一種FXa活性檢測試劑及其制備方法和應用的制作方法

一種FXa活性檢測試劑及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種肝素含量的檢測方法，是通過發色底物法，將待測樣品與FXa活性檢測試劑混合并孵育后，檢測發色底物的信號強度；最后通過計算信號強度并和標準曲線比對獲得待測樣品中肝素含量，其中發色底物為活化因子X(FXa)的發色底物，選自以下底物中的任一一種：Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide?HCl；CH3O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide?AcOH；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide?2HCl；4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide?2HCl。本發明的檢測范圍包括普通未分級肝素、低分子量肝素和磺達肝素，且本發明檢測穩定性和重復性好，能準確反應肝素含量，具有很高的靈敏度和準確度，可以較快找到肝素的最佳劑量范圍，患者無需進行多次檢測。此外，本發明還可用在自動化儀器如血凝分析儀或生化分析儀上，實現自動化有助于臨床推廣應用，具有操作簡便，靈敏度高，重復性好的特點。
【專利說明】-種FXa活性檢測試劑及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物學檢測【技術領域】，涉及一種FXa活性檢測試劑及其制備方法和應 用。

【背景技術】
[0002] 肝素（heparin)是一種糖胺聚糖，是被廣泛應用的抗凝血藥物。肝素是由D-葡 糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替組成的粘多糖硫酸酯，分子量從5至 30KDa，其中硫酸根約占40%。肝素的抗凝血功能主要是通過它與抗凝血酶的結合來實現的。 抗凝血酶III (AT-ΠΙ)的精氨酸酶活性部位可以與含絲氨酸的凝血酶和凝血因子Xlla、 XIa、Xa、IXa的絲氨酸酶活性部位結合，形成無凝血活性的抗凝血酶III-凝血因子復合物， 而達到抗凝血作用。肝素帶有大量負電荷，能與抗凝血酶III上帶正電荷的賴氨酸結合，肝 素中獨特的戊聚糖序列，就是肝素與抗凝血酶III的結合位點。肝素與抗凝血酶III結合， 使抗凝血酶III發生分子構象變化，暴露精氨酸活性部位，增加與凝血因子中絲氨酸接觸 的概率，使反應速率增加約1000倍，從而增強抗凝血酶ΠΙ的抗凝血活性。
[0003] 肝素作為臨床醫學中一種最常用的抗凝治療劑，使用肝素時要精確把握肝素用 量，以避免出現用量過少達不到抗凝效果，用量過多又會引起自發性出血的狀況，保持機體 出凝血功能有效平衡。但是，由于肝素是一種高度帶負電荷的異質性混合物，容易與血液中 帶正電荷的蛋白非特異性結合，導致難以計算與抗凝血酶III特異性結合的肝素含量。因 此，在臨床應用中，必須通過實驗檢測肝素抗凝的實際效果從而得出肝素的最佳劑量。
[0004] 常見的應用于臨床的肝素有普通未分級肝素 （Unfractionated heparin, UFH), 低分子量肝素（low-molecular-weight heparin, LMWH)和橫達肝素（fondaparinux)。普 通未分級肝素的平均分子量是15000。低分子量肝素的平均分子量是4000到6500。而磺 達肝素是化學合成的戊聚糖化合物，它的分子量為1728,基本上由與抗凝血酶結合的戊聚 糖序列組成。普通未分級肝素既可抑制抗凝血酶也可抑制活化因子X，低分子量肝素則主要 抑制活化因子X。磺達肝素只能抑制活化因子X，而不能抑制抗凝血酶。
[0005] 普通未分級肝素價格相對低廉，是最早應用到臨床的肝素。它是一種帶大量負電 荷的異質性的混合物。在血液里，它和帶正電荷的蛋白非特異性結合，因此有多少肝素和抗 凝血酶特異性結合很難計算。這樣，普通未分級肝素的用量難以預測，用量過少達不到抗凝 效果，用量過多又會導致出血。所以在臨床應用中，必須通過實驗室的嚴格監測來測量肝素 抗凝的實際效果來找到并維持最佳劑量。
[0006] 低分子量肝素比普通未分級肝素的糖鏈要短很多。這樣就減少了許多與血液中蛋 白的非特異結合。因此，它在血液中的半衰期比普通未分級肝素要長，抗凝血效果也更容易 預測，由于和血小板作用引起的副作用也降低。磺達肝素雖然價格相對昂貴，但它基本上由 與抗凝血酶結合的戊聚糖序列組成，所以它的特異性更強，在血液中的半衰期也更長。
