一種酶電極、酶生物傳感器及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種酶電極、酶生物傳感器及其制備方法和應用。所述酶電極包括基底電極，所述基底電極表面附有碳化蛋殼膜，所述碳化蛋殼膜上固定化有納米金屬顆粒和酶。本發明的酶電極以蛋殼膜和納米金屬顆粒復合材料作載體，來實現酶分子的有效固定和酶與電極之間的直接電子轉移，提高酶分子催化活性和傳感器的靈敏度。與現有技術相比，本發明的酶電極以蛋殼膜為材料，實現廢棄物重復利用，制作方法簡單、成本低廉，電極和酶之間的電子傳遞速率高；本發明的酶生物傳感器檢測靈敏度高、快捷準確、穩定性和重復性好。
【專利說明】一種酶電極、酶生物傳感器及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物傳感器【技術領域】，尤其涉及一種酶電極、酶生物傳感器及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]在生物傳感器領域，酶電極占有重要的地位。目前廣泛研究的第三代傳感器則是利用酶本身與電極間的直接電子轉移來完成信號的轉換，無需引入媒介體，大大提高了傳感器的性能。要實現酶和電極之間比較有效的直接電子轉移，就要構造一個合適的薄膜電極界面，而在這個薄膜電極界面的構造中，只有那些生物相容性比較好又能在酶和電極之間的直接電子轉移方面起促進作用的材料才是首選。
[0003]多種利用酶或酶-媒介體修飾的電化學傳感器已用于底物測定。在生物傳感器的研制中，酶的固定化是影響其分析性能的關鍵步驟。納米微粒由于其特殊類型的結構，可增強酶的吸附量并保持其生物活性。其具有比表面積大、吸附能力強、良好的生物相容性等優點，可將生物分子強有力地固定在其表面制得的生物傳感器上。利用納米顆粒固定生物分子于電極表面構建傳感界面，有利于保持生物分子的活性，為生物傳感器的發展開辟了新途徑。如中國專利申請CN103207224A公開了一種基于螺旋碳納米纖維和金膠納米粒子的復合材料作為血紅蛋白的載體的酶生物傳感器，促進了血紅蛋白與電極間的電子傳遞，但其制作程序復雜，材料成本較高。
[0004]隨著不可再生資源的消耗和環境污染的加劇，人們對低成本和環境友好型高功率能量源的需求越來越迫切。蛋殼膜由于自身具有三維網狀結構和電化學穩定性高等特點，可作為一種可持續資源，用于清潔能源存儲。如中國專利申請CN103258654A公開了一種基于蛋殼內膜的非對稱超級電容器的制造方法，將蛋殼內膜碳化及空氣中活化處理后作為高能量、高功率密度的超級電容器材料，其循環穩定性也達到使用水平。
[0005]目前，全球每年消耗I萬億顆蛋類，一顆蛋可以提煉30-40毫克成品碳，而蛋殼膜由于生物兼容性好，將蛋殼膜用于研制生物傳感器尚無報道。蛋殼膜作為日常廢棄物，能夠與蛋白質或酶結合，其為酶在傳感器的固定提供良好的微環境，用于高靈敏度酶催化及底物檢測值得研究。迄今為止，國內外尚未有利用蛋殼膜材料及納米顆粒制備的生物傳感器。所以發明一種成本低、檢測限低、響應時間短、靈敏度高、穩定性好的生物傳感器是一個迫切需要解決的重要技術問題。
【發明內容】
[0006]針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種酶電極、酶生物傳感器及其制備方法和應用。所述酶電極以蛋殼膜和納米粒子復合材料作載體，來實現酶分子的有效固定和酶與電極之間的直接電子轉移，從而達到提高酶分子催化活性、提高傳感器靈敏度的目的。
[0007]為實現本發明的目的，本發明提供如下技術方案:[0008]在第一方面，本發明提供一種酶電極，包括基底電極，所述基底電極表面附有碳化蛋殼膜，所述碳化蛋殼膜上固定化有納米金屬顆粒和酶。
[0009]作為本發明的優選方案，所述基底電極為玻碳電極(GCE)、銦錫氧化物電極(ITO)、熱解石墨電極(PG)、碳糊電極(CPE)或金屬電極。
[0010]優選地，所述基底電極為Al2O3拋光過的玻碳電極、銦錫氧化物電極、熱解石墨電極、碳糊電極或金屬電極。
[0011]優選地，所述金屬電極為金電極或銀電極，優選為金電極(Au)。
[0012]作為本發明的優選方案，所述蛋殼膜來源于雞蛋殼、鴨蛋殼、鵝蛋殼或鵪鶉蛋殼。所述蛋殼膜并不局限于上述來源，任何禽類包括鴕鳥的蛋殼都可以用于提供本發明的蛋殼膜。
