一種測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種可大批量、快速測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，通過對田間采集到的介體昆蟲進行分類、解剖、固定、滲透、配制抗體標記液、抗體孵育、制片和觀察，統計攜帶病毒的昆蟲數，從而計算出介體昆蟲的帶毒率。本方法檢測成本低、耗時僅4小時、檢測結果直觀準確，靈敏度高，可用于大批量檢測田間介體昆蟲的帶毒率。
【專利說明】一種測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業病害檢測領域，具體涉及一種大批量、快速測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法。
【背景技術】
[0002]水稻是我國的第一大糧食作物，然而，近年來由水稻病毒引起的水稻病害在我國南方稻區大面積發生，已成為水稻生產上最嚴重的病毒病害，嚴重威脅到我國的糧食生產。
[0003]目前主要存在的水稻病毒有南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice blackstreaked dwarf virus, SRBSDV)、水稻黑條矮縮病毒(TPice black streaked dwarfvirus, RBSDV)、水稻矮縮病毒(TPice dwarf virus, RDV)、水稻齒葉矮縮病毒(/Pice raggedstunt virus, RRSV)、水稻瘤矮病毒(TPice gall dwarf virus, RGDV)和水稻條紋病毒(.Rice stripe virus, RSV),這些侵染水稻的病毒均由介體昆蟲如葉蝶和飛風以持久增殖型方式傳播。介體昆蟲在感染病毒的水稻病株上取食后，病毒通過介體昆蟲的口針進入消化道系統，并在昆蟲體內增殖擴散，最后擴散到唾液腺，在昆蟲取食時隨唾液傳到健康水稻。有的病毒還可以經卵傳播給子代昆蟲，子代昆蟲又可以繼續傳播病毒，危害水稻。
[0004]正是由于介體昆蟲的長距離或短距離遷飛特性，導致了水稻病毒在水稻種植區的擴散和大面積發生。然而目前還沒有防治病毒病的有效藥物，水稻一經感染病毒即無藥可治，因此對田間介體昆蟲的防治及帶毒情況監測至關重要。由于水稻生長季節，田間分布著大量的介體昆蟲，對不同地區不同時間段昆蟲帶毒率的檢測是一項繁重的任務，且需要能盡快獲得檢測結果，及時指導農業生產。已有的病毒檢測方法有兩大類，一類是基于PCR技術的RT-PCR和熒光定量PCR技術；另一類是基于蛋白免疫反應的ELISA檢測技術和斑點雜交檢測技術。這些技術雖然都可用于田間介體昆蟲帶毒情況的檢測，但均存在著一些不足，如檢測成本高，技術要求高，檢測耗時，不適合大批量樣品檢測等。因此在田間介體昆蟲帶毒率檢測方面急需建立一種可大批量測定且直觀快速的檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種檢測技術，可用于介體昆蟲帶毒率的大批量、快速檢測。本發明可降低檢測成本、縮短檢測時間、提高檢測靈敏度，可對田間采集到的大批量介體昆蟲的帶毒率進行檢測。
[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，是通過對田間采集到的介體昆蟲進行分類、解剖、固定、滲透、配制抗體標記液、抗體孵育、制片和觀察，統計攜帶病毒的昆蟲數，從而計算出介體昆蟲的帶毒率。
[0007]具體方法包括以下步驟:
O昆蟲分類:將田間收集到的介體昆蟲按不同類別分類；
2)解剖:將活體昆蟲裝入玻璃試管，放在冰上使昆蟲低溫麻醉，麻醉后將昆蟲取出，放在體視鏡下用解剖鑷解剖出昆蟲的消化道器官；
3)固定:將獲得的昆蟲消化道器官放入裝有200μI固定液的0.5 ml離心管中，靜置60-90 min ；
4)滲透:固定后的消化道器官于pH值為7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗兩次，再放入200 μ I滲透液中處理10-30 min ；
5)配制抗體標記液:將熒光抗體與抗體稀釋液按1:100混合于0.5 ml離心管中制得抗體標記液,并用錫箔紙包裹避光；每100頭介體昆蟲需50 μ I抗體標記液；
6)抗體孵育:用pH值為7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官兩次，將清洗后的消化道器官放入熒光抗體標記液中，于37°C恒溫孵育45-60 min ；
7)制片:孵育結束后，再次用pH值為7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官兩次；向潔凈的載玻片上加入一滴抗衰減液，將清洗后的消化道器官擺放在抗衰減液中，蓋上蓋玻片；
8)觀察:在熒光顯微鏡下觀察并統計攜帶病毒的昆蟲數，計算出介體昆蟲帶毒率。
[0008]步驟2)中解剖得到的消化道器官包括前憩室、食道、中腸和后腸。
[0009]步驟3)所述固定液為含質量分數為4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS緩沖液。