[0007] 然而，低分子量肝素和磺達肝素在臨床應用中，由于病人的體質，性別，年齡，體 重，用藥等的不同，也會出現藥量不足或過量的情況。因此，為了避免引起出血和對病人實 施個體化治療，實驗室的監測必不可少。
[0008] 現有技術中關于測定肝素含量的方法有多種。其中，臨床中常用活化部分凝血活 酶時間（activated partial thromboplastin time, APTT)常用來間接反映肝素治療是 否恰當，其基本操作是在血漿中加入鈣離子，腦磷脂和其他激活物質如白陶土，這些物質激 活內源性凝血級聯系統，促進血漿凝固，而活化部分凝血活酶時間（APTT)就是血漿凝固 所需的時間。肝素的用量可以根據APTT時間的長短來進行調整，從而找到最佳劑量范圍。 APTT是一種凝固法。作為檢測肝素的方法之一，它操作簡單、快速、便宜。然而，通過活化部 分凝血活酶時間（APTT)推測肝素最佳劑量范圍的方法，在臨床實踐中經常被質疑，尤其是 對低分子量肝素和磺達肝素的應用。主要是因為利用這種方法得出的肝素最佳劑量也常常 出現血栓和出血現象，而且應用此法時，患者需要多次檢測、調整肝素劑量。因此，活化部分 凝血活酶時間（APTT)并不是一個能被用來準確推測的肝素最佳劑量范圍的指標。并且，活 化部分凝血活酶時間（APTT)只能用于普通肝素檢測，不能用于低分子肝素和磺達肝素檢 測。
[0009] 相對于凝固法，發色底物法具有靈敏度高，操作簡便的特點。Demers等人 (Thrombosis and Hemostasia，69 (3)，ρρ· 231-235 (1993))報道了一種測定抗凝血酶活性 的方法。他們發現在測定過程中，如果采用FXa替代凝血酶，那么得到的抗凝血酶活性的結 果會更加準確。他們這項研究的目的是測定抗凝血酶活性，而不是肝素。可值得注意的是， 該文獻中所用測定方法所使用的就是發色底物法。這說明發色底物法是可以被成功地應用 在血液檢測領域的。美國藥典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32)對肝素 活性測定采用發色底物法，這個方法的基本原理就是上面提到的肝素-抗凝血酶III復合 物能夠抑制活化的FXa，從而抑制其水解發色底物的顯色反應。但此法需采用對數方程擬合 標準曲線，而進行對數方程的計算導致檢測結果與實際偏差較大。
[0010] 此外，中國專利CN 103063592 A公開了一種肝素活性的測定方法，包括樣品先 后與抗凝血酶、活化的牛凝血因子X、發色底物、乙酸混合后測其吸光度來計算肝素活性含 量，但其相對來說更適應于較低肝素活性樣品的檢測。中國專利CN 103063593 A公開了一 種人抗凝血酶III濃縮物中肝素含量的測定方法，雖然測定了和抗凝血酶III結合的肝素 的含量，但其采用的是手動加樣的微孔板方法，無法用在自動檢測儀器上。
[0011] 綜上述，現有產品中并無檢測方法簡便、檢測結果精確可靠且可適用于自動檢測 儀器上的肝素含量檢測。


【發明內容】

[0012] 針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的之一是提供一種相較于檢測AT-III 活性更為靈敏且應用范圍更廣的用于檢測活化因子X (以下簡稱FXa)活性的試劑，尤其是 用于檢測血液中肝素含量的FXa活性檢測試劑。為實現上述發明目的，本發明提供的技術 方案如下： 一種FXa活性檢測試劑，包括試劑1和試劑2,其中試劑1為活化因子X (FXa)的發色 底物，試劑2為活化因子X (FXa);其中活化因子X (FXa)的發色底物選自以下底物中的任 種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA_Gly-Arg-p-nitroa nilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
[0013] 優選地，上述試劑1或試劑2為相應的溶液或凍干劑，優選為凍干粉劑。
[0014] 優選地，上述發色底物的工作濃度為0. 05~2mM，優選工作濃度為0. 最佳工 作濃度為〇. 5mM ; 上述FXa的工作濃度為0. 05?2 μ M，優選工作濃度為0. f 1 μ M，最佳工作濃度為 0. 5 μ Μ(工作濃度的定義：在用上述任一試劑檢測樣本活性的過程中，該試劑的凍干劑采 用其復溶試劑復溶后，與稀釋樣本混合，所形成的分析混合物中各組分的濃度被定義為其 工作濃度）。
