一種通過tead4細胞核陽性表達情況對結直腸癌評價的方法
【專利摘要】本發明涉及一種通過TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌評價的方法，即首先制成腫瘤組織芯片，然后進行免疫組化實驗、免疫評分，根據免疫評分進行分組，最后按照TEAD4的細胞核著染情況將患者分為TEAD4細胞核陽性表達組和TEAD4細胞核陰性表達組，然后運用統計學方法分析兩組病人的臨床特征以及總生存期的差異。發明的一種通過結直腸癌免疫學指標TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌患者的臨床特征和總體預后進行評價的方法，即根據結直腸癌患者腫瘤組織中TEAD4細胞核陽性表達的情況可以直接確定患者的臨床特征和預后信息。
【專利說明】—種通過TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌評價的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種方法，具體地說，是關于一種通過TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌評價的方法。
【背景技術】
[0002]結、直腸癌是我國常見的惡性腫瘤。占我國惡性腫瘤的第四位，并有上升的趨勢。中國人結、直腸癌與西方人比較有3個流行病學特點:①直腸癌比結腸癌發病率高，約1.5: I ;②低位直腸癌在直腸癌中所占比例高，約占75%，大多數直腸癌可在直腸指檢時觸及；③青年人(<30歲)患者比例較高，約占15%。但近幾十年來，隨著人民生活水平的提高及飲食結構的改變，結腸癌比例亦逐漸增多。但是關于一種通過結直腸癌免疫學指標TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌患者的臨床特征和預后進行評價的方法，目前還未見報道。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種通過結直腸癌免疫學指標TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌患者的臨床特征和預后進行評價的方法。
[0004]為實現上述目的，本發明采取的技術方案是:
[0005]一種通過TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌評價的方法，包括如下步驟:
[0006](I)、制成腫瘤組織蠟塊；
[0007](2)、根據HE染色確定步驟(I)所得的蠟塊中腫瘤組織的位置，選取其中的腫瘤組織的中央部位制成組織芯片；
[0008](3)、對步驟⑵所得的組織芯片、陽性對照和陰性對照進行免疫組織化學染色；其中所述的陽性對照使用已證實為陽性組織的腫瘤細胞組織制成的組織芯片；所述的陰性對照使用相同的組織芯片；
[0009](4)、組織芯片常規脫蠟、水化；
[0010](5)、微波抗原修復；
[0011](6)、滅活內源性過氧化物酶；
[0012](7)、封閉非特異性蛋白；
[0013](8)、滴加一抗
[0014]TEAD4—抗用5%的牛血清白蛋白水溶液按1: 50稀釋，至于濕盒里4°C孵育過夜；陰性對照中以PBS緩沖液代替一抗；
[0015](9)、復溫 45 分鐘；
[0016](10)、滴加二抗；
[0017](11)、DAB 顯色；
[0018](12)、蘇木素復染；[0019](13)、脫水和透明；
[0020](14)、封片；
[0021](15)、結果分析:
[0022]陽性信號為棕黃色顆粒，用徠卡光學顯微鏡在200倍放大倍數下，對上述所得的每個組織位點拍攝五張圖片，記錄圖片中TEAD4陽性染色細胞核的顏色強度；
[0023]若沒有棕黃色著染的細胞核，則免疫評分為O分；
[0024]若陽性染色細胞核的強度為淺棕色，則免疫評分為I分；
[0025]若陽性染色細胞核的強度為中度棕色，則免疫評分為2分；
[0026]若陽性染色細胞核的強度為深棕色，則免疫評分為3分；
[0027](16)、根據步驟(15)所得的免疫評分進行分組，免疫評分為0、1、2的歸為一組即為TEAD4細胞核陰性表達的一組，免疫評分為3的歸為一組即為TEAD4細胞核陽性表達的
一組；
[0028](17)、利用Spssll.0分析軟件和Graph Pad prism5作圖軟件,按照步驟(16)的分組對TEAD4細胞核陽性和陰性表達情況與患者的臨床特征和總生存率的關系進行分析，來判定TEAD4的細胞核表達情況與結直腸癌患者的預后效果。
[0029]所述，步驟(5)所述的微波抗原修復，即將組織切片浸于由檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉和純水配制的抗原修復液中，于微波爐中高火檔加熱3分鐘，然后中低火檔加熱4分鐘X2次，取出后室溫下冷卻，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘X 3次。
[0030]所述，步驟(6)所述的滅活內源性過氧化物酶，即用30%過氧化氫和甲醇按1: 9配成的滅活液，將組織切片浸泡在滅活液中30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶后，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘X 3次。
[0031]所述，步驟(7)所述的封閉非特異性蛋白即將組織切片擦洗干凈，在每張組織切片上滴加50微升的封閉液即5%的BSA水溶液，孵育30分鐘，封閉非特異性抗原。
[0032]所述，步驟(10)所述的滴加二抗即將切片置入濕盒中，用濾紙將組織周圍的水分吸去，每張組織切片滴加抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒中的A液即辣根過氧化物酶聚合物一滴，室溫下孵育半小時。
