一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發明屬于熒光成像【技術領域】，具體為一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置。解決了由于納米粒子熒光輻射起伏以及信號信噪比較低所造成的熒光成像模糊等技術問題。一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，包括以下步驟：向用于激發納米粒子樣品的激光加載一個強度調制信號，將該激光入射至納米粒子樣品；采集納米粒子樣品在激光的激發下所發射的攜帶有調制信號特性的熒光信號,利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；對整個納米粒子樣品進行兩維掃描，得到納米粒子樣品發射熒光的模擬信號成像。本發明通過提取納米粒子熒光的相位信息用于納米粒子的熒光成像，有效抑制納米粒子熒光輻射的量子起伏，實現高清晰度的納米粒子熒光成像。
【專利說明】一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置
【技術領域】
[0001]本發明屬于熒光成像【技術領域】，可用于利用熒光納米粒子在納米尺度環境的高清晰度熒光成像，具體為一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置。
【背景技術】
[0002]上世紀九十年代熒光納米粒子技術的發展使得物理學、化學和生物學出現了一次巨大的革新，人們發展各種高清晰度、高分辨率的成像技術，同時合成制備各類高亮度的納米熒光發色團，而這些新技術和新材料被迅速地應用到生物學中，基于熒光發色團的各類成像技術不斷地幫助人們揭示著細胞、蛋白、DNA等生命體在納米尺度上的行為。
[0003]熒光成像技術使得人們可以觀測3D生物結構、測量由多種發色團共同定位的生命體的相互作用過程、記錄活體細胞內納米尺度上的動力學過程等。基于激光掃描共聚焦成像、寬場成像、受激發射損耗顯微術(STED)、隨機光學重構顯微術(STORM)和光活化定位顯微術(PALM)等一系列高靈敏、高分辨率的熒光成像技術快速地推動著生命科學研究的發展。在通常的納米粒子成像中，由于納米粒子熒光的輻射起伏(取決于納米粒子受到周圍電子受體俘獲電子的能力大小的影響)、背景噪聲較大等因素使得納米粒子熒光成像較為模糊，不能實現高清晰的熒光成像，無法在生命過程的研究中給出生命體在納米尺度上的精確信息。這里我們將給出一種提高單粒子熒光成像清晰度的裝置。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了解決由于納米粒子熒光輻射起伏以及信噪比較低所造成的熒光成像模糊等技術問題，而提出的一種高清晰度的納米粒子熒光成像的裝置，可用于生命科學中的熒光標記、表征、成像等領域。
[0005]本發明所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法是采用以下技術方案實現的:一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，包括以下步驟:(a)向用于激發納米粒子樣品的激光加載一個強度調制信號，將加載有強度調制信號的激光照射納米粒子樣品；
(b)收集納米粒子樣品在激光的激發下所發射的帶有調制信號特性的熒光信號，利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；(C)對納米粒子樣品進行掃描，根據調制信號提取納米粒子熒光的相位信息，獲得納米粒子樣品發射熒光的模擬信號成像；(d)選擇樣品中任意一個納米粒子，將該納米粒子移動到激光的焦點內，激光激發納米粒子輻射熒光，即可獲得該納米粒子的模擬信號熒光光譜。