[0015] 優選地，試劑1由包含發色底物、緩沖劑、無機鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試 齊?制成。
[0016] 優選地，試劑2由包含FXa、緩沖劑、無機鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試劑制 成。
[0017] 更優選地，緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷緩沖液（以下簡稱Tris緩沖液)或硼酸緩 沖液，最佳為三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris緩沖液)。
[0018] 更優選地，無機鹽選自氯化鈉或氯化鉀，最佳為氯化鈉。
[0019] 更優選地，表面活性劑選自聚乙二醇-8000或吐溫-20,最佳為聚乙二醇-8000。
[0020] 更優選地，防腐劑可選擇本領域技術人員已知的防腐劑，如Proclin 300或疊氮 納，最佳為置氣納。
[0021] 優選地，FXa選自為人、牛、豬FXa中的任意一種，優選牛FXa。
[0022] 作為優選，上述試劑還包括含有肝素的人血漿標準品；人血漿標準品為含有準確 肝素含量的人血漿。該標準品由正常健康人血漿添加穩定劑和防腐劑，經冷凍干燥制成。 正常健康人血漿可以從商業途徑獲得，也可以從健康個體獲得，將收集的正常健康人血漿 混合后進行肝素活性檢測。血漿中加入適當的甘氨酸、疊氮鈉，混合后通過過濾除去不溶顆 粒，調節pH值至6. (T9. 0,優選7. 5,分裝后凍干，并用WHO肝素國際標準品血漿對肝素標準 品進行定值。此外，也可省略此標準品而提供標準曲線。
[0023] 本發明的另一目的是提供上述的FXa活性檢測試劑的制備方法，包括分別制備試 齊U 1和試劑2 ;其中： 制備試劑1的方法為：將發色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調節pH值至7~8 ;再依 次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
[0024] 其中，試劑1中各組分的終濃度或百分含量分別為：發色底物0. 緩沖劑 10?50禮，無機鹽0. 1?0. 3M，表面活性劑0. 5?1%。
[0025] 優選地，還包括將試劑1的溶液制成凍干劑的步驟，可參考現有技術中的凍干粉 劑的制備工藝，以獲得穩定性更高的試劑1。
[0026] 制備試劑2的步驟為：將FXa溶于緩沖劑；再加入鹽酸，調節pH值至疒8 ;再依次 加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
[0027] 其中，試劑2中各組分的終濃度或百分含量分別為：FXa 0. 1~1μΜ，緩沖劑 l(T50mM，無機鹽0. 1?0. 3Μ，表面活性劑0. 5?1%。
[0028] 優選地，還包括將試劑2的溶液制成凍干劑的步驟，可參考現有技術中的凍干粉 劑的制備工藝，以獲得穩定性更高的試劑2。
[0029] 此外，上述試劑1和試劑2中還分別加入0. 2%的防腐劑，可參考現有技術中的方 法加入，在此不做贅述。
[0030] 本發明的另一目的是提供上述FXa活性檢測試劑的應用，即將上述試劑作為檢測 試劑用于制備檢測肝素含量的檢測試劑。
[0031] 作為一種優選方案，該檢測試劑可制備相應的檢測試劑盒，包括盒體和裝有上述 試劑的試劑瓶，試劑瓶放置于所述盒體內。
[0032] 作為一種優選方案，上述檢測試劑盒分別包含試劑1或試劑2。該試劑盒檢測待測 樣品中肝素含量時，將待測樣品與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合并孵育后，然后 讀取待測樣品中發色底物的信號強度；最后通過計算信號強度并和已知濃度標準品的標準 曲線比對得到血液中肝素含量。
[0033] 本發明的另一目的是提供另一種FXa活性檢測試劑，除上述試劑1和試劑2外，還 包括試劑3;同上述，試劑1為活化因子X (FXa)的發色底物，試劑2為活化因子X (FXa); 試劑3為抗凝血酶；其中活化因子X (FXa)的發色底物選自以下底物中的任一一種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA-Gly-Arg-p_nitroa nilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
[0034] 優選地，試劑3為溶液或凍干劑，優選為凍干粉劑。
