一種單細胞水平快速鑒定微藻的方法
【專利摘要】本發明涉及微藻鑒定領域，具體是一種基于單細胞拉曼光譜的在單細胞水平快速鑒定微藻的方法。采集微藻細胞的單細胞拉曼光譜，建立微藻單細胞拉曼光譜數據庫，根據未知微藻的單細胞拉曼光譜與建立的微藻單細胞拉曼光譜數據庫進行比對進而在單細胞水平實現微藻鑒定或突變體篩選。本發明利用單細胞拉曼光譜技術鑒定微藻，提供了一種簡單、快速、非侵入的在單細胞水平鑒定微藻的方法，為微藻鑒定和突變體篩選提供了一種高效的判別方法。
【專利說明】一種單細胞水平快速鑒定微藻的方法【技術領域】
[0001]本發明涉及微藻鑒定領域，具體是一種基于單細胞拉曼光譜的在單細胞水平快速鑒定微藻的方法。
【背景技術】
[0002]微藻為一類光合自養微生物，能夠利用光能和CO2合成蛋白質、糖類、脂質、色素等物質并放出02 ;微藻種類多、數量大、繁殖快，是生態系統中的初級生產者，是生態系統物質和能量循環的重要組成部分；同時微藻在食品、保健、醫藥、環保和新型生物燃料煉制領域具有廣闊的應用前景。例如，小球藻、柵列藻、新月藻、螺旋藻等蛋白質含量高，已被用作蛋白質來源；小球藻、螺旋藻、杜氏鹽藻、雨生紅球藻等含豐富的不飽和脂肪酸(DHA、EPA),微藻多糖及多種具生理活性蛋白和分子，已被用作功能食品和醫藥工業；小球藻、微擬球藻等淀粉、脂質含量高，被公認為是最有潛力的新型生物燃料的原料供應者。
[0003]微藻的分類鑒定是研究微藻的基礎，微藻傳統分類鑒定方法分為形態學鑒定法、生化鑒定法和分子生物學鑒定法。每種方法各有優缺點，形態學鑒定法主要根據藻細胞外部形態和結構來確定其歸屬，是最傳統和直接的分類鑒定方法。形態學鑒定法存在許多制約因素，第一，需要具有豐富經驗的專業人員，且費時費力；第二，微藻在不同生長階段或條件下，其形態結構會發生變化；第三，大多微藻的鑒定需要經過擴大培養，增大了鑒定的難度。生化鑒定法是根據細胞內以糖類、脂質、蛋白質和核酸等生物大分子的組成來對微藻分類鑒定的方法。生化鑒定法需要定量或定性分析細胞中的微藻“特征化學成分”，因此需要昂貴的化學物質分離提取和分析儀器；需要經過擴大培養，以提取相當量的生物大分子；生化特性只是對傳統分類方法的一個補充，不是一個完整的分類體系。分子生物學分類是通過比較真核生物核糖體rDNA序列的同源性確定其分類地位。分子生物學鑒定方法由于操作容易、結果可靠，廣泛應用于微藻的分類鑒定，但其仍是基于對純種微藻群體的分析，無法鑒定復雜微藻生物群落 中的微藻。
[0004]單細胞拉曼光譜技術(Single-Cell Raman Spectroscopy, SCRS)是將光學囚禁技術與顯微拉曼光譜技術相結合用于檢測細胞的一項新技術。拉曼光譜在細菌種類鑒定上有少許報道，Susan等應用拉曼光譜鑒定牛奶中的布魯氏菌,準確率達到94% ；Sandra等應用拉曼光譜鑒定了引起尿道感染的微生物，在種水平上，其準確率為92%。應用單細胞拉曼光譜技術鑒定微藻還未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種單細胞水平快速鑒定微藻的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0007]—種單細胞水平快速鑒定微藻的方法，采集微藻細胞的單細胞拉曼光譜，建立微藻單細胞拉曼光譜數據庫，根據未知微藻的單細胞拉曼光譜與建立的微藻單細胞拉曼光譜數據庫進行比對進而在單細胞水平實現微藻鑒定或突變體篩選。[0008]進一步的說，將不同種類的微藻在不同條件下培養至不同的生長時期，利用拉曼光鉗捕獲不同種類不同條件下不同生長時期的微藻單細胞，同時瞬間淬滅細胞內的色素，采集細胞的拉曼光譜，進而獲得不同種類微藻中每一種微藻所對應的一組拉曼光譜數據，構建微藻的拉曼光譜數據庫；將未知待測藻株或突變體的拉曼光譜與相應的微藻拉曼光譜數據庫中的拉曼光譜進行比對進而在單細胞水平實現微藻鑒定或突變體篩選。
[0009]再進一步的說，
[0010]I)將不同種類的微藻細胞在不同培養條件下培養至不同的生長時期；
[0011]2)用ddH20洗凈細胞，重懸，吸入毛細管中；
[0012]3 )在顯微視野下用拉曼光鉗捕獲不同種類微藻不同生長時期的微藻細胞，采集細胞的拉曼光譜；并測定細胞周圍背景的拉曼信號；
[0013]4)數據處理。
[0014]所述步驟中激發光源波長為532nm，功率為100mW，拉曼光譜采集時間為2秒。