[0006]本發明采用加載有強度調制信號的激光掃描激發納米粒子實驗樣品，使得納米粒子輻射出具有調制信號特性的熒光(熒光的強度與入射激光的強度成正比)，帶有強度調制信號的熒光光子通過光電轉化為TTL電平脈沖輸出信號，這些信號在時域上都以非均勻的疏密相間的形式傳播。這些疏密相間的TTL電平脈沖輸出信號攜帶有納米粒子樣品的計數以及模擬信號信息，經過相位信號的提取之后就可以得到清晰度非常高的納米粒子模擬信號成像。掃描整個樣品的表面就可以獲得關于樣品發射熒光的模擬信號成像；單獨鎖定某個納米粒子就可以獲得該納米粒子的模擬信號熒光光譜。
[0007]進一步的，還包括步驟(e);對納米粒子樣品的同一區域上的納米粒子進行多次重復掃描獲得一系列的成像，對每一幀圖像的納米粒子的熒光成像進行高斯分析定位可獲得每一幀圖像的納米粒子的質心坐標，將所有幀的定位坐標整合到一起可獲得該納米粒子質心的定位分布，從而可獲得該該納米粒子成像的定位精度。
[0008]本發明所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置是采用以下技術方案實現的:一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，包括一個連續激光器，連續激光器的出射端順次設有位于連續激光器出射光路上的聲光強度調制器、λ/2玻片、λ/4玻片以及激光擴束器；激光擴束器的出射光路上設有倒置熒光顯微鏡，所述倒置熒光顯微鏡的入射端口位于激光擴束器的出射光路上，經過擴束后的激光通過激發濾光器進行濾波后由二向色鏡反射進入顯微鏡物鏡；顯微鏡物鏡前端設有一個用于搭載樣品的三維納米臺；倒置熒光顯微鏡的熒光收集光路上順次設有一個陷波濾波器、一個發射濾波器、一個共焦針孔和一個單光子探測器；單光子探測器的信號輸出端分別連接有相敏檢波器以及裝有LabVIEW和MATLAB程序的計算機數據采集成像與控制系統；所述相敏檢波器的信號輸出端與計算機數據采集成像與控制系統的信號輸入端相連接；相敏檢波器的信號輸入端還通過一個延時控制器連接有一個信號發生器；所述信號發生器的另一個信號輸出端與聲光強度調制器的調制信號輸入端相連接；計算機數據采集成像與控制系統的信號輸出端與三維納米臺的信號輸入端相連接。
[0009]本發明利用相敏檢波來提取納米粒子熒光的相位信息的手段來獲得高清晰度的納米粒子熒光成像。采用聲光強度調制器為用于激發納米粒子樣品產生熒光的激光引入對激光強度的調制；單光子探測器用于將接收到的熒光信號轉換成相應的TTL電平脈沖輸出信號；相敏檢波器用于對攜帶有調制相位信息的納米粒子熒光信號的相位提取；計算機數據控制與采集系統在相應軟件(LabVIEW和MATLAB程序)的支持下對采集到的熒光所對應的電信號進行處理，得到納米粒子樣品發射熒光模擬信號成像以及單個納米粒子的模擬信號熒光光譜。計算機數據采集成像與控制系統控制三維納米臺的移動，便于對整個納米粒子樣品進行掃描以及對單獨一個納米粒子的鎖定聚焦；λ /2玻片和λ /4玻片則用于調節激光的偏振方向，使其符合共聚焦顯微鏡對入射激光的要求。
[0010]本發明對比已有技術具有以下創新點:
[0011]1、通過納米粒子熒光的相位信息用于納米粒子的熒光成像，這種成像方法能夠有效地抑制納米粒子熒光輻射的量子起伏，提高成像的信噪比，實現高清晰度的納米粒子熒光成像。
[0012]2、這種高清晰模擬信號成像能夠有效地提高納米粒子在納米尺度上的定位精度。
[0013]3、連續激光器、聲光強度調制器、λ /2與λ /4玻片和激光擴束器組成熒光激發單元；三維納米臺和共聚焦顯微鏡構成共焦顯微鏡主體；單光子探測器、相敏檢波器和延時控制器作為微弱信號檢測系統；計算機數據采集成像與控制系統，這四個單元化模塊整合而成，有利于熒光成像設備的集成化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為實現本發明所述方法的裝置結構示意圖。[0015]圖中:I )熒光激發單元；II)共焦顯微鏡主體JII)微弱信號檢測系統；IV)計算機數據控制與采集系統。1-連續激光器，2-聲光強度調制器，3-三維納米臺，4-單光子探測器，5-信號發生器，6-相敏檢波器，7-計算機數據采集成像與控制系統，8- 二向色鏡，9-顯微鏡物鏡，10-共焦針孔，a- λ /2玻片，b- λ /4玻片，c-激光擴束器，d_激發濾波器，e_發射濾波器，f-陷波濾波器，g-延時控制器。