[0035] 優選地，上述抗凝血酶的工作濃度為0. f lU/mL，優選工作濃度為0. 2?0. 5U/mL， 最佳工作濃度為〇. 5U/mL。
[0036] 優選地，試劑3由包含抗凝血酶、緩沖劑、無機鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試 齊?制成。
[0037] 更優選地，抗凝血酶為人抗凝血酶。
[0038] 更優選地，上述緩沖劑、氯化鈉、表面活性劑和防腐劑同試劑1或試劑2。
[0039] 本發明的另一目的是提供上述FXa活性檢測試劑的制備方法，包括分別制備試劑 1、試劑2和試劑3,其中試劑1和2的制備方法同上述，此外， 制備試劑3的步驟為：將抗凝血酶溶于濃度為l(T50mM的緩沖劑；再加入鹽酸，調節pH 值至疒8 ;再依次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
[0040] 其中，試劑3中各組分的終濃度或百分含量分別為：抗凝血酶0.2~0.5U/mL，緩沖 劑l(T50mM，氯化鈉0. 1?0. 3M，表面活性劑0. 5?1%。
[0041] 優選地，還包括將試劑3的溶液制成凍干劑的步驟，可參考現有技術中的凍干粉 的制備工藝，以獲得穩定性更高的試劑3。
[0042] 本發明的另一目的是提供上述FXa活性檢測試劑的應用，即將上述試劑作為檢測 試劑用于制備肝素檢測試劑。值得一提的是，針對不同人群中抗凝血酶的表達量是不同的， 在極少部分低表達人群中，如新生兒等；如果不加入外源性抗凝血酶來測定肝素含量，那么 測定結果會有一些誤差。本發明針對此，提供了上述兩種不同的FXa活性檢測試劑在需糾 正這些誤差時的應用，即采用不同的試劑分別檢測是否需要考慮被檢者體內的內源抗凝血 酶表達水平的肝素含量。
[0043] 作為一種優選方案，該檢測試劑可制備相應的檢測試劑盒，所述試劑盒包括盒體 和裝有上述試劑的試劑瓶，試劑瓶放置于所述盒體內。
[0044] 作為一種優選方案，上述檢測試劑盒分別包含試劑1、試劑2試劑3。該試劑盒檢 測待測樣品中肝素含量時，將待測樣品與試劑3混合并孵育后，再與試劑1混合并孵育后， 再加入試劑2混合并孵育后，然后讀取發色底物的信號強度；最后通過計算信號強度并和 已知濃度標準品的標準曲線比對得到血液中肝素含量。
[0045] 本發明的另一目的是提供一種肝素含量的檢測方法，具體是通過發色底物法，將 待測樣品與上述FXa活性檢測試劑混合并孵育后，檢測發色底物的信號強度；最后通過計 算信號強度并和標準曲線比對獲得待測樣品中肝素含量。
[0046] 其中，當無需考慮被檢者內源抗凝血酶表達水平時，上述FXa活性檢測試劑包括 試劑1和試劑2。
[0047] 其中，當需要考慮被檢者內源抗凝血酶表達水平時，上述FXa活性檢測試劑包括 試劑1、2和試劑3。
[0048] 上述檢測方法，具體包括以下步驟： 步驟a，標準曲線的制作：根據不同肝素濃度的標準品及其相應的信號強度繪制標準 曲線； 步驟b，待測樣品處理：獲得待測樣品的血漿，與上述FXa活性檢測試劑混合并孵育； 步驟c，檢測待測樣品中發色底物的信號強度； 步驟d，通過計算待測樣品中信號強度并和標準曲線比對獲得待測樣品中肝素含量。
[0049] 優選地，當無需考慮被檢者內源抗凝血酶表達水平時，步驟b中待測樣品的處理 順序為：將待測樣品與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合并孵育。
[0050] 優選地，當需要考慮被檢者內源抗凝血酶表達水平時，步驟b中待測樣品的處理 順序為：將待測樣品與試劑3混合并孵育后，再與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合 并孵育。
[0051] 更優選地，步驟b中待測樣品處理的溫度為37° C，孵育溫度也為37° C。
[0052] 更優選地，步驟a是采用緩沖劑將已知濃度的含有肝素的人血漿標準品稀釋至 0. 1~1. 0 IU/mL的四種或以上的已知濃度，作為標準溶液；再根據人血漿標準品中不同肝素 濃度與測得的相應吸光值繪制標準曲線。
[0053] 更優選地，步驟b中待測樣品的血漿是將新鮮抽取的靜脈血按9 :1的比例與枸櫞 酸抗凝液混勻后離心，分離即得待測樣品血漿。
[0054] 更優選地，步驟b中待測樣品血漿與試劑1的體積比為1 :1，在37°C下混合并孵 育2分鐘。
[0055] 更優選地，步驟b中待測樣品血漿與試劑2的體積比為1 :1，在37°C下混合并孵 育2分鐘。
[0056] 更優選地，步驟b中待測樣品血漿與試劑3的體積比為1 :1，在37°C下混合并孵 育2分鐘。