[0013]作為本發明的優選方案，所述納米金屬顆粒為納米金顆粒、納米銀顆粒、納米銅顆粒、納米鈀顆粒和納米鉬顆粒中的I種或至少2種的組合。可以單獨使用I種納米金屬顆粒，也可以組合使用至少2種納米金屬顆粒。
[0014]作為本發明的優選方案，所述酶為辣根過氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOX)、血紅蛋白(Hb)、漆酶、脫氫酶或氧化還原酶中的I種或至少2種的組合。
[0015]在第二方面，本發明提供一種制備第一方面所述的酶電極的方法，包括如下步驟:將剝離出的蛋殼膜貼至基底電極表面，在保護性氣氛中加熱碳化處理形成附在所述基底電極表面的碳化蛋殼膜；將納米金屬顆粒和酶固定化至所述碳化蛋殼膜上形成所述酶電極。
[0016]作為本發明的優選方案，所述基底電極在使用前用Al2O3拋光。雖然Al2O3拋光并非本發明的必須步驟，但是Al2O3拋光能夠增加蛋殼膜的附著性，使得基底電極上附著的蛋殼膜更多、更穩定，利于納米金屬顆粒和酶的固化，從而得到的酶電極具有更好、更穩定的性能。
[0017]優選地，所述基底電極在使用前用粒徑為0.05?1.0 μ m的Al2O3漿液拋光。
[0018]優選地，所述拋光后分別用乙醇和蒸餾水超聲清洗。
[0019]優選地，所述超聲清洗的時間為2?5min,例如可選擇2?4min、3?5min、3?4min、2 ?3min 等，優選 2 ?3min。
[0020]優選地，所述拋光具體可以是:將基底電極用Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水超聲清洗。
[0021]作為本發明的優選方案，所述碳化處理前對貼至基底電極表面的蛋殼膜進行干燥處理。
[0022]優選地，所述干燥處理具體為在烘箱內由室溫開始以2?5min內溫度上調3?50C的速率上調至60?80°C，整個干燥過程持續4?5h。例如可選擇每5min上調5°C、每2min上調5°C、每3min上調4°C、每2min上調3°C，優選為每5min上調5°C ;最高干燥溫度為60?80°C，優選為80°C。
[0023]優選地，所述碳化處理在馬弗爐中進行。
[0024]優選地，所述碳化處理的溫度為500?1000°C，例如可選擇550?998°C、600?950°C、635 ?904°C、680 ?836°C、630 ?800°C、500 ?725°C、580 ?700°C、635 ?870°C、500?960 °C等，優選為700?800 °C。
[0025]優選地，所述碳化處理的時間為0.01?10h，例如可選擇0.02h、0.05h、0.lh、0.5h、2h、5h、8h、9h 等，優選為 2h。
[0026]優選地，所述碳化處理的升溫速率為I~20°C 例如可選擇I~10°C min'2 ~5°C.min'3 ~TC.min'4 ~ICTC.min'3 ~8°C.mirf1、10 ~15°C.mirf1 等，優選為 5 ~15 °C.min、
[0027]優選地,所述保護性氣氛為氮氣、氬氣、氦氣、氫氣和一氧化碳中的I種或至少2種的組合。
[0028]優選地，所述保護性氣氛的氣體流量為50~300mL/h，例如可選擇100~200mL/h、50 ~120mL/h、80 ~150mL/h、150 ~300mL/h 等，優選為 100 ~200mL/h。
[0029]優選地，采用包埋法和/或交聯法將所述納米金屬顆粒和酶同時固定化至所述碳化蛋殼膜上。
[0030]優選地，先采用電沉積將所述納米金屬顆粒沉積至所述碳化蛋殼膜上，再采用直接吸附法、共價結合法、包埋法和/或交聯法將所述酶固定化至所述碳化蛋殼膜上。
[0031]在第三方面，本發明提供一種酶生物傳感器，包括作為工作電極的第一方面所述的酶電極，以及參比電極和對電極。
[0032]優選地，所述參比電極為飽和甘汞電極、氫電極、銀I氯化銀電極或汞I氧化汞電極，更優選為飽和甘汞電極。
[0033]優選地，所述對電極為鉬絲電極或碳電極。
[0034]在第四方面，本發明提供如第一方面所述的酶電極在測定溶液中的底物濃度中的應用。
[0035]優選地，所述應用中以循環伏安和/或計時電流的方式測定溶液中的底物濃度。
[0036]優選地，所述循環伏安方式的測試電位掃描速率為25~200mV/s，例如可選擇25 ~50mV/s、50 ~90mV/s、50 ~120mV/s、80 ~150mV/s、100 ~150mV/s，優選為 50 ~100mV/s。
