一種生物功能化的納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針及其制備方法和用途

一種生物功能化的納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針及其制備方法和用途。探針分兩部分，一為生物功能化的磁珠納米微球顆粒，二為含有氯金酸和金納米顆粒的復合溶液。其特征為含有檢測抗體及具有生物酶活性物質表面修飾的磁珠納米顆粒和可被上述酶催化的底物及含有氯金酸和金納米顆粒復合溶液。該探針能與待檢測物質高效識別，位于磁珠表面的生物酶活性物質催化其的底物產生過氧化氫，在過氧化氫和氯金酸存在的情況下，無色的金納米溶液中的單個金納米顆粒粒徑會增大，從而導致金納米顆粒溶液吸光值改變。本發明方法大大提高了疾病標識物或病原微生物的檢測靈敏度，可定量,寬線性范圍，并具有操作簡單、批量檢測的優點。
【專利說明】一種生物功能化的納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其制備方法及所屬納米材料用于腫瘤等疾病生物標識物、病原體檢測應用，屬于生物醫學工程以及納米醫學領域。
【背景技術】
[0002]在疾病體外診斷方面，高特異性、高靈敏度和高通量特性的檢測技術是人們一直追求的目標。新的快速檢測方法的建立，簡化了操作流程，降低檢測成本，提高了檢測的時效性和準確性。人們利用病原體的快速檢出技術可以掌握傳染病的流行狀況，這對及早做出正確的臨床決策意義重大，然而目前在臨床生物標志物檢測上廣泛應用的方法是酶聯免疫吸附法(以下簡稱ELISA)，由于其中等程度的敏感性，只有生物標志物的水平已經達到臨界閾值濃度后才能檢測，限制了其用于疾病早期檢測應用。再者，基于聚合酶鏈式反應(PCR)的檢測技術在近幾年層出不窮，雖然PCR技術有著超高的靈敏度，然而同時，該技術需要昂貴的實驗設備、試劑和技術工人，這些因素大大限制了其廣泛應用，尤其是在偏遠地區如發展中國家。因此臨床上對于可替代PCR技術的超高靈敏檢測方法的需求尤為緊迫。正如20世紀70年代的微米技術一樣，納米技術將成為21世紀的主導技術，為生物診療領域的發展提供了很大空間。目前光、磁和電響應納米粒子已經廣泛應用于納米醫學、分子影像學等領域。

【發明內容】

[0003]本發明的首要目的在于提供一種生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針；
[0004]本發明的另一目的在于提供一種新的生物功能化磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針的制備方法；
[0005]本發明的再一目的是提供一種利用所述的生物功能化磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針作為疾病標識物或病原微生物檢測系統的應用。
[0006]本發明的目的可以通過如下技術方案實現:
[0007]—種生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征為含有檢測抗體及具有生物酶活性物質表面修飾的磁珠納米粒子(0.5mg/ml-5mg/ml,更優選的較窄范圍為0.8mg/ml-l.2mg/ml)，和可被上述酶催化的底物(0.1mM-lOOmM，更優選的較窄范圍為ImM-1OmM)，及氯金酸(10 μ M-lOmM，更優選的較窄范圍為100 μ M-1mM)-金納米顆粒溶液(InM-lOOnM，更優選的較窄范圍為InM-1OnM)。
[0008]或所述的探針不包括磁珠納米顆粒，即該探針僅包括檢測抗體及具有生物酶活性物質，和可被上述酶催化的底物(ImM-lOOmM，更優選的較窄范圍為ImM-1OmM)，及氯金酸(1μΜ-10πιΜ，更優選的較窄范圍為100 μ M-1mM)-金納米顆粒(ΙηΜ-ΙΟΟηΜ，更優選的較窄范圍為InM-1OnM)溶液。
[0009]其中，所述的磁珠納米微球顆粒包括磁性納米顆粒、碳納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、乳膠體納米顆粒、陶瓷納米顆粒、聚合物納米顆粒。本發明優選采用磁珠納米微球顆粒。
[0010]其中，所述的金納米顆粒包括金納米粒子、金納米棒、金納米星、金納米囊,金納米籠或金納米殼中的至少一種。
[0011]其中，所述的抗體，為一種或多種檢測抗體，其根據檢測靶標物質而定。其濃度可以為 Iy g/ml-50mg/ml,優選為 100 μ g/ml-lOmg/ml,更優選為 500 μ g/ml_5mg/ml ;所述的抗體，其為鼠源或人源或羊源或其它動物來源，或為基因工程抗體，如人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體等。本發明優選鼠源單克隆抗體。