[0057] 優選地，上述信號為405nm下的吸光度。
[0058] 更優選地，步驟c中吸光度的檢測時間不少于5分鐘。
[0059] 優選地，肝素包括但不限于普通未分級肝素、低分子量肝素和磺達肝素。
[0060] 上述肝素含量的檢測方法應用于自動檢測儀上(如血凝分析儀或生化分析儀）進 行檢測的具體條件為： 在自動監測儀上設定參數：反應溫度：37°C ;檢測波長：405nm ;檢測方法：終點法或動 態法。
[0061] 應當注意的是，在使用不同的自動檢測儀(血凝分析儀或生化分析儀）時，具體參 數應根據儀器不同進行相應調整。
[0062] 為了使發色底物法在肝素檢測方面得到廣泛應用，本發明提供一種與上述肝素檢 測方法匹配的檢測試劑。發色底物法的測量原理是利用肝素抑制活化因子X(FXa)的活性 從而抑制凝血，通過測量含肝素血漿對活化因子X(FXa)的抑制程度來推測肝素的最佳劑 量范圍。該肝素測量方法比活化部分凝血活酶時間（APTT)優越。首先，本發明的檢測范圍包 括但不限于普通未分級肝素、低分子量肝素和磺達肝素，而活化部分凝血活酶時間（APTT) 只能用于檢測普通未分級肝素。同時，血漿中高濃度因子、凝血酶原、收集管中血漿量不足 以及血漿中很多凝血因子缺乏等因素都會對活化部分凝血活酶時間（APTT)的檢測結果產 生影響，而本發明測量結果則不受以上述因素的影響，檢測穩定性和重復性好，能準確反應 肝素含量，具有很高的靈敏度和準確度，可以較快找到肝素的最佳劑量范圍，患者無需進行 多次檢測。此外，本發明還可用在自動化儀器如血凝分析儀或生化分析儀上，實現自動化有 助于臨床推廣應用，具有操作簡便，靈敏度高，重復性好的特點。因此，本發明應用前景廣 闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1為實施例1所用肝素的標準曲線。
[0064] 圖2為實施例2所用肝素的標準曲線。
[0065] 圖3為實施例3所用肝素的標準曲線。

【具體實施方式】
[0066] 下面結合實施例及對比例對本發明作進一步詳細、完整地說明。以下所用試劑或 設備均為市售品種，如無特殊說明，均按照說明書操作，在此不做贅述。
[0067] 以下為結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但不應視為對本發明的限定。
[0068] 1、實驗材料和試劑 Tris (是Tris (Hydroxymethyl) aminomethane的常用縮寫；中文品名：三輕甲基氨基 甲烷），鹽酸，氯化鈉和聚乙二醇-8000購自西格馬（Sigma，活化因子X(FXa)和活化因子 X(FXa)的發色底物： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide. HC1 (S-2222)； CH3〇-C〇-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide. AcOH ； Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide. 2HC1 (S-2772)； 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 (S-2782)，購自 Chromogenix; 2、試驗儀器 血凝分析儀購自Sysmex ; 血漿來自合作醫院。
[0069] 實施例1 制備本發明提供的試劑盒一，包含試劑1和試劑2,用于測定血液中肝素含量。
[0070] 具體為：試劑1活化因子X (FXa)的發色底物，其具體制備方法為：取4-Nz-D-Ar g-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 (S-2782)溶于濃度為 20mM 的 Tris 緩沖液，再加入鹽酸 調節pH值至7. 4 ;再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000,攪拌后制得試劑1，其終濃度分別為：4 -Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 0.5 mM，氯化鈉 0.15 M，聚乙二醇-8000 1%。
[0071] 試劑2為活化因子X (FXa)，其具體制備方法為：取活化因子X (FXa)溶于濃度 為20mM的Tris緩沖液，再加入鹽酸調節pH值至7. 4 ;再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000,攪 拌后制得試劑2,其終濃度分別為：活化因子X (FXa) 0.5 μ M，氯化鈉0.15 M，聚乙二 醇-8000 1%。