[0015]所述步驟中數據處理包括扣除背景值、基線校準、歸一化處理等，多維數據分析方法為主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)、線性判別式分析(LinearDiscriminant Analysis, LDA)、支持向量機(Support Vector Machine, SVM)分析等。
[0016]同時可以在單細胞水平上實現微藻鑒定和突變體篩選；微藻可為四月藻、筒柱藻、微擬球藻、杜氏鹽藻、三角褐指藻、金藻，也可為四株萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突變體 CC124, CC4324, CC4333 和 CC4334。
[0017]本發明所具有的優點:
[0018]本發明利用單細胞拉曼光譜技術的簡單、快速、非侵入的在單細胞水平鑒定微藻。與傳統細胞鑒定技術相比，單細胞拉曼光譜技術具有以下優勢:(1)細胞是生命活動的基本單位，單細胞拉曼光譜從單細胞層面鑒定細胞的種類，樣本需求量小，不需要對細胞進行培養以獲得大量的生物質，避免群體分析引入的誤差；(2)無需添加化學染料及其他標記，不侵入細胞，對細胞不產生或產生較少的損傷，因此對鑒定的細胞可以分離并再培養；(3)簡單快速，不需要復雜的分析步驟，每個細胞拉曼光譜采集時間僅為2秒；(4)拉曼光譜反應了整個細胞中的化學物質指紋圖譜，如核酸、蛋白質、脂質和糖類等，可用于監測細胞的代謝過程。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明實施例提供的四株萊茵衣藻突變體不同培養條件、不同生長時期的平均拉曼光譜。
[0020]圖2為本發明實施例提供的四株萊茵衣藻突變體基于單細胞拉曼光譜的PC-LDAscore值圖。
【具體實施方式】
[0021]以下的實施例可以使本專業【技術領域】的技術人員更全面的了解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0022]本發明將不同種類的微藻在不同條件下培養(按照常規技術以適合各自微藻的培養條件進行培養)至不同的生長時期，利用拉曼光鉗捕獲不同種類不同條件下不同生長時期的微藻單細胞，同時瞬間淬滅細胞內的色素，采集細胞的拉曼光譜，進而獲得不同種類微藻中每一種微藻所對應的一組拉曼光譜數據，構建微藻的拉曼光譜數據庫；將未知待測藻株或突變體的拉曼光譜與相應的微藻拉曼光譜數據庫中的拉曼光譜進行比對進而在單細胞水平實現微藻鑒定或突變體篩選。
[0023]實施例
[0024]I)四株萊茵衣藻(Chlamydonomas reinhardtii)突變體 CC124、CC4324、CC4333 和CC4334購自 Chlamydomonas Resource Center:http://chlamycollection.0rg/strains/。
[0025]2)萊茵衣藻分別接種到有氮或缺氮的TAP (Tris acetate phosphate)液體培養基中(3個生物學重復)，150 μ mol photons IrTiV1光照，25°C,通氣攪拌培養。培養至Oh、12h、24h、48h、72h和96h時取樣。其中，有氮或缺氮的TAP液體培養基，TAP(Tris acetatephosphate)培1 養基:
[0026]NH4Cl (7.48mM)，MgSO4 (406 μ Μ)，CaCl2 (340 μ Μ)，K2HPO4 (540 μ Μ)，KH2PO4 (463 μ Μ)，20mM Tris, 17.4mM acetate, H3BO3 (184 μ Μ)，ZnSO4 (76.5 μ Μ)，MnCl2 (25.5 μ Μ)，FeSO4 (17.9μ Μ)，CoCl2 (6.77 μ Μ)，(ΝΗ4) 6Μο7024 (0.88 μ Μ)，CuSO4 (6.29 μ Μ)，and Na2EDTA (148 μ Μ)
[0027]3)取步驟2)不同培養時間的藻液，每個樣本取ImL藻液，用ddH20洗滌三次；將藻液吸到扁平毛細管中(50mm IengthXlmm widthX0.1mm height, Camlab, UK)。