[0037]優選地，所述底物為H2O2、葡萄糖或酚類污染物；所述酚類污染物例如苯酚、五氯酚等。
[0038]優選地，所述底物濃度范圍為5μ M~10mM，例如可選擇10 μ10 μ M_2mM、100 μ M-2.5mM、200 μ M_4mM、500 μ M_6mM，優選為 5 μ M_5mM。
[0039]優選地，所述溶液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液中的I種或至少2種的組合。
[0040]與現有技術相比，本發明的優點體現在:
[0041](I)成本低:本發明所用的蛋殼膜，材料易得，制備時只需簡單處理，故工藝簡單、成本低廉，而且可以減少生活垃圾的污染，利于低碳社會的構建；
[0042](2)電子傳遞速率高:本發明所用的蛋殼膜碳化后形成三維多孔交聯結構，能夠促進電極和酶之間的電子傳遞；納米金屬顆粒導電性較強，能夠進一步增強電子傳遞速率；
[0043] (3)酶的固定化效果好:蛋殼膜表面的多孔結構，增大了電極的比表面積，增大酶的吸附量；將納米金屬顆粒固定于蛋殼膜上，緊貼于電極表面，由于納米金屬顆粒的微觀尺度特征及良好的生物相容性，能夠增加酶的固定化效果；
[0044](4)檢測靈敏度高:納米金屬顆粒-蛋殼膜材料能增強酶生物傳感器的靈敏度、響 應區間，具有快捷準確、重復性好的特點。
【具體實施方式】
[0045]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，以下實施例僅為本發明的優選實施例，以便于更好地理解本發明，因而不應視為限定本發明的范圍。
[0046]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑廠商購買得到的。
[0047]實施例1
[0048]一種基于蛋殼膜修飾的酶電極和酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0049](I)將玻碳電極(GCE)分別用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3漿在麂皮的拋光機上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗3min。
[0050](2)所述蛋殼膜選用雞蛋殼內膜，將雞蛋殼內膜剝離并清水清洗，剪成小片后放在拋光后的玻碳電極表面，并在室溫下放入烘箱中，從室溫開始升溫，每5min升溫5°C，升溫到80°C，干燥4h。
[0051](3)將干燥后的載膜玻碳電極放入石英玻璃管中，將石英玻璃管放入馬弗爐，在N2保護氣氛中加熱碳化處理，N2流速100mL/h,氣流穩定后開馬弗爐,升溫速率5°C.mirT1,升到800°C后保持2h，之后降溫到室溫，得到碳化的蛋殼膜修飾電極(CESM/GCE)。
[0052](4)采用恒電流沉積法在雞蛋殼膜電極表面直接沉積金納米顆粒(AuNPs)，得到納米金顆粒-雞蛋殼膜修飾電極；將辣根過氧化物酶(HRP)溶于pH為7.0的PBS緩沖溶液中，將制得的納米金顆粒-雞蛋殼膜修飾電極浸入酶溶液，吸附24h后取出，然后用PBS緩沖溶液洗去未吸附的酶，得到HRP/AuNPs/CESM/GCE酶電極。
[0053](5)將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，上述制得的酶電極作為工作電極。循環伏安測試的掃描速率為50mV/s，掃描范圍-0.6V-0.6V，于pH為7.0的緩沖溶液中進行，計時安培電流測試的時間為0-1200s，每間隔30s進行一次H2O2加樣，H2O2加入濃度為I μ M-5mM。
[0054]通過掃描電鏡、循環伏安測試、計時安培電流測試知:此例所得碳化雞蛋殼膜具有三維多孔結構，孔徑約I?5μπι，納米金較為均勻地分布于蛋殼膜表面，直徑約為50?IOOnm ；HRP/AuNPs/CESM/GCE酶電極對H2O2的檢測靈敏度較高，檢測限為3 μ Μ，線性檢測范圍5 μ M-3mM。實驗后，將修飾電極于4°C下置于pH為7.0的PBS緩沖溶液中一周，其響應信號基本不變；20天后，其響應信號為初始信號的96% 個月后，其響應信號仍為初始信號的92%，這表明HRP/AuNPs/CESM/GCE具有較好的穩定性，可較好地應用于酶生物傳感器。