[0072] 肝素標準品的制備：將已知濃度的含有普通未分級肝素 （Unfractionated h印arin，UFH)的人血漿標準品稀釋成一定濃度的已知肝素濃度的標準液。重復上述操作， 配制多個不同濃度的已知肝素濃度的標準液分別為〇. 1 IU/ml，0. 4IU/ml，0. 7 IU/ml，1. 0 IU/ml〇
[0073] 標準曲線制作： (1)取200 μ L稀釋好的標準液與200 μ L試劑1混合均勻，并孵育2分鐘，孵育和反應 的溫度均為37 °C。
[0074] (2)然后加入200 μ L試劑2,混合均勻，在405nm波長測量吸光度5分鐘。
[0075] (3)根據肝素標準液梯度濃度與所對應吸光值，采用線性方程繪制標準曲線，請見 附圖1，其標準曲線公式為y=_l. 428X+1. 7473 (R2=0. 9859)。
[0076] 樣品檢測： 取3份200 μ L稀釋好的血漿與200 μ 1試劑1混合均勻，37°C孵育2分鐘，然后加 入200 μ 1試劑2,37° C反應在405 nm波長測量吸光度5分鐘。每份樣品重復測量兩次， 記錄試驗結果，計算信號強度，和標準曲線比對得到活化因子X(FXa)的活性和血液中肝素 含量；此時測得的為無需考慮樣品的內源抗凝血酶表達水平下的肝素含量。
[0077] 檢測所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見如下實驗。
[0078] 實施例2 本實施例與實施例1的差別僅在于實施例1所述標準品和樣品所含肝素為普通未分級 肝素 （Unfractionated heparin, UFH)，而本實施例中所述標準品和樣品所含肝素為低分 子量肝素（low-molecular-weight heparin, LMWH)。其他操作及配比與實施例1 一致。 [0079] 根據肝素標準液梯度濃度與所對應吸光值，采用線性方程繪制標準曲線，請見附 圖 2,其標準曲線公式為 y=-L 0344x+L 3977(R2=0. 9867)。
[0080] 檢測所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見如下實驗。
[0081] 實施例3 制備本發明提供的試劑盒三，包含試劑1、試劑2和試劑3,用于測定血液中肝素含量， 此時測得的為需要考慮樣品的內源抗凝血酶表達水平下的肝素含量。
[0082] 其中，試劑1和試劑2的制備以及標準曲線同實施例1。
[0083] 試劑3為抗凝血酶，其具體制備方法為：取抗凝血酶溶于濃度為20mM的Tris緩沖 液，再加入鹽酸調節pH值至7. 4。再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000,得到試劑3,其終濃度分 別為：抗凝血酶0. 2?0. 5U/mL，氯化鈉0. 1?0. 3M，聚乙二醇0. 5?1%。
[0084] 根據肝素標準液梯度濃度與所對應吸光值，采用線性方程繪制標準曲線，請見附 圖 3,其標準曲線公式為 y=-L 2914x+L 6414(R2=0. 9838)。
[0085] 樣品檢測： 取3份200 μ L稀釋好的血漿與200 μ L試劑3混合均勻，37° C孵育2分鐘，再加入 200 μ L試劑1，混合均勻孵育2分鐘，然后加入200 μ L試劑2, 37° C反應在405nm波長測量 吸光度5分鐘。每份樣品重復測量兩次，記錄試驗結果，計算信號強度，和標準曲線(實施例 1)比對得到活化因子X(FXa)的活性和血液中肝素含量。
[0086] 檢測所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見如下實驗。
[0087] 實施例4 本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發色底物為Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p -nitroanilide.HCl (S-2222)。其他制備方法及檢測操作與實施例1 一致。
[0088] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例1所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0089] 實施例5 本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發色底物為CH30-C0-D-CHA-Gly-Arg-p-n itroanilide. AcOH。其他制備方法及檢測操作與實施例1 一致。