[0016]圖2為納米粒子熒光的光子計數成像。
[0017]圖3為納米粒子熒光的模擬信號成像。
[0018]圖4 (a)為納米粒子熒光的光子計數光譜；(b)為納米粒子的模擬信號熒光光譜。
[0019]圖5為一個納米粒子的熒光光子計數成像的三維立體圖。
[0020]圖6為一個納米粒子熒光的模擬信號成像的三維立體圖。
[0021]圖7為利用納米粒子熒光對納米粒子進行質心定位的方法示意圖。
[0022]圖8為對同一納米粒子的多幀光子計數成像的質心定位分布。
[0023]圖9為對同一納米粒子的多幀模擬信號成像的質心定位分布。
[0024]圖10為納米粒子熒光成像數據流程原理圖。
【具體實施方式】
[0025]一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，包括以下步驟:(a)向用于激發納米粒子樣品的激光加載一個強度調制信號，將加載有強度調制信號的激光照射納米粒子樣品；(b)收集納米粒子樣品在激光的激發下所發射的帶有調制信號特性的熒光信號，利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；(C)對納米粒子樣品進行掃描，根據調制信號提取納米粒子熒光的相位信息，獲得納米粒子樣品發射熒光的模擬信號成像；(d)選擇樣品中任意一個納米粒子，將該納米粒子移動到激光的焦點內，激光激發納米粒子輻射熒光，即可獲得該納米粒子的模擬信號熒光光譜；(e)對納米粒子的模擬信號成像進行分析，可獲得成像的定位精度。
[0026]一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，包括一個連續激光器1，連續激光器I的出射端順次設有位于連續激光器I出射光路上的聲光強度調制器2、λ /2玻片a、λ /4玻片b以及激光擴束器c ;激光擴束器c的出射光路上設有倒置熒光顯微鏡，所述倒置熒光顯微鏡的入射端口位于激光擴束器c的出射光路上，經過擴束后的激光通過激發濾光器d進行濾波后由二向色鏡8反射進入顯微鏡物鏡9 ;顯微鏡物鏡9前端設有一個用于搭載樣品的三維納米臺3 ;倒置熒光顯微鏡的熒光收集光路上順次設有一個陷波濾波器e、一個發射濾波器f、一個共焦針孔10和一個單光子探測器4 ;單光子探測器4的信號輸出端分別連接有相敏檢波器6以及裝有LabVIEW和MATLAB程序的計算機數據采集成像與控制系統7 ;所述相敏檢波器6的信號輸出端與計算機數據采集成像與控制系統7的信號輸入端相連接；相敏檢波器6的信號輸入端還通過一個延時控制器g連接有一個信號發生器5 ;所述信號發生器5的另一個信號輸出端與聲光強度調制器2的調制信號輸入端相連接；計算機數據采集成像與控制系統7的信號輸出端與三維納米臺3的信號輸入端相連接。
[0027]樣品制備:首先配制質量分數為1%的PMMA聚合物溶液其包含有?10-9摩爾的聚苯乙烯熒光納米粒子。利用旋涂的實驗方法將包含有納米粒子的聚合物薄膜制備到已經清潔過的玻片上，勻膠機的轉速設置為2000轉/分和旋涂時間設置為60s，可制備薄膜厚度大約為300nm的包含有納米粒子的聚合物薄膜層。將制備好的樣品放入到溫度為110°C的真空烘干箱中進行淬火處理消除殘留的溶劑，3小時之后關閉真空烘干箱電源讓其自然冷卻
至室溫溫度。
[0028]本發明所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，如圖1所示，從圖1中可以看到整個系統由四個單元部分組成的，分別為I)熒光激發單元，主要部件為連續激光器