[0012]其中，所述的將具有酶活性功能的物質與納米微球顆粒通過化學偶聯的方式進行結合，所述偶聯可以是炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法等。本發明優選采用活潑酯法。其中，所述的具有酶活性物質包括糖氧化酶類、羧酸酯酶類、硫酯酶類、磷酸單酯酶類磷、磷酸二酯酶類、硫磷酸酯酶等。本發明優選采用葡萄糖氧化酶(GOx)。
[0013]其中，所述的可以被具有酶活性物質所催化的底物包括糖類、羧酸酯類、硫酯類、磷酸單酯類、磷酸二酯類、硫磷酸酯類等。本發明優選采用β-D-葡萄糖。
[0014]其中，將抗體與具有酶活性物質通過化學偶聯的方式進行結合，所述偶聯可以是炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法等，本發明優選采用炔烴-疊氮法、活潑酯法。
[0015]生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針制備方法，包括
[0016]1)0.5mg/ml-5mg/ml磁珠納米微球顆粒溶液中加入過量的酶活性物質，反應
0.5-3小時后，分離去除過量的酶活性物質。后加入可發生化學偶聯的基團。
[0017]2)將檢測抗體加入可與I)中化學偶聯基團反應的另一基團。室溫下反應0.5-3小時，利用離心方法去除未結合的基團。
[0018]3)將I)與2)分別得到的產物混合，得到生物功能化的磁珠納米微球顆粒。
[0019]4)混有可被酶活性物質催化的0.1mM-1OOmM相關底物和含有10 μ M-1OmM氯金酸和InM-1OOnM金納米顆粒的溶液混合，即得到金納米顆粒復合溶液；
[0020]5)生物功能化的磁珠納米微球顆粒和金納米顆粒復合溶液即組成了生物功能化的納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針。
[0021]更佳地，生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針的制備方法，包括以下步驟:
[0022]I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠納米顆粒(10mg/mL)于小離心管中，借助于磁力架，用鹽酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的葡萄糖氧化酶(3mg/mL)，渦旋混勻30秒。后將該混合物置于振蕩器中反應2小時，反應條件為室溫。在開始的30分鐘，每隔5分鐘將小離心管渦旋振蕩15秒。剩余的90分鐘，每15分鐘將小離心管渦旋振蕩15秒，從而得到結合了葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒。后加入5 μ LNHS活化的疊氮基團(ImM)，室溫反應30分鐘，從而得到偶聯了疊氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒。
[0023]2)取ImL檢測抗體(lmg/mL)，抗體緩沖環境為PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DBCO(dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗體中，DBCO與抗體的摩爾比為50:1。室溫反應30分鐘后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以終止反應，Tris終濃度為50mM，終止反應持續5分鐘。即得到偶聯了 DBCO的抗體溶液。
[0024]3)取10 μ L偶聯了 DBCO的抗體溶液(lmg/mL)加入到ImL偶聯了疊氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒(lmg/mL)中，室溫反應2小時，即得到了偶聯了抗體和葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒。
[0025]4) β-D-葡萄糖(5mM)和氯金酸(0.6mM)金納米顆粒(5nm,8.3nM)的混合物即為金納米顆粒復合溶液。