[0090] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例1所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0091] 實施例6 本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發色底物為Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-ni troanilide. 2HC1 (S-2772)。其他制備方法及檢測操作與實施例1 一致。
[0092] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例1所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0093] 實施例7 本實施例與實施例1的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發色底物2mM，Tris緩沖液10mM，氯化鈉0. 3M，PEG-8000 1% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(FXa) 2 μ M，Tris緩沖液10mM，氯化鈉0. 3M， PEG-8000 1%。其他制備方法及檢測操作與實施例1 一致。
[0094] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例1所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0095] 實施例8 本實施例與實施例1的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發色底物lrnM，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 3M，PEG-8000 1% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(FXa) 1 μ M，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 3M， PEG-8000 1%。
[0096] 其他制備方法及檢測操作與實施例1 一致。
[0097] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例1所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0098] 實施例9 本實施例與實施例3的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發色底物〇.〇5mM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(FXa) 0. 05yM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5% ； 試劑3中各組分終濃度為：抗凝血酶0. 3U/mL，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5%〇
[0099] 其他制備方法及檢測操作與實施例3 -致。
[0100] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例3所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0101] 實施例10 本實施例與實施例3的差別在于： 試劑1中各組分終濃度為：發色底物O.lmM，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0. 5% ； 試劑2中各組分終濃度為：活化因子X(FXa) 0. 1 μ M，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5% ； 試劑3中各組分終濃度為：抗凝血酶0. 3U/mL，Tris緩沖液20mM，氯化鈉0. 1M， PEG-8000 0. 5%〇