[0033]本發明優點在于:發明的一種通過結直腸癌免疫學指標TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌患者的臨床特征和總體預后進行評價的方法，即根據結直腸癌患者腫瘤組織中TEAD4細胞核陽性表達的情況可以直接確定患者的臨床特征和預后信息。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1、在200和400放大倍數下正常組織TEAD4免疫評分為O分；
[0035]圖2、在200和400放大倍數下腫瘤組織TEAD4免疫評分為O分；
[0036]圖3、在200和400放大倍數下腫瘤組織TEAD4免疫評分為I分；
[0037]圖4、在200和400放大倍數下腫瘤組織TEAD4免疫評分為2分；
[0038]圖5、在200和400放大倍數下腫瘤組織TEAD4免疫評分3分；
[0039]圖6、生存期和總生存率的關系圖。
【具體實施方式】[0040]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0041]本發明實施例中所用的426個結直腸癌組織的蠟塊都來自上海交通大學附屬新華醫院結直腸肛門疾病外科。本實驗通過了新華醫院倫理委員會，每位患者都簽訂了知情同意書。
[0042]免疫組織化學方法，參考王光輝2013年Identificationof MXRA5as a noveltissue biomarker for colorectal cancer progression。
[0043]所用作圖軟件為Graph Pad prism5，分析軟件為Spssll.0。
[0044]本發明的實施例中所用到的試劑見表1，主要實驗儀器與耗材見表2，實驗所用配制試劑的見表3。
[0045]表1實驗試劑
[0046]
【權利要求】
1.一種通過TEAD4細胞核陽性表達情況對結直腸癌評價的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)、制成腫瘤組織蠟塊； (2)、根據HE染色確定步驟(1)所得的蠟塊中腫瘤組織的位置，選取其中的腫瘤組織的中央部位制成組織芯片； (3)、對步驟(2)所得的組織芯片、陽性對照和陰性對照進行免疫組織化學染色；其中所述的陽性對照使用已證實為陽性組織的腫瘤細胞組織制成的組織芯片；所述的陰性對照使用相同的組織芯片； (4)、組織芯片常規脫蠟、水化； (5)、微波抗原修復； (6)、滅活內源性過氧化物酶； (7)、封閉非特異性蛋白； (8)、滴加一抗 TEAD4 一抗用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀釋，至于濕盒里4°C孵育過夜；陰性對照中以PBS緩沖液代替一抗； (9)、復溫45分鐘； (10)、滴加二抗； (11)、DAB顯色； (12)、蘇木素復染； (13)、脫水和透明； (14)、封片； (15)、結果分析: 陽性信號為棕黃色顆粒，用徠卡光學顯微鏡在200倍放大倍數下，對上述所得的每個組織位點拍攝五張圖片，記錄圖片中TEAD4陽性染色細胞核的顏色強度； 若沒有棕黃色著染的細胞核，則免疫評分為O分； 若陽性染色細胞核的強度為淺棕色，則免疫評分為I 分； 若陽性染色細胞核的強度為中度棕色，則免疫評分為2分； 若陽性染色細胞核的強度為深棕色，則免疫評分為3分； (16)、根據步驟(15)所得的免疫評分進行分組，免疫評分為0、1、2的歸為一組即為TEAD4細胞核陰性表達的一組，免疫評分為3的歸為一組即為TEAD4細胞核陽性表達的一組； (17)、利用Spssll.0分析軟件和Graph Pad prism 5作圖軟件,按照步驟(16)的分組對TEAD4細胞核陽性和陰性表達情況與患者的臨床特征和總生存率的關系進行分析，來判定TEAD4的細胞核表達情況與結直腸癌患者的預后效果。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述的微波抗原修復，即將組織切片浸于由檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉和純水配制的抗原修復液中，于微波爐中高火檔加熱3分鐘，然后中低火檔加熱4分鐘X 2次，取出后室溫下冷卻，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘X 3次。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(6)所述的滅活內源性過氧化物酶，即用30%過氧化氫和甲醇按1:9配成的滅活液，將組織切片浸泡在滅活液中30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶后，用PBS緩沖液洗滌，5分鐘X 3次。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(7)所述的封閉非特異性蛋白即將組織切片擦洗干凈，在每張組織切片上滴加50微升的封閉液即5%的BSA水溶液，孵育30分鐘，封閉非特異性抗原。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(10)所述的滴加二抗即將切片置入濕盒中，用濾紙將組織周圍的水分吸去，每張組織切片滴加抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒中的A液即辣根過氧化物酶聚合物一滴，室溫下孵育半小時。
【文檔編號】G01N33/574GK103954757SQ201410169571
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】崔龍, 劉云, 劉辰瑩, 王光輝 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院