1、聲光強度調制器2、λ /2玻片a、λ /4玻片b、激光擴束器C等；2)共焦顯微鏡主體，主要部件為倒置顯微鏡鏡體、三維納米臺3、顯微鏡物鏡9、激發濾波器d、陷波濾波器e、發射濾波器f、二向色鏡8等；3)微弱信號檢測系統，主要部件為相敏檢波器6、延時控制器g等，4)計算機數據采集成像與控制系統7，主要有計算機、NI儀器控制與數據采集板卡、LabVIEff程序和MATLAB程序等。
[0029]本發明可通過多種公知的儀器實現，具體采用的儀器有:熒光倒置顯微鏡(NIKON, TE2000-E)，連續激光器(MRL-1I1-635L)，聲光強度調制器(Crystal Technology,3080-122型)，三維納米臺(Tritor200/20SG)，單光子探測器(SPCM-15)，信號發生器(Agilent，33250A型)，相敏檢波器等，計算機數據采集成像與控制系統(NI6251數據采集板卡、LabVIEff程序和MATLAB程序)等。
[0030]連續激光器I與聲光強度調制器2相連接，信號發生器5與聲光強度調制器2連接。連續激光器I輸出的激光經過聲光強度調制器2進行調制后分別通過λ/2、λ/4玻片、IOX激光擴束器和激發濾波器后，由一個二向色鏡反射后進入顯微鏡物鏡，顯微鏡物鏡將調制的激光聚焦到納米粒子樣品上，納米粒子在激光的激發下輻射熒光信號，熒光信號由同一個顯微鏡物鏡收集后通過二向色鏡、發射濾波器、陷波濾波器、高能針孔空間濾波后由單光子探測器4進行探測，單光子探測器4將熒光光子進行光電轉化放大后輸出TTL電平脈沖信號，邏輯電脈沖信號進入計算機數據采集成像與控制系統7，由NI板卡的計數端口進行采集，由LabVIEW程序進行光子計數成像顯示。同時TTL邏輯電平脈沖信號進入相敏檢波器6,相敏檢波器6來提取納米粒子的突光相位信號,其輸出的模擬信號由NI板卡的模擬采樣端口進行采集，后由LabVIEW程序進行模擬成像顯示。光子計數成像與模擬成像由MATLAB程序對納米粒子成像進行精度分析。信號發生器5的同步輸出連接到一個延時控制器上后連接到相敏檢波器6上。納米粒子樣品置于三維納米臺3上，NI板卡的模擬輸出端口連接到三維納米臺3上驅動三維納米臺進行三維的納米掃描或定位。
[0031]為顯示本發明所示方法的成像質量，本發明所獲得的成像將與用傳統上的光子計數成像結果進行對比。三維納米臺首先掃描納米粒子樣品可獲得納米粒子熒光的光子計數成像(圖2所示)和模擬信號成像(圖3所示)。選擇成像中的任意一個納米粒子控制納米臺將該納米粒子移動到激光的焦點內，激光激發納米粒子輻射熒光可獲得納米粒子熒光的光子計數光譜(圖4 (a)所示)和為納米粒子的模擬信號熒光光譜(圖4 (b)所示)。
[0032]實驗過程中各儀器參數設置為，信號發生器5輸出的正弦波信號(30kHz，4.0Vpp)加載到聲光強度調制器2的驅動模塊上，對連續激光器(40MHz)輸出的激光進行調制，被調制后的激光經顯微鏡物鏡聚焦后照射納米粒子樣品，顯微鏡物鏡9 (100X，oil，NA=1.3)收集納米粒子發出的熒光，單光子探測器4收集入射熒光單光子信號，并輸入相敏檢波器6對信號進行相位提取，計算機記錄相敏檢波器輸出的模擬信號。
[0033]在圖2、圖3中選擇的掃描步長為IOOnm,掃描的像素為100X 100，在χ-y平面的掃描面積為10 μ mX 10 μ m。圖2和圖3分別為納米粒子熒光的光子計數成像和納米粒子模擬信號成像，光子計數成像的性噪比大約為8，納米粒子模擬信號成像的性噪比大約為40，信噪比改善了大約5倍。
[0034]圖4 (a)和(b)分別為納米粒子熒光的光子計數光譜和納米粒子的模擬信號熒光光譜，從圖4 (a)中可以看到納米粒子熒光的平均光子計數N大約為9K，光子計數起伏ΛΝ大約為3K，對應熒光信號起伏—/#=1/3;從圖4 (b)中可以看到納米粒子熒光的模擬信號的平均信號F:大約為3.6mV，起伏Λ V大約為0.3mV，那么熒光信號起伏Δ/ = 1/15,即納米粒子熒光強度起伏由光子計數光譜的1/3減小為1/15。