[0102] 其他制備方法及檢測操作與實施例3 -致。
[0103] 該試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測結果與實施例3所得數據存在理論 誤差范圍的一致性。
[0104] 試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測 1.試劑盒特異性檢測 表1險測肝索測定+試劑盒特異性

【權利要求】
1. 一種FXa活性檢測試劑，包括試劑1和試劑2,其特征在于，試劑1為活化因子X (FXa)的發色底物，試劑2為活化因子X (FXa);其中活化因子X (FXa)的發色底物選自以 下底物中的任--種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA-Gly-Arg-p_nitroa nilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
2. -種FXa活性檢測試劑，包括試劑1、試劑2和試劑3 ;其特征在于，試劑1為活化因 子X (FXa)的發色底物，試劑2為活化因子X (FXa);試劑3為抗凝血酶；其中活化因子X (FXa)的發色底物選自以下底物中的任--種： Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide · HC1 ;CH3〇-C〇-D-CHA_Gly-Arg-p-nitro anilide · AcOH ;Acetyl-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide · 2HC1 ; 4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1〇
3. 根據權利要求1或2所述的FXa活性檢測試劑，其特征在于：所述發色底物的工作 濃度為〇. 05?2mM。
4. 根據權利要求1或2所述的FXa活性檢測試劑，其特征在于：FXa選自為人、牛、豬 FXa中的任--種。
5. 制備權利要求1所述的FXa活性檢測試劑的方法，其特征在于，包括分別制備試劑1 和試劑2 ;其中： 制備試劑1的方法為：將發色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調節pH值至疒8 ;再依 次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘； 制備試劑2的方法為：將FXa溶于緩沖劑；再加入鹽酸，調節pH值至疒8 ;再依次加入 無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
6. 制備權利要求2所述的FXa活性檢測試劑的方法，其特征在于，包括分別制備試劑 1、試劑2和試劑3 ;其中： 制備試劑1的方法為：將發色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調節pH值至7~8 ;再依 次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘； 制備試劑2的方法為：將FXa溶于緩沖劑；再加入鹽酸，調節pH值至7~8 ;再依次加入 無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘； 制備試劑3的方法為：將抗凝血酶溶于濃度為10-50mM的緩沖劑；再加入鹽酸，調節pH 值至疒8 ;再依次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。
7. 根據權利要求1~4任一所述的FXa活性檢測試劑的應用，其特征在于：將上述試劑 作為檢測試劑用于制備檢測肝素含量的檢測試劑。
8. 根據權利要求7所述的FXa活性檢測試劑的應用，其特征在于：所述FXa活性檢測 試劑用于制備肝素含量的檢測試劑盒，包括盒體和裝有FXa活性檢測試劑的試劑瓶，試劑 瓶放置于所述盒體內。
9. 根據權利要求8所述的FXa活性檢測試劑的應用，其特征在于：所述檢測試劑盒分 別包含試劑1或試劑2。
10. 根據權利要求8所述的FXa活性檢測試劑的應用，其特征在于：所述檢測試劑盒分 別包含試劑1、試劑2試劑3。
【文檔編號】G01N21/31GK104062243SQ201410159016
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】趙鐵銘 申請人:上海貞元診斷用品科技有限公司