[0026]本發明研制出一種生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針及其制備方法。該探針主要有兩大部分組成，其一為生物功能化的磁珠納米微球顆粒，其二為金納米顆粒復合溶液，其特征為含有檢測抗體及具有生物酶活性物質表面修飾的磁珠納米粒子和可被上述酶催化的底物及金納米顆粒。磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針能與疾病病原體生物標識物高效識別，附著于磁珠納米微球顆粒表面的具有生物酶活性物質可以將其可催化的底物降解為帶正電的產物，該產物可以引起金納米顆粒的聚集，從而導致金納米顆粒溶液吸光值的變化。吸光值變化的程度與樣品中的生物標識物的濃度成比例。并且吸光值的變化肉眼可見。
[0027]磁珠納米顆粒具有較高的惰性，苛刻的環境對其影響小，同時其具有較強的人工可修飾性，在其表面修飾一定的化學基團，從而可以進一步偶聯生物活性物質，對其進行功能性改造。磁珠納米顆粒還具有較大的體表面積，每個磁珠顆粒上可以附著巨大數量的生物活性物質，從而起到信號放大的作用，實現對較低含量靶標物質的檢出。在金納米顆粒溶液中，金納米顆粒表面附著一層檸檬酸鹽，表面帶有均勻的負電荷，使金納米顆粒均勻地分布在溶液中。較低濃度的小粒徑金納米顆粒溶液是無色的，隨著金納米顆粒粒徑的增加，金納米顆粒溶液顏色會發生改變，伴隨著吸光值的變化。該過程可以通過如下反應實現:在過氧化氫和氯金酸的存在下，過氧化氫會氧化氯金酸，其產生金會附著在原本的金納米顆粒表面，從而導致金納米顆粒粒徑的增加。金納米顆粒溶液從無色變為有色的這一過程，吸光值發生變化，吸光值變化的程度與樣品中的生物標識物的濃度成比例。本發明方法大大提高了疾病生物標志物的檢測靈敏度，可對疾病生物標識物進行定量，具有較寬的線性范圍，并同時具有設備簡易、操作簡單、且能批量檢測的優點。
[0028]本發明的有益效果:
[0029]本發明在固相納米微球上進行生物功能化修飾，附著于其上的大量酶活性物質催化其底物產生過氧化氫，過氧化氫可以氧化氯金酸，產物附著在小顆粒的金納米顆粒上，造成金納米顆粒粒徑的增大，低濃度的小粒徑金納米顆粒是無色的，隨著粒徑的增大，金納米顆粒顏色發生變化，從而吸光值發生變化，吸光值的變化與相關疾病標識物或病原微生物的濃度成正比，從而實現對疾病標識物或病原微生物的檢出。該方法具有極高的靈敏度，實驗證明，相比于ELISA試劑盒，靈敏度提高約IO4倍。
[0030]另外，該探針可以實現對待檢物質的定量檢測，并且線性范圍可覆蓋5個數量級。
[0031]另外，簡單的檢測手段也是本發明的一大亮點，肉眼對金納米顆粒溶液顏色變化的觀察與儀器對金納米顆粒溶液吸光值變化的測量具有極高的符合度，即用肉眼即可觀測到極低濃度待檢物質的檢出。[0032]再者，該檢測探針的檢測方法簡單，所用試劑耗材成本低，反應載體與ELISA試劑盒相同，微孔板即可滿足條件，從而實現對待檢物質進行高通量檢測，也更利于在臨床檢測上的推廣應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為生物功能化的磁珠納米微球顆粒構建示意圖。
[0034]圖2為利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針檢測原理圖。
[0035]圖3為不同濃度過氧化氫加入含有氯金酸-金納米顆粒溶液中，引起的顏色變化
(a)，及吸光值的變化(b)及530nm(A530)光波長吸光值變化(C)。
[0036]圖4為不同濃度過氧化氫加入到含有氯金酸-金納米顆粒溶液中引起的金納米顆粒粒徑增加的投射電鏡照片。
[0037]圖5為利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針檢測梯度稀釋的前列腺特異抗原(PSA)肉眼觀測(a)及吸光值變化(b)結果圖。
[0038]圖6為在磁珠納米微球顆粒部分缺失的情況下，吸光值變化結果圖。
[0039]圖7為利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針(a)和商品化試劑盒(b)檢測臨床樣品(前列腺癌患者，健康人群)結果比較圖。
[0040]圖8為利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針和商品化試劑盒對前列腺癌患者樣品進行定量結果比較圖。
【具體實施方式】
[0041]以下通過具體的制備例和實施例可使本發明得到更清楚地說明:
[0042]制備例1:以下步驟中的所使用的化學物質為市售商品。
[0043]生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針的制備及用于疾病標識物或病原微生物(以疾病標志物PSA為例)的檢測方法，包括以下步驟:
