結構復雜的掃描系統，使得系統成本增加，不利于產業化。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種熒光共焦顯微成像系統，旨在解決現有的熒光共焦顯微成像系統不具有快速準確尋找目標能力，需要采用激光逐點大范圍掃描，使得獲取目標樣品的三維層析圖像的時間較長，準確成像目標物體比較難，，且使得系統成本高、不利于產業化的問題。
[0005]本發明是這樣實現的，一種熒光共焦顯微成像系統，所述系統包括:
[0006]用于產生激發光的激光光源；
[0007]放置在所述激光光源發出的所述激發光的光路上的共焦成像光路；
[0008]放置在所述激發光經所述共焦成像光路后的光路上的第一雙色鏡；
[0009]放置在所述激發光經所述第一雙色鏡透過后的光路上的第一物鏡；
[0010]放置在所述激發光經所述第一物鏡會聚后的光路上的光纖束；
[0011]放置在所述激發光經所述光纖束后的光路上的第一顯微透鏡；
[0012]放置在所述激發光經所述第一顯微透鏡后的光路上的第二顯微透鏡；
[0013]帶動所述第一顯微透鏡和所述第二顯微透鏡移動的壓電陶瓷；
[0014]放置在所述激發光激發樣品得到的熒光經所述共焦成像光路后的光路上的探測器；
[0015]發出寬場成像激光的寬場照明激光光源；
[0016]放置在所述寬場照明激光光源發出的所述寬場成像激光的光路上的寬場成像光路，所述寬場成像激光經所述寬場成像光路和所述第一雙色鏡全反射并會聚到所述第一物鏡的后焦面；
[0017]放置在所述寬場成像激光經所述樣品反射得到的反射光經所述寬場成像光路后的光路上的面陣探測器。
[0018]本發明提供的熒光共焦顯微成像系統是在現有可獲取樣品三維層析圖像的激光光源和共焦成像光路的基礎上，另外增加可得到寬場圖像的寬場成像光路、寬場照明激光光源、以及面陣探測器，并增加共焦成像光路與寬場成像光路配合使用的光學器件，以實現寬場圖像與三維層析圖像的同時顯示。該系統在工作時，可首先利用寬場圖像成像模式獲得寬場圖像，實現對樣品上待觀測目標的快速搜索，在鎖定待觀測目標后，通過調節第一顯微透鏡和所述第二顯微透與光纖束端面距離，調節寬場圖像范圍大小，實現準確尋找共焦成像目標位置，最后利用三維層析圖像成像模式獲得待觀測目標的高精度三維層析圖像，并同時獲得樣品的寬場表面圖像。相對于現有的熒光共焦顯微成像系統，解決了樣品逐點掃描所帶來的掃描時間長、目標位置難以確定等問題，同時結構簡單，降低了系統成本，有利于系統的產業化應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是本發明提供的熒光共焦顯微成像系統的結構圖；
[0020]圖2是圖1中共焦成像光路的結構圖；
[0021]圖3是圖1中寬場成像光路的結構圖。
【具體實施方式】
[0022]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0023]本發明提供的熒光共焦顯微成像系統是在現有可獲取樣品三維層析圖像的激光光源和共焦成像光路的基礎上，另外增加可得到寬場圖像的寬場成像光路、寬場照明激光光源、以及面陣探測器，并增加共焦成像光路與寬場成像光路配合使用的光學器件，以實現寬場圖像與三維層析圖像的同時顯示。
[0024]圖1示出了本發明提供的熒光共焦顯微成像系統的結構，為了便于說明，僅示出了與本發明相關的部分。
[0025]本發明提供的熒光共焦顯微成像系統包括:發出激發光的激光光源11 ;放置在激光光源11發出的激發光的光路上的共焦成像光路12 ;放置在激發光經共焦成像光路12后的光路上的第一雙色鏡14 ;放置在激發光經第一雙色鏡14透過后的光路上的第一物鏡15 ；放置在激發光經第一物鏡15會聚后的光路上的光纖束16 ;放置在激發光經光纖束16后的光路上的第一顯微透鏡18 ;放置在激發光經第一顯微透鏡18后的光路上的第二顯微透鏡19 ;帶動第一顯微透鏡18和第二顯微透鏡19移動的壓電陶瓷17 ;放置在激發光激發樣品得到的熒光經共焦成像光路12后的光路上的探測器13 ;發出寬場成像激光的寬場照明激光光源20 ;放置在寬場照明激光光源20發出的寬場成像激光的光路上的寬場成像光路21,寬場成像激光經寬場成像光路21和第一雙色鏡14全反射并會聚到第一物鏡15的后焦面；放置在寬場成像激光經樣品反射得到的反射光經寬場成像光路21后的光路上的面陣探測器22。