[0035]在圖4中選擇的掃描步長為25nm，掃描像素為40X40，在χ-y平面的掃描面積為I μ mX I μ m。圖5和圖6分別為同一個納米粒子的熒光光子計數成像的三維立體圖像和模擬信號熒光成像的三維立體圖像，從圖5中可以看到光子計數的起伏較大，而采用本技術所得到的熒光成像更為平滑，有利于熒光納米粒子成像的精確定位。
[0036]在計算機數據控制與采集單元中，基于納米粒子的熒光成像分析納米粒子的成像精度，圖7所示為利用納米粒子熒光成像進行納米粒子質心定位分析的方法示意圖。我們對納米粒子樣品的同一區域進行多次重復掃描獲得一系列的成像，由成像精度分析程序依次對每一幀圖像進行納米粒子定位分析。對同一納米粒子的多幀光子計數成像的質心定位分布如圖8所示,通過高斯擬合,光子計數成像的質心定位精度為28±5nm。對同一納米粒子的多幀相位成像的質心定位分布如圖9所示，相位成像的質心定位精度約為15±5nm。這種熒光相位成像技術顯著改善了定位精度。 [0037]圖10為納米粒子熒光成像儀器控制和數據流程原理圖。
【權利要求】
1.一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，其特征在于，包括以下步驟:(a)向用于激發納米粒子樣品的激光加載一個強度調制信號，將加載有強度調制信號的激光照射納米粒子樣品；(b)收集納米粒子樣品在激光的激發下所發射的帶有調制信號特性的熒光信號，利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；(C)對納米粒子樣品進行掃描，根據調制信號提取納米粒子熒光的相位信息，獲得納米粒子樣品發射熒光的模擬信號成像；(d)選擇樣品中任意一個納米粒子，將該納米粒子移動到激光的焦點內，激光激發納米粒子福射熒光，即可獲得該納米粒子的模擬信號熒光光譜。
2.如權利要求1所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，其特征在于，還包括步驟(e);對納米粒子樣品的同一區域上的納米粒子進行多次重復掃描獲得一系列的成像，對每一幀圖像的納米粒子的熒光成像進行高斯分析定位可獲得每一幀圖像的納米粒子的質心坐標，將所有幀的定位坐標整合到一起可獲得該納米粒子質心的定位分布，從而可獲得該納米粒子成像的定位精度。
3.一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，用于實現如權利要求1或2所述的方法，包括一個連續激光器(1)，其特征在于，連續激光器(I)的出射端順次設有位于連續激光器(O出射光路上的聲光強度調制器(2)、λ /2玻片(a)、λ /4玻片(b)以及激光擴束器(C)；激光擴束器(c)的出射光路上設有倒置熒光顯微鏡，所述倒置熒光顯微鏡的入射端口位于激光擴束器(c)的出射光路上，經過擴束后的激光通過激發濾光器(d)進行濾波后由二向色鏡(8)反射進入顯微鏡物鏡(9);顯微鏡物鏡(9)前端設有一個用于搭載樣品的三維納米臺(3);倒置熒光顯微鏡的熒光收集光路上順次設有一個陷波濾波器(e)、一個發射濾波器(f)、一個共焦針孔(10)和一個單光子探測器(4);單光子探測器(4)的信號輸出端分別連接有相敏檢波器(6)以及裝有LabVIEW和MATLAB程序的計算機數據采集成像與控制系統(7);所述相敏檢波器(6)的信號輸出端與計算機數據采集成像與控制系統(7)的信號輸入端相連接；相敏檢波器(6)的信號輸入端還通過一個延時控制器(g)連接有一個信號發生器(5);所述信號發生器(5)的另一個信號輸出端與聲光強度調制器(2)的調制信號輸入端相連接；計算機數據采集成像與控制系統(7)的信號輸出端與三維納米臺(3)的信號輸入端相連接。
【文檔編號】G01N21/64GK103901012SQ201410165529
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】張國峰, 陳瑞云, 高巖, 肖連團, 賈鎖堂 申請人:山西大學