[0044]I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠納米顆粒(10mg/mL)于小離心管中，借助于磁力架，用鹽酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的葡萄糖氧化酶(3mg/mL)，渦旋混勻30秒。后將該混合物置于振蕩器中反應2小時，反應條件為室溫。在開始的30分鐘，每隔5分鐘將小離心管渦旋振蕩15秒。剩余的90分鐘，每15分鐘將小離心管渦旋振蕩15秒，從而得到結合了葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒。后加入5uL NHS活化的疊氮基團(ImM)，室溫反應30分鐘，從而得到偶聯了疊氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒。
[0045]2)取 ImL PSA 檢測抗體(lmg/mL)，抗體緩沖環境為 PBS (pH = 7.4)，取 33 μ L NHS活化的DBCO(Dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗體中，DBCO與抗體的摩爾比為50:1。室溫反應30分鐘后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以終止反應，Tris-HCl終濃度為50mM，終止反應持續5分鐘。即得到偶聯了 DBCO的抗體溶液。
[0046]3)取10 μ L偶聯了 DBCO的抗體溶液(lmg/mL)加入到ImL偶聯了疊氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒(lmg/mL)中，室溫反應2小時，即得到了偶聯了抗體和葡萄糖氧化酶的磁珠納米顆粒。[0047]4) β-D-葡萄糖(5mM)和氯金酸(0.6mM)金納米顆粒(5nm,8.3nM)的混合物即為金納米顆粒復合溶液。
[0048]5)將抗PSA 的捕獲抗體(Abl)溶于 100mMNa2C03-NaHC03 (pH9.6)緩沖液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C過夜或常溫4小時后，加入PBS沖洗3次，加1%牛血清白蛋白(BSA)進行封閉(37°C，1小時)。
[0049]6)將標準PSA樣品用PBS或者牛血清稀釋不同濃度，用單獨PBS或牛血清作為陰性對照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下溫育I小時。
[0050]7)PBS沖洗3次，每孔加入100 μ L抗體-葡萄糖氧化酶-磁珠納米顆粒溶液(0.lmg/mL)，在37°C下溫育20分鐘。
[0051 ] 8) PBST沖洗3次，每孔加入100 μ L5mM β -D-葡萄糖(溶于檸檬酸_Na2HP04，pH =5.0)，在35°C下溫浴10分鐘。
[0052]9)后加入50 μ I氯金酸(0.6mM)和5nm金納米顆粒(8.3nM)混合溶液，在35°C下溫浴20分鐘，用讀板儀讀取530nm光波長吸光值。
[0053]制備例(2)
[0054]不含有磁珠納米顆粒微球探針的制備及用于疾病標識物或病原微生物(以疾病標志物PSA為例)的檢測方法，包括以下步驟:
[0055]I)取100 μ L溶解于PBS中的葡萄糖氧化酶(3mg/mL)，加入5 μ L NHS活化的疊氮基團(ImM)，室溫反應30分鐘。
[0056]2)取ImL檢測抗體(lmg/mL)，抗體緩沖環境為PBS (pH = 7.4)，取33 μ L NHS活化的DBCO(IOmM)加入到抗體中，DBCO與抗體的摩爾比為50:1。室溫反應30分鐘后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以終止反應，Tris-HCl終濃度為50mM，終止反應持續5分鐘。即得到偶聯了 DBCO的抗體溶液。
[0057]3)取10 μ L偶聯了 DBCO的抗體溶液(lmg/mL)加入到ImL偶聯了疊氮基和葡萄糖氧化酶溶液中室溫反應2小時，即得到了偶聯了抗體和葡萄糖氧化酶偶聯的復合物。
[0058]4) β-D-葡萄糖(5mM)和氯金酸(0.6mM)金納米顆粒(5nm,8.3nM)的混合物即為金納米顆粒復合溶液。
[0059]5)將抗 PSA 的捕獲抗體(Abl)溶于 IOOmMNa2CO3-NaHCO3 (pH9.6)緩沖液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C過夜或常溫4小時后，加入PBS沖洗3次，加I %牛血清白蛋白(BSA)進行封閉(37°C，1小時)。