[0026]該熒光共焦顯微成像系統的工作原理是:在系統工作前，標定壓電陶瓷17的驅動電壓大小，建立光纖束16的端面與第一顯微透鏡18和第二顯微透鏡19之間的距離與壓電陶瓷17的驅動電壓之間的關系，并確定三維層析圖像成像時的第一電壓范圍、以及寬場圖像成像時的第二電壓范圍。在系統工作時，首先將壓電陶瓷17的驅動電壓調至寬場圖像成像模式下的第二電壓范圍，以獲得實時的寬場圖像，在搜索到樣品上的待觀測目標后，逐漸調節壓電陶瓷17的驅動電壓，實現逐漸調小視場直至準確鎖定待觀測目標，再用三維層析圖像成像模式獲得待觀測目標的高精度三維層析圖像，并同時獲得樣品的寬場表面圖像。進一步來說，對于三維層析圖像的獲取，首先由激光光源11發出激發光，該激發光可為連續光或脈沖光，其波長位于熒光染料或自體熒光物質的吸收區；之后，激發光經共焦成像光路12后的準直光透過第一雙色鏡14進入第一物鏡15，由第一物鏡15會聚耦合進入光纖束16中的某根光纖；之后，由光纖束16的另一端的對應光纖出射后，由第一顯微透鏡18和第二顯微透鏡19聚焦到樣品中；之后，根據光路可逆原則，樣品經激發光激發出的熒光經第二顯微透鏡19和第一顯微透鏡18耦合進入光纖束16中的對應光纖，再經第一物鏡15后經第一雙色鏡14透射到共焦成像光路12 ;之后，經共焦成像光路12后的熒光聚焦到探測器13。對于寬場圖像的獲取，首先，寬場照明激光光源20發出寬場成像激光，寬場成像激光的波長可以是808nm ;之后，寬場成像激光經寬場成像光路21和第一雙色鏡14全反射并會聚到第一物鏡15的后焦面，經第一物鏡15后形成的準直光出射并充滿光纖束16的整個端面，I禹合進入整個光纖束16 ;之后，由光纖束16出射后，經第一顯微透鏡18和第二顯微透鏡19面照明到樣品；之后，由樣品反射的反射光經第二顯微透鏡19和第一顯微透鏡18進入光纖束16,經光纖束16出射后由第一雙色鏡14濾出并入射到寬場成像光路21,—部分反射光經寬場成像光路21后成像到面陣探測器22，由面陣探測器22實時觀測樣品的寬場圖像。在該系統中，第一雙色鏡14具有對寬場成像激光全反、而對激發光和熒光高透的特性。
[0027]本發明中，探測器13可以是光電倍增管(Photomultiplier Tube, PMT)或其它單點探測器；面陣探測器22可以是電荷稱合元件(Charge-coupled Device，CCD)或其它可實現光信號與電信號或數字信號轉換的器件。
[0028]圖2示出了圖1中共焦成像光路12的結構。
[0029]具體地，共焦成像光路12可包括:放置在激光光源11發出的激發光的光路上的第一會聚光學器件1201 ;—個端面置于激發光經第一會聚光學器件1201會聚后的光路上的光纖1202 ;放置在激發光經光纖1202的另一端面后的光路上的第二會聚光學器件1203 ；放置在激發光經第二會聚光學器件1203后的光路上的激發濾光片1204 ;放置在激發光經激發濾光片1204濾波后的光路上的第二雙色鏡1205 ;放置在激發光經第二雙色鏡1205透過后的光路上的第二物鏡1206 ;放置在激發光經第二物鏡1206會聚后的光路上的共焦針孔1207 ;放置在激發光經共焦針孔1207后的光路上的第三物鏡1208 ;放置在激發光經第三物鏡1208準直后的光路上的二維掃描器1209 ;放置在激發光經二維掃描器1209 二維掃描后的光路上的掃描透鏡1210，二維掃描器1209放置在掃描透鏡1210的焦面；放置在激發光經掃描透鏡1210后的光路上的第一管鏡1211，激發光經第一管鏡1211準直后透過第一雙色鏡14 ;放置在激發光激發樣品得到的熒光經第二雙色鏡1205反射后的光路上的發射濾光片1212 ;放置在熒光經發射濾光片1212濾波后的光路上的聚焦透鏡1213，聚焦透鏡1213將熒光聚焦到探測器13。[0030]該共焦成像光路12的工作原理是:激光光源11發出的激發光由第一會聚光學器件1201耦合進入光纖1202，以便于光路轉向；之后，經光纖1202出射的激發光經第二會聚光學器件1203準直成平行光，該平行光經激發濾光片1204濾出所需的波長透過，其它波長的光則被阻擋以提高信噪比；之后，經激發濾光片1204濾波后的激發光經第二雙色鏡1205透射到第二物鏡1206，由第二物鏡1206會聚到共焦針孔1207，共焦針孔1207為大小可調的共焦針孔，可實現信噪比、對比度和分辨率等參數的調整，以增加實用性；之后，經共焦針孔1207出射后的激發光由第三物鏡1208收集準直，進入二維掃描器1209 ;之后，經二維掃描器1209偏轉的激發光經掃描透鏡1210進入第一管鏡1211形成平行光束,該平行光束的直徑與第一管鏡1211的孔徑匹配，以實現最佳聚焦效果，提高分辨率；之后，經第一管鏡1211準直后的激發光透過第一雙色鏡14。