[0055]實施例2
[0056]一種基于蛋殼膜修飾的酶電極和酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0057](I)將熱解石墨電極(PG)分別用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3漿在麂皮的拋光機上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗5min。
[0058](2)所述蛋殼膜選用鴨蛋殼內膜，將鴨蛋殼內膜剝離并清水清洗，剪成小片后放在拋光后的熱解石墨電極表面，并在室溫下放入烘箱中，從室溫開始升溫，每5min升溫:TC，升溫到70°C，干燥5h。
[0059](3)將干燥后的載膜熱解石墨電極放入石英玻璃管中，將石英玻璃管放入馬弗爐，在N2保護氣氛中加熱碳化處理，N2流速150mL/h，氣流穩定后開馬弗爐，升溫速率IO0C.mirT1，升到800°C后保持2h，之后降溫到室溫，得到碳化的鴨蛋殼膜修飾電極(CESM/PG)。
[0060](4)采用包埋法將葡萄糖氧化酶(GOX)和鈀納米顆粒(PdNPs)固定化至鴨蛋殼膜電極表面，在pH為7.0的PBS緩沖溶液中清洗，得到GOX/PdNPs/CESM/PG酶電極。
[0061](5)將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，上述制得的酶電極為工作電極。循環伏安測試的掃描速率為100mV/S，掃描范圍-0.6V-0.6V，于pH為7.0的緩沖溶液中進行，計時安培電流測試的時間為0-900s，每間隔30s進行一次葡萄糖加樣，加入濃度為 10 μ M_5mM。
[0062]通過掃描電鏡、循環伏安測試、計時安培電流測試知:此例所得碳化鴨蛋殼膜具有三維多孔結構，孔徑約I?10 μ m，納米鈀較為均勻地分布于蛋殼膜表面，直徑約為30?50nm, GOX/PdNPs/CESM/PG酶電極對葡萄糖的檢測靈敏度較高，檢測限為10 μ Μ，線性檢測范圍50μΜ-2.5mM。實驗后，將修飾電極于4°C下置于pH為7.0的PBS緩沖溶液中一周，其響應信號基本不變；20天后，其響應信號為初始信號的94% 個月后，其響應信號仍為初始信號的90%，這表明GOX/PdNPs/CESM/PG酶電極具有較好的穩定性，可較好地應用于生物傳感器。
[0063]實施例3
[0064]一種基于蛋殼膜修飾的酶電極和酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0065](I)將碳糊電極(CPE)分別用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3漿在麂皮的拋光機上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗4min。
[0066](2)所述蛋殼膜選用鵪鶉蛋殼內膜，將鵪鶉蛋殼內膜剝離并清水清洗，剪成小片后放在拋光后的碳糊電極表面，并在室溫下放入烘箱中，從室溫開始升溫，每IOmin升溫5°C，升溫到75°C，干燥4h。
[0067](3)將干燥后的載膜碳糊電極放入石英玻璃管中，將石英玻璃管放入馬弗爐，在氦氣保護氣氛中加熱碳化處理，氦氣流速100mL/h，氣流穩定后開馬弗爐，升溫速率IO0C 升到700°C后保持2h，之后降溫到室溫，得到碳化的鵪鶉蛋殼膜修飾電極(CESM/CPE)。
[0068](4)采用聚多巴胺將銀納米顆粒(Ag NPs)和血紅蛋白(Hb)原位交聯至鶴鵓蛋殼膜電極表面，在PH為7.0的PBS緩沖溶液清洗，放于4°C冰箱內干燥，得到Hb/Ag NPs/CESM/CPE酶電極。
[0069](5)將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，上述制得的酶電極為工作電極。循環伏安測試的掃描速率為80mV/s，掃描范圍-1?IV，于pH為7.0的PBS緩沖溶液中進行，計時安培電流測試的時間為O-1OOOs，每間隔50s進行一次H2O2加樣，加入濃度為 10 μ M-7mM。