[0060]6)將標準PSA樣品用PBS或者牛血清稀釋不同濃度，用單獨PBS或牛血清作為陰性對照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下溫育I小時。
[0061]7) PBS沖洗3次，每孔加入100 μ L抗體-葡萄糖氧化酶溶液，在37°C下溫育20分鐘。
[0062]8) PBST沖洗3次，每孔加入100 μ L5mM β -D-葡萄糖(溶于檸檬酸_Na2HP04，pH =
5.0)，在35°C下溫浴10分鐘。
[0063]9)后加入50 μ I氯金酸(0.6mM)和5nm金納米顆粒(8.3nM)混合溶液，在35°C下溫浴20分鐘，用讀板儀讀取530nm光波長吸光值。
[0064]實施例1
[0065]將不同濃度過氧化氫加入制備例(I)所述的含有氯金酸-金納米顆粒溶液中，可以清晰看到發生的變化，隨著過氧化氫濃度的增高，氯金酸-金納米顆粒溶液顏色變得越深(圖3a)，吸光圖譜的變化(圖3b)以及在530nm光波長吸光值的變化(圖3c)。在透射電鏡下也可以看到不同濃度過氧化氫加入到含有氯金酸和5nm金顆粒溶液中引起的金納米顆粒粒徑增大(圖4)。
[0066]實施例2
[0067]利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針對極低濃度梯度的PSA(分別為0、10、102、103、104、105fg/ml)進行檢測，檢測操作步驟見制備例(I)。可以看到該探針可以檢測低至fg級別。并且定量檢測線性范圍寬達10fg-100000fg。(圖5)靈敏度可以比ELISA試劑盒高約100000倍(ELISA試劑盒靈敏度約10ng/ml)。
[0068]實施例3
[0069]在磁珠納米微球顆粒部分缺失的情況下，對臨床樣本進行定量檢測，檢測能力可達fg級(圖6)，靈敏度可以比ELISA試劑盒高約100倍(ELISA試劑盒靈敏度約10ng/ml)。
[0070]實施例4
[0071]利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針檢測臨床樣本(前列腺癌患者血清，健康人群血清)，操作步驟見制備例(1)，并以商品化ELISA試劑盒作為對照試劑。商品化試劑盒檢測方法為該ELISA試劑盒的說明書，對12份前列腺癌患者血清檢出10份陽性，對健康人群血清沒有檢出。而利用本發明制備例(I)的探針對12份前列腺癌患者血清均檢測為陽性，沒有漏檢，對健康人群血清同樣沒有檢出(圖7)。說明該探針在檢測試劑標本時亦可發揮出高靈敏檢出的能力，對商品化試劑盒不能檢出的樣品能夠補充檢出，并且特異性良好。
[0072]實施例5
[0073]利用生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針檢測生物標準品建立的定量方法和商品化ELISA定量試劑盒對臨床樣本進行定量比較，商品化試劑盒檢測方法為該ELISA試劑盒的說明書。
[0074]結果發現本發明制備例(I)的探針與定量試劑盒的定量結果極為接近(圖8)，表明該探針可以對臨床樣本進行精確定量。
[0075]本發明研制出的一種新的生物功能化磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，該探針具有極高的靈敏度，對疾病標識物或病原微生物的檢測能力可達fg級，靈敏度比ELISA試劑盒高約10000倍，結果判定簡單，肉眼可實現簡單判定，利用儀器可以實現對疾病標識物或病原微生物的精確定量，并且定量的線性范圍可寬達5個數量級，該探針且具有優良的特異性。該檢測探針的檢測方法簡單，所用試劑耗材成本低，反應載體與ELISA試劑盒相同，微孔板即可滿足條件，從而實現對待檢物質進行高通量檢測，也更利于在臨床檢測上的推廣應用。本發明所用的磁珠納米微球顆粒部分亦可缺失，從而使得檢測方法更為簡單，并具有比ELISA試劑盒靈敏度高約100倍的靈敏度。
[0076]在磁珠納米微球顆粒部分缺失的情況下，可以將檢測抗體或核酸適配體直接標記生物酶活性物質(類似于ELISA試劑盒中的酶標記抗體)，后續檢測步驟相同，同樣需要加入可以被酶活性物質催化的底物和氯金酸-金納米顆粒，過氧化氫和氯金酸反應的產物附著在金納米顆粒上，造成金納米顆粒粒徑的增加，使得金納米顆粒溶液吸光值發生變化，從而達到對待檢物質的高效檢出。雖然缺失了磁珠納米微球對抗體或核酸適配體的高效富集，損失了一定的靈敏度，但利用金納米顆粒的信號放大效果，仍然能夠達到比ELISA試劑盒靈敏度高約100倍的檢測效果。