[0010]步驟4)所述滲透液是將0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液，充分攪拌混勻制得。
[0011]步驟5)中的熒光抗體是將不同病毒的抗體分別與不同激發光波長的熒光素交聯制得；
所述抗體稀釋液為含質量分數為3% BSA的0.01 mol/L PBS緩沖液；
每組抗體標記液中含有I種或I種以上不同病毒的抗體，根據不同的熒光信號能同時鑒定介體昆蟲體內所攜帶的不同病毒。
[0012]步驟7)中的抗衰堿液是將甘油與0.01mol/L PBS緩沖液按體積比9:1混合后充分攪拌制得。
[0013]本發明的顯著優點在于:
1)耗時短:采用本發明的檢測方法對介體昆蟲帶毒率進行測定，從介體昆蟲解剖到熒光顯微鏡觀察結果，約需4 h，大大縮短了檢測時間；
2)成本低:所用試劑除熒光素外均為實驗室常規試劑，且用量極少，每個抗體的制作成本約5000元，所制備的抗體約5 ml，而每100頭介體昆蟲的檢測只需使用I μ I抗體，因此制備一次抗體可檢測50萬頭介體昆蟲樣品，針對每個樣品進行檢測的試劑成本不足0.2元;
3)可大批量檢測:解剖50頭介體昆蟲約需30min，每個技術人員每小時可解剖約100頭介體昆蟲，檢測過程中大多數時間用于樣品的靜置孵育，因此可同時進行2-3批樣品的檢測，因此每個技術人員一個工作日可檢測300頭以上介體昆蟲的樣品；
4)結果直觀準確:介體昆蟲消化道經熒光抗體標記后，在熒光顯微鏡下可直觀地觀察到病毒在消化道內的分布，即使昆蟲帶毒后兩天也可檢測到熒光信號。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例中白背飛虱若蟲的解剖過程。[0015]圖2為本發明實施例中白背飛虱成蟲的解剖過程。
[0016]圖3為本發明實施例中白背飛虱的消化道示意圖。
[0017]圖4為以免疫熒光標記技術標記的南方水稻黑條矮縮病毒在介體昆蟲中腸內的定位，其中，圖A為綠色熒光標記的SRBSDV-P9-1蛋白；圖B為紅色熒光標記的SRBSDV-P7-1蛋白。
【具體實施方式】
[0018]1.試劑配制
1)0.01mol/L PBS:稱取 8 g NaCl、0.2 g KCl ,1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4,溶于800 ml蒸懼水中，用HCl調節pH值至7.2,再加蒸懼水定容至IL即可。
[0019]2)固定液:稱取4 g多聚甲醛溶于100 ml 0.01 mol/L PBS緩沖液中，50°C _60°C加熱攪拌溶解，貯存于4°C。
[0020]3)滲透液:吸取 0.2 mL 的 TritonX-1OO 溶液加入到 10 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液，充分攪拌溶解即可，貯存于4°C。
[0021]4)抗體稀釋液:稱量0.3g BSA置于15 ml離心管中，加入IOmL的0.01 mol/L PBS緩沖液，充分攪拌溶解，貯存于4°C。
[0022]5)抗衰減液:量取90 ml甘油與IOmL的0.01 mol/L PBS緩沖液混合，充分攪拌，
貯存于4°C。
[0023]6)熒光抗體:針對南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)，首先將病毒編碼特定蛋白(如SRBSDV-P7-1蛋白和SRBSDV-P9-1蛋白)的多克隆抗體或單克隆抗體的IgG分別于
0.1 mol/L的碳酸氫鈉溶液中透析8h ;然后將透析后的IgG分別收集到離心管中，每100μ I SRBSDV-P7-1蛋白的IgG加入50 μ I溶于DMF的rhodamine進行標記，每100 μ ISRBSDV-P9-1蛋白的IgG加入50 μ I溶于DMF的熒光素FITC進行標記；分別室溫震蕩孵育lh，然后用0.01 mol/L PBS緩沖液透析除去游離的熒光素，再將兩種標記過的病毒抗體按體積比1:1混合制得熒光抗體，將熒光抗體分裝并保存于_20°C。
[0024]2.實驗方法
2.1昆蟲分類:先將田間收集到的介體昆蟲按不同類別分類，取50頭白背飛虱進行實
驗;
2.2解剖:
1)若蟲的解剖:將白背飛虱若蟲裝入20mm直徑的玻璃試管中，冰上冰凍5min，凍暈的若蟲放在體視鏡的載物臺上(如圖1 A);雙手各取一把鑷子，分別夾住昆蟲的頭和胸，然后緩緩向兩邊拉，當頭與胸部分離后停止，此時消化道連接著頭和胸部(如圖1 B);用一把鑷子夾住昆蟲尾部輕輕擠壓，使昆蟲體內物質從胸部斷裂處擠出，另一把鑷子夾住頭向一邊緩慢拉，消化道與頭部連接被拉出，即解剖得到若蟲的消化道器官(如圖1 C)；
2)成蟲的解剖:將白背飛虱成蟲裝入20mm直徑的玻璃試管中，冰上冰凍5min，凍暈的成蟲放在體視鏡的載物臺上(如圖2 A);雙手各取一把鑷子，分別夾住昆蟲的頭和胸，然后快速向兩邊拉，使頭與胸部斷裂而分離(如圖2 B);再用鑷子將胸部和腹部分開，此時昆蟲的消化道主要在腹部(如圖2 C);用一把鑷子夾住昆蟲的尾部末端，另一把鑷子輕輕夾住腹部，然后同時緩慢向兩邊拉，昆蟲的消化道連同尾部被拉出，即解剖得到成蟲的消化道器官(如圖2 D)；
解剖所得消化道器官包括前憩室、食道、中腸和后腸(如圖3)；
2.3固定:將獲得的介體昆蟲消化道器官放入裝有200 μ I固定液的0.5 ml離心管中，靜置90 min ；