[0070]通過掃描電鏡、循環伏安測試、計時安培電流測試知:此例所得碳化鵪鶉蛋殼膜具有三維多孔結構，孔徑約5~10 μ m，納米銀較為均勻地分布于蛋殼膜表面，直徑約為50~IOOnm ；Hb/Ag NPs/CESM/CPE酶電極對H2O2的檢測靈敏度較高，檢測限為10 μ Μ，線性檢測范圍75μΜ-3.6mM。實驗后，將修飾電極于4°C下置于pH為7.0的PBS緩沖溶液中一周，其響應信號基本不變；20天后，其響應信號為初始信號的92% 個月后，其響應信號仍為初始信號的90%，這表明Hb/Ag NPs/CESM/CPE具有較好的穩定性，可較好地應用于生物傳感器。
[0071]實施例4
[0072]—種基于蛋殼膜修飾的酶電極和酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0073](1)將金電極(Au)分別用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3漿在麂皮的拋光機上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗5min。
[0074](2)所述蛋殼膜選用雞蛋殼內膜，將雞蛋殼內膜剝離并清水清洗，剪成小片后放在拋光后的金電極表面，并在室溫下放入烘箱中，從室溫開始升溫，每5min升溫5°C，升溫到80°C，干燥 4h。
[0075](3)將干燥后的載膜金電極放入石英玻璃管中，將石英玻璃管放入馬弗爐，在N2保護氣氛中加熱碳化處理，N2流速200mL/h,氣流穩定后開馬弗爐,升溫速率15°C ?mirT1,升到800°C后保持2h，之后降溫到室溫，得到碳化的雞蛋殼膜修飾電極(CESM/Au)。
[0076](4)采用恒電流沉 積法在雞蛋殼膜電極表面直接沉積鉬納米顆粒(Pt NPs)，電解完畢后取出電極，在超純水中清洗，室溫下自然干燥，得到納米鉬顆粒-雞蛋殼膜修飾電極。
[0077](5)用注射器將漆酶(Lac)溶液(pH為7.0的PBS緩沖溶液)滴加于制得的納米鉬顆粒-雞蛋殼膜修飾電極表面，放于4°C冰箱內干燥，然后用PBS緩沖溶液洗去未吸附的酶，得到 Lac/Pt NPs/CESM/Au 酶電極。
[0078](6)將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，上述制得的酶電極作為工作電極。循環伏安測試的掃描速率為50mV/s，掃描范圍-1~IV，于pH為7.0的PBS緩沖溶液中進行，計時安培電流測試的時間為0-1200S，每間隔30s進行一次鄰苯二酚加樣，加入濃度為?ο μ
[0079]通過掃描電鏡、循環伏安測試、計時安培電流測試知:此例所得碳化雞蛋殼膜具有三維多孔結構，孔徑約I~10 μ m，納米鉬較為均勻地分布于蛋殼膜表面，直徑約為50~200nm ；Lac/Pt NPs/CESM/Au酶電極對鄰苯二酚的檢測靈敏度較高，檢測限為14 μ Μ，線性檢測范圍60 μ M-4mM。實驗后，將修飾電極于4°C下置于pH為7.0的PBS緩沖溶液中一周，其響應信號基本不變；20天后，其響應信號為初始信號的94% 個月后，其響應信號仍為初始信號的90%，這表明Lac/Pt NPs/CESM/Au具有較好的穩定性，可較好地應用于生物傳感器。
[0080]實施例5
[0081]一種基于蛋殼膜修飾的酶電極和酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0082](I)將玻碳電極(GCE)分別用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3漿在麂皮的拋光機上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗3min。[0083](2)所述蛋殼膜選用雞蛋殼內膜，將雞蛋殼內膜剝離并清水清洗，剪成小片后放在拋光后的玻碳電極表面，并在室溫下放入烘箱中，從室溫開始升溫，每5min升溫5°C，升溫到60°C，干燥5h。
[0084](3)將干燥后的載膜玻碳電極放入石英玻璃管中，將石英玻璃管放入馬弗爐，在N2保護氣氛中加熱碳化處理，N2流速300mL/h，氣流穩定后開馬弗爐，升溫速率20°C 升到1000°C后保持0.01h，之后降溫到室溫，得到碳化的蛋殼膜修飾電極(CESM/GCE)。