之后，樣品經激發光激發出的熒光經第一物鏡15后經第一雙色鏡14透射到第一管鏡1211 ;之后順次經掃描透鏡1210、二維掃描器1209和第三物鏡1208進入共焦針孔1207，共焦針孔1207可將熒光光束中、除傳入激發光的對應光纖以外的其它光纖收集傳輸出的熒光阻擋掉；之后，由共焦針孔1207濾出的熒光經第二物鏡1206形成準直光，該準直光再由第二雙色鏡1205反射到發射濾光片1212，由發射濾光片1212將殘余的激發光阻擋掉，濾出熒光；之后，濾出的熒光經聚焦透鏡1213聚焦到探測器13。
[0031]本發明中，為了獲得樣品的熒光共焦圖像，二維掃描器1209每使得激發光的光束偏轉一步，由第一物鏡15聚焦耦合到光纖束16中、導入激發光的光纖也隨之變化，導致樣品中激發光的激發光點的位置也對應變化，以達到掃描樣品的目的。而光纖束16中與每個位置對應的那根光纖收集的熒光都與共焦針孔1207形成共焦探測，光纖束16中的其它光纖收集的熒光則被共焦針孔1207阻擋。這樣，相對于傳統的僅利用光纖束中光纖孔徑實現共焦光路的方式，由于共焦針孔1207的引入而實現了真正的共軛成像，能夠將光纖束中其它鄰近光纖收集的干擾熒光信號濾除，而傳統利用光纖自身孔徑的方式則無法實現該效果。另外，共焦針孔1207處于自解掃描光路中，既實現激發光點源效果，又實現了點物發光探測，相對于雙孔結構更簡單、性能更穩定，有利于系統產業化。
[0032]本發明中，二維掃描器1209可以是二維振鏡、聲光器件或其它掃描器，可實現柵掃描或隨機掃描
[0033]本發明中，第一會聚光學器件1201和/或第二會聚光學器件1203可以是自聚焦透鏡或其它具有會聚作用的光學器件。
[0034]本發明中，為了便于更換激光光源11，共焦成像光路12還可包括光纖連接器(圖中未示出)；光纖1202又包括第一光纖段和第二光纖段，且第一光纖段與第二光纖段之間通過光纖連接器連接。這樣，通過插拔光纖連接器，可方便的更換激光光源11，提高了系統的便利性。
[0035]圖3示出了圖1中寬場成像光路21的結構。
[0036]具體地，寬場成像光路21可包括:放置在寬場照明激光光源20發出的寬場成像激光的光路上的第二管鏡211 ;放置在寬場成像激光經第二管鏡211會聚后的光路上的分光鏡212,分光鏡212將經第二管鏡211會聚后的寬場成像激光反射到第一雙色鏡14,并進而由第一雙色鏡14反射到第一物鏡15的后焦面；放置在寬場成像激光經樣品反射得到的反射光經分光鏡212透射后的光路上的第三管鏡213，第三管鏡213將經分光鏡212透射后的反射光聚焦到面陣探測器22。
[0037]該寬場成像光路21的工作原理是:寬場照明激光光源20發出的寬場成像激光經第二管鏡211會聚到分光鏡212,分光鏡212將該寬場成像激光反射到第一雙色鏡14,并由第一雙色鏡14繼續反射到第一物鏡15的后焦面，經第一物鏡15后形成準直光出射并充滿光纖束16的整個端面，耦合進入整個光纖束16 ;之后，由光纖束16端面出射的寬場成像激光經第一顯微透鏡18和第二顯微透鏡19面照明樣品；之后，經樣品反射后的反射光經第二顯微透鏡19和第一顯微透鏡18進入光纖束16,經光纖束16出射后，由第一雙色鏡14反射到分光鏡212 ;之后，一部分反射光透過分光鏡212經第三管鏡213成像到面陣探測器22，由面陣探測器22實時觀測樣品的寬場圖像。
[0038]本發明提供的熒光共焦顯微成像系統是在現有可獲取樣品三維層析圖像的激光光源和共焦成像光路的基礎上，另外增加可得到寬場圖像的寬場成像光路、寬場照明激光光源、以及面陣探測器，并增加共焦成像光路與寬場成像光路配合使用的光學器件，以實現寬場圖像與三維層析圖像的同時顯示。該系統在工作時，可首先利用寬場圖像成像模式獲得寬場圖像，實現對樣品上待觀測目標的快速搜索，在鎖定待觀測目標后，利用三維層析圖像成像模式獲得待觀測目標的高精度三維層析圖像，并同時獲得樣品的寬場表面圖像。相對于現有的熒光共焦顯微成像系統，解決了樣品逐點掃描所帶來的掃描時間長的問題，同時結構簡單，降低了系統成本，有利于系統的產業化應用。