[0077]本發明所用的磁珠納米微球顆粒部分包括并不限于磁性納米顆粒，其他更多可選納米顆粒包括但不限于碳納米顆粒、二氧化娃納米顆粒、乳膠體納米顆粒、陶瓷納米顆粒、聚合物納米顆粒等，制備方法類似。本發明所用的金納米顆粒包括金納米粒子、金納米棒、金納米星、金納米囊，金納米籠或金納米殼等。其他更多可選酶活性功能的物質包括并不限于葡萄糖氧化酶等，其他更多可選偶聯方法包括并不限于炔烴-疊氮法、活潑酯法等，制備方法類似。
【權利要求】
1.一種生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于所述的探針包括檢測抗體及0.5mg/ml-5mg/ml具有生物酶活性物質表面修飾的磁珠納米顆粒，和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物，及10 μ M-1OmM氯金酸-1nM-1OOnM金納米顆粒溶液；或所述的探針不包括磁珠納米顆粒，即該探針僅包括檢測抗體及具有生物酶活性物質,和ImM-1OOmM可被上述酶催化的底物,及I μ M-1OmM氯金酸-1nM-1OOnM金納米顆粒溶液。
2.如權利要求1所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，所述的磁珠納米微球顆粒包括磁性納米顆粒、碳納米顆粒、二氧化娃納米顆粒、乳膠體納米顆粒、陶瓷納米顆粒或聚合物納米顆粒中的至少一種。
3.如權利要求1所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，所述的金納米顆粒包括金納米粒子、金納米棒、金納米星、金納米囊，金納米籠或金納米殼中的至少一種。
4.如權利要求1所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，所述的具有酶活性物質包括糖氧化酶類、羧酸酯酶類、硫酯酶類、磷酸單酯酶類磷、磷酸二酯酶類、硫磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶中的至少一種。
5.如權利要求4所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，可被權利要求4中酶活性物質催化的底物，包括糖類、羧酸酯類、硫酯類、磷酸單酯類、磷酸二酯類或硫磷酸酯中的至少一種。
6.如權利要求1所 述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，所述的抗體為一種或多種檢測抗體，抗體為人源或動物來源，或為基因工程抗體。
7.如權利要求1所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，將具有酶活性功能的物質與納米微球顆粒通過化學偶聯的方式進行結合，所述偶聯包括炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法中的一種或其結合。
8.如權利要求1所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針，其特征在于，將抗體與具有酶活性物質通過化學偶聯的方式進行結合，所述偶聯包括炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法中的一種或其結合。
9.如權利要求1至8任一項所述的生物功能化的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針制備方法，包括如下步驟: 1)0.5mg/ml-5mg/ml磁珠納米微球顆粒溶液中加入過量的酶活性物質，反應0.5-3小時后，分離去除過量的酶活性物質，后加入可發生化學偶聯的基團； 2)將檢測抗體加入可與I)中所述的基團反應的另一基團，室溫下反應0.5-3小時，利用離心方法去除未結合的基團； 3)將I)與2)分別得到的產物混合，得到生物功能化的磁珠納米微球顆粒； 4)混有可被酶活性物質催化的0.1mM-1OOmM相關底物和含有10 μ M-1OmM氯金酸和InM-1OOnM金納米顆粒的溶液混合,即得到金納米顆粒復合溶液； 5)生物功能化的磁珠納米微球顆粒和含有氯金酸和金納米顆粒復合溶液即組成了生物功能化的納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針。
10.如權利要求1至8任一項所述的磁珠納米微球顆粒聯合氯金酸-金納米顆粒探針的用途，其用于制備疾 病標識物或病原微生物檢測試劑。
【文檔編號】G01N21/31GK103940765SQ201410171205
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】劉剛, 陳小元, 劉定斌, 王占通, 王浩鵬 申請人:廈門大學