[0085](4)采用恒電流沉積法在雞蛋殼膜電極表面直接沉積金納米顆粒(AuNPs)，得到納米金顆粒-雞蛋殼膜修飾電極；將血紅蛋白(Hb)溶于pH為7.0的PBS緩沖溶液中，將制得的納米金顆粒-雞蛋殼膜修飾電極浸入酶溶液，吸附24h后取出，然后用PBS緩沖溶液洗去未吸附的酶，得到Hb/AuNPs/CESM/GCE酶電極。
[0086](5)將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，上述制得的酶電極作為工作電極。循環伏安測試的掃描速率為50mV/s，掃描范圍-0.6V-0.6V，于pH為7.0的緩沖溶液中進行，計時安培電流測試的時間為0-1200s，每間隔30s進行一次H2O2加樣，H2O2加入濃度為I μ M-5mM。
[0087]通過掃描電鏡、循環伏安測試、計時安培電流測試知:此例所得碳化雞蛋殼膜具有三維多孔結構，孔徑約2~5μπι，納米金較為均勻地分布于蛋殼膜表面，直徑約為50~IOOnm ;Hb/AuNPs/CESM/GCE酶電極對H2O2的檢測靈敏度較高，檢測限為5 μ Μ，線性檢測范圍10μΜ-3πιΜ。實驗后，將修飾電極于4°C下置于pH為7.0的PBS緩沖溶液中一周，其響應信號基本不變；20天后，其響應信號為初始信號的95% 個月后，其響應信號仍為初始信號的90%，這表明Hb/AuNPs/CESM/GCE具有較好的穩定性，可較好地應用于酶生物傳感器。 [0088]實施例6
[0089]一種基于蛋殼膜修飾的酶電極和酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0090](I)將玻碳電極(GCE)分別用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3漿在麂皮的拋光機上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗3min。
[0091](2)所述蛋殼膜選用雞蛋殼內膜，將雞蛋殼內膜剝離并清水清洗，剪成小片后放在拋光后的玻碳電極表面，并在室溫下放入烘箱中，從室溫開始升溫，每5min升溫5°C，升溫到80°C，干燥4h。
[0092](3)將干燥后的載膜玻碳電極放入石英玻璃管中，將石英玻璃管放入馬弗爐，在N2保護氣氛中加熱碳化處理，N2流速50mL/h,氣流穩定后開馬弗爐,升溫速率1°C ?mirT1,升到500°C后保持10h，之后降溫到室溫，得到碳化的蛋殼膜修飾電極(CESM/GCE)。
[0093](4)采用恒電流沉積法在雞蛋殼膜電極表面直接沉積金納米顆粒(AuNPs)，得到納米金顆粒-雞蛋殼膜修飾電極；將辣根過氧化物酶(HRP)溶于pH為7.0的PBS緩沖溶液中，將制得的納米金顆粒-雞蛋殼膜修飾電極浸入酶溶液，吸附24h后取出，然后用PBS緩沖溶液洗去未吸附的酶，得到HRP/AuNPs/CESM/GCE酶電極。
[0094](5)將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，上述制得的酶電極作為工作電極。循環伏安測試的掃描速率為50mV/s，掃描范圍-0.6V-0.6V，于pH為7.0的緩沖溶液中進行，計時安培電流測試的時間為0-1200s，每間隔30s進行一次H2O2加樣，H2O2加入濃度為I μ M-5mM。[0095]通過掃描電鏡、循環伏安測試、計時安培電流測試知:此例所得碳化雞蛋殼膜具有三維多孔結構，孔徑約1.5?5 μ m，納米金較為均勻地分布于蛋殼膜表面，直徑約為50?IOOnm ；HRP/AuNPs/CESM/GCE酶電極對H2O2的檢測靈敏度較高，檢測限為4 μ M，線性檢測范圍10 μ M-2.8mM。實驗后，將修飾電極于4°C下置于pH為7.0的PBS緩沖溶液中一周，其響應信號基本不變；20天后，其響應信號為初始信號的94% 個月后，其響應信號仍為初始信號的91%，這表明HRP/AuNPs/CESM/GCE具有較好的穩定性，可較好地應用于酶生物傳感器。
[0096] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及詳細方法，但本發明并不局限于上述詳細特征以及詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征以及詳細方法才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