[0039]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述系統包括: 用于產生激發光的激光光源； 放置在所述激光光源發出的所述激發光的光路上的共焦成像光路； 放置在所述激發光經所述共焦成像光路后的光路上的第一雙色鏡； 放置在所述激發光經所述第一雙色鏡透過后的光路上的第一物鏡； 放置在所述激發光經所述第一物鏡會聚后的光路上的光纖束； 放置在所述激發光經所述光纖束后的光路上的第一顯微透鏡； 放置在所述激發光經所述第一顯微透鏡后的光路上的第二顯微透鏡； 帶動所述第一顯微透鏡和所述第二顯微透鏡移動的壓電陶瓷； 放置在所述激發光激發樣品得到的熒光經所述共焦成像光路后的光路上的探測器； 發出寬場成像激光的寬場照明激光光源； 放置在所述寬場照明激光光源發出的所述寬場成像激光的光路上的寬場成像光路，所述寬場成像激光經所述寬場成像光路和所述第一雙色鏡全反射并會聚到所述第一物鏡的后焦面； 放置在所述寬場成像激光經所述樣品反射得到的反射光經所述寬場成像光路后的光路上的面陣探測器。
2.如權利要求1所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述共焦成像光路包括: 放置在所述激光光源發出的所述激發光的光路上的第一會聚光學器件； 一個端面置于所述激發光經所述第一會聚光學器件會聚后的光路上的光纖； 放置在所述激發光經所述光纖的另一端面后的光路上的第二會聚光學器件； 放置在所述激發光經所述第二會聚光學器件后的光路上的激發濾光片； 放置在所述激發光經所述激發濾光片濾波后的光路上的第二雙色鏡； 放置在所述激發光經所述第二雙色鏡透過后的光路上的第二物鏡； 放置在所述激發光經所述第二物鏡會聚后的光路上的共焦針孔； 放置在所述激發光經所述共焦針孔后的光路上的第三物鏡； 放置在所述激發光經所述第三物鏡準直后的光路上的二維掃描器； 放置在所述激發光經所述二維掃描器二維掃描后的光路上的掃描透鏡，所述二維掃描器放置在所述掃描透鏡的焦面； 放置在所述激發光經所述掃描透鏡后的光路上的第一管鏡，所述激發光經所述第一管鏡準直后透過所述第一雙色鏡； 放置在所述激發光激發所述樣品得到的熒光經所述第二雙色鏡反射后的光路上的發射濾光片； 放置在所述熒光經發所述射濾光片濾波后的光路上的聚焦透鏡，所述聚焦透鏡將所述熒光聚焦到所述探測器。
3.如權利要求2所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述共焦成像光路還包括光纖連接器； 所述光纖又包括第一光纖段和第二光纖段，且所述第一光纖段與所述第二光纖段之間通過所述光纖連接器連接。
4.如權利要求2所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述二維掃描器是二維振鏡或聲光器件。
5.如權利要求2所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述第一會聚光學器件和/或所述第二會聚光學器件是自聚焦透鏡。
6.如權利要求1所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述寬場成像光路包括: 放置在所述寬場照明激光光源發出的所述寬場成像激光的光路上的第二管鏡； 放置在所述寬場成像激光經所述第二管鏡會聚后的光路上的分光鏡，所述分光鏡將經所述第二管鏡會聚后的所述寬場成像激光反射到所述第一雙色鏡； 放置在所述寬場成像激光經所述樣品反射得到的反射光經所述分光鏡透射后的光路上的第三管鏡，所述第三管鏡將經所述分光鏡透射后的反射光聚焦到所述面陣探測器。
7.如權利要求1至6任一項所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述探測器是光電倍增管。
8.如權利要求1至6任一項所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述面陣探測器是電荷稱合元件。
9.如權利要求1至6任一項所述的熒光共焦顯微成像系統，其特征在于，所述激發光為連續光或脈沖光，所述激發光的波長位于熒光染料或自體熒光物質的吸收區； 所述寬場成像激光的波長是808nm。
【文檔編號】G01N21/64GK103926228SQ201410174917
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】邵永紅, 金春平 申請人:江蘇天寧光子科技有限公司