[0028]4)用單細胞拉曼分選儀(Raman-Activated Cell Sorter, RACS, Wellsens Inc,China)捕捉單細胞并采集拉曼光譜，激光參數為100mW、532nm，拉曼采集時間為2秒，每個樣本采集20個細胞及4個背景值。
[0029]5)用Labspec5 (HORIBA Scientific)進行背景扣除、基線校準、歸一化處理和求平均值等操作。如圖1所示，為四株萊茵衣藻突變體CC124、CC4324、CC4333和CC4334在有氮(Group N+)或缺氮(Group N-)培養條件下培養至Oh、12h、24h、48h、72h和96h的平均拉曼圖譜，每條圖譜為60個細胞的平均值，范圍為450-1800CHT1和2600-3100011'
[0030]6)對450-1800CHT1和2600-3100(^1范圍的單細胞拉曼光譜進行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA),多個變量通過線性變換以選出較少個數的重要變量。選取8個變量(變量解釋率為94.66%)，進行線性判別式分析(Linear DiscriminantAnalysis, LDA)。圖 2 為四株萊茵衣藻突變體 CC124、CC4324、CC4333 和 CC4334 經過PC-LDA分析后得到的Scores值圖，每個點代表1個細胞；圖2可知四株藻株差異明顯，因此通過細胞的拉曼光譜可以區分不同的藻株。
[0031]7)四株萊茵衣藻突變體CC124、CC4324、CC4333和CC4334在有氮(Group N+)或缺氮(Group N-)培養條件下(3個生物學重復)，培養至12h、24h、48h、72h和96h，每個樣本隨機采集20個細胞的拉曼光譜，共獲得2400個細胞的拉曼光譜；每個樣本中隨機抽取15個細胞作為訓練組，建立微藻的拉曼光譜數據庫，共1800個細胞建立支持向量機(SupportVector Machine, SVM)模型；每個樣本剩余5個細胞作為測試組，共600個細胞，用已建立的模型預測測試組細胞的藻株種類；共進行了 10次隨機分組，每個模型10倍交叉檢驗。表I為鑒定四株藻株的準確性的靈敏度和特異性；鑒定四株萊茵衣藻突變體藻株的總準確率為 97.93%。
[0032]表1為本發明實施例提供的四株萊茵衣藻突變體基于單細胞拉曼光譜的SVM (支持向量機分析)模型的預測結果
【權利要求】
1.一種單細胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于:采集微藻細胞的單細胞拉曼光譜，建立微藻單細胞拉曼光譜數據庫，根據未知微藻的單細胞拉曼光譜與建立的微藻單細胞拉曼光譜數據庫進行比對進而在單細胞水平實現微藻鑒定或突變體篩選。
2.按權利要求1所述的單細胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于: 將不同種類的微藻在不同條件下培養至不同的生長時期，利用拉曼光鉗捕獲不同種類不同條件下不同生長時期的微藻單細胞，同時瞬間淬滅細胞內的色素，采集細胞的拉曼光譜，進而獲得不同種類微藻中每一種微藻所對應的一組拉曼光譜數據，構建微藻的拉曼光譜數據庫；將未知待測藻株或突變體的拉曼光譜與相應的微藻拉曼光譜數據庫中的拉曼光譜進行比對進而在單細胞水平實現微藻鑒定或突變體篩選。
3.按權利要求1或2所述的單細胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于: 1)將不同種類的微藻細胞在不同培養條件下培養至不同的生長時期； 2)用ddH20洗凈細胞，重懸，吸入毛細管中； 3)在顯微視野下用拉曼光鉗捕獲不同種類微藻不同生長時期的微藻細胞，采集細胞的拉曼光譜；并測定細胞周圍背景的拉曼信號； 4)數據處理。
4.按權利要求3所述的單細胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于:所述步驟中激發光源波長為532nm，功率為lOOmW，拉曼光譜采集時間為2秒。
【文檔編號】G01N21/65GK103940801SQ201410157736
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】徐健, 何曰輝, 籍月彤, 王婷婷, 王允, 黃巍 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所