[0097]以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0098]另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0099]此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【權利要求】
1.一種酶電極，包括基底電極，所述基底電極表面附有碳化蛋殼膜，所述碳化蛋殼膜上固定化有納米金屬顆粒和酶。
2.根據權利要求1所述的酶電極，其特征在于，所述基底電極為玻碳電極、銦錫氧化物電極、熱解石墨電極、碳糊電極或金屬電極； 優選地，所述基底電極為Al2O3拋光過的玻碳電極、銦錫氧化物電極、熱解石墨電極、碳糊電極或金屬電極； 優選地，所述金屬電極為金電極或銀電極，優選為金電極。
3.根據權利要求1或2所述的酶電極，其特征在于，所述蛋殼膜來源于雞蛋殼、鴨蛋殼、鵝蛋殼或鵪鶉蛋殼。
4.根據權利要求1-3任一項所述的酶電極，其特征在于，所述納米金屬顆粒為納米金顆粒、納米銀顆粒、納米銅顆粒、納米鈀顆粒和納米鉬顆粒中的I種或至少2種的組合。
5.根據權利要求1-4任一項所述的酶電極，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、血紅蛋白、細胞色素C、漆酶、脫氫酶或氧化還原酶中的I種或至少2種的組合。
6.一種制備權利要求1-5任一項所述的酶電極的方法，包括如下步驟:將剝離出的蛋殼膜貼至基底電極表面，在保護性氣氛中加熱碳化處理形成附在所述基底電極表面的碳化蛋殼膜；將納米金屬顆粒和酶固定化至所述碳化蛋殼膜上形成所述酶電極。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述基底電極在使用前用Al2O3拋光； 優選地，所述基底電極在使用前用粒徑為0.05~1.0 μ m的Al2O3漿液拋光； 優選地，所述拋光后分別用乙醇和蒸餾水超聲清洗； 優選地，所述超聲清洗的時間為2~5min。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述碳化處理前對貼至基底電極表面的蛋殼膜進行干燥處理； 優選地，所述干燥處理具體為在烘箱內由室溫開始以2~5min內溫度上調3~5°C的速率上調至60~80°C，整個干燥過程持續4~5h ; 優選地，所述碳化處理在馬弗爐中進行； 優選地，所述碳化處理的溫度為500~1000°C ； 優選地，所述碳化處理的時間為0.01~IOh ； 優選地，所述碳化處理的升溫速率為I~20°C.rniiT1 ； 優選地,所述保護性氣氛為氮氣、氬氣、氦氣、氫氣和一氧化碳中的I種或至少2種的組合； 優選地，所述保護性氣氛的氣體流量為50~300mL/h ； 優選地，采用包埋法和/或交聯法將所述納米金屬顆粒和酶同時固定化至所述碳化蛋殼膜上； 優選地，先采用電沉積將所述納米金屬顆粒沉積至所述碳化蛋殼膜上，再采用直接吸附法、共價結合法、包埋法和/或交聯法將所述酶固定化至所述碳化蛋殼膜上。
9.一種酶生物傳感器，包括作為工作電極的權利要求1-5任一項所述的酶電極，以及參比電極和對電極； 優選地，所述參比電極為飽和甘汞電極、氫電極、銀I氯化銀電極或汞I氧化汞電極，更優選為飽和甘汞電極；優選地，所述對電極為鉬絲電極或碳電極。
10.如權利要求1-5任一項所述的酶電極在測定溶液中的底物濃度中的應用； 優選地，所述應用中以循環伏安和/或計時電流的方式測定溶液中的底物濃度； 優選地，所述循環伏安方式的測試電位掃描速率為25~200mV/s ； 優選地，所述底物為H2O2、葡萄糖或酚類污染物； 優選地，所述底物濃度 范圍為5 μ M~IOmM ; 優選地，所述溶液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液中的I種或至少2種的組合。
【文檔編號】G01N27/327GK103954669SQ201410169559
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】趙赫, 曹宏斌, 范壯軍, 劉晨明 申請人:中國科學院過程工程研究所