2.4滲透:固定后的消化道器官于pH值為7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗兩次，再放入200 μ I滲透液中處理30 min ；
2.5配制抗體標記液:將熒光抗體與抗體稀釋液按1:100混合于0.5 ml離心管中制得抗體標記液,并用錫箔紙包裹避光；每100頭介體昆蟲需50 μ I抗體標記液；
2.6抗體孵育:用pH值為7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官兩次，將清洗后的消化道器官放入熒光抗體標記液中，于37°C恒溫孵育60 min ；
2.7制片:孵育結束后，再次用pH值為7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官兩次；向潔凈的載玻片上加入一滴抗衰減液，將清洗后的消化道器官擺放在抗衰減液中，蓋上蓋玻片；
2.8觀察:在熒光顯微鏡下觀察并統計攜帶病毒的昆蟲數，計算出介體昆蟲帶毒率。
[0025]2.9計算方法:介體昆蟲帶毒率的計算公式如下:
帶毒率(％)=(帶毒蟲數/總檢測蟲數)X 100。
[0026]3.實驗結果
本實施例通過對50頭白背飛虱的帶毒率進行檢測，結果表明其中12頭白背飛虱的消化道器官中可檢測到熒光信號，帶毒率為24% ;如圖4所示，圖A顯示綠色熒光的部分表明存在SRBSDV-P9-1蛋白，圖B顯示紅色熒光的部分表明存在SRBSDV-P7-1蛋白，因此根據熒光信號還可確定病毒蛋白在中腸的分布。
[0027]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:通過對田間采集到的介體昆蟲進行分類、解剖、固定、滲透、配制抗體標記液、抗體孵育、制片和觀察，統計攜帶病毒的昆蟲數，從而計算出介體昆蟲的帶毒率。
2.根據權利要求1所述的測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:具體方法包括以下步驟: O昆蟲分類:將田間收集到的介體昆蟲按不同類別分類； 2)解剖:將活體昆蟲裝入玻璃試管，放在冰上使昆蟲低溫麻醉，麻醉后將昆蟲取出，放在體視鏡下用解剖鑷解剖出昆蟲的消化道器官； 3)固定:將獲得的昆蟲消化道器官放入裝有200μ I固定液的0.5 ml離心管中，靜置60-90 min ； 4)滲透:固定后的消化道器官于pH值為7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗兩次，再放入200 μ I滲透液中處理10-30 min ； 5)配制抗體標記液:將熒光抗體與抗體稀釋液按1:100混合于0.5 ml離心管中制得抗體標記液,并用錫箔紙包裹避光；每100頭介體昆蟲需50 μ I抗體標記液； 6)抗體孵育:用pH值為7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官兩次，將清洗后的消化道器官放入熒光抗體標記液中，于37°C恒溫孵育45-60 min ； 7)制片:孵育結束后，再次用PH值為7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官兩次；向潔凈的載玻片上加入一滴抗衰減液，將清洗后的消化道器官擺放在抗衰減液中，蓋上蓋玻片； 8)觀察:在熒光顯微鏡下觀察并統計攜帶病毒的昆蟲數，計算出介體昆蟲帶毒率。
3.根據權利要求2所述的測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:步驟2)中解剖得到的消化道器官包括前憩室、食道、中腸和后腸。
4.根據權利要求2所述的測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:步驟3)所述固定液為含質量分數為4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS緩沖液。
5.根據權利要求2所述的測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:步驟4)所述滲透液是將0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液，充分攪拌混勻制得。
6.根據權利要求2所述的測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:步驟5)中的熒光抗體是將不同病毒的抗體分別與不同激發光波長的熒光素交聯制得； 所述抗體稀釋液為含質量分數為3% BSA的0.01 mol/L PBS緩沖液； 每組抗體標記液中含有I種或I種以上不同病毒的抗體，根據不同的熒光信號能同時鑒定介體昆蟲體內所攜帶的不同病毒。
7.根據權利要求2所述的測定介體昆蟲帶毒率的免疫熒光檢測方法，其特征在于:步驟7)中的抗衰堿液是將甘油與0.01mol/L PBS緩沖液按體積比9:1混合后充分攪拌制得。
【文檔編號】G01N33/569GK103941010SQ201410157757
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】賈東升, 魏太云, 陳紅燕, 吳維, 陳倩, 毛倩卓 申請